Меню Рубрики

Результаты исследования крови на бруцеллез

Весь контент iLive проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.

У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.

Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.

В норме антитела к возбудителю бруцеллёза в крови отсутствуют. Диагностический титр при реакции агглютинации — 1:160 и выше.

Возбудители бруцеллёза — бруцеллы, мелкие неподвижные грамотрицательные бактерии. При постановке диагноза бруцеллёза полученные клинико-эпидемиологические данные необходимо подтверждать лабораторно. С этой целью используют бактериологический и серологический методы исследования. При остром бруцеллёзе положительный результат исследования гемокультуры получают в 10-30% случаев (в 62-90%, если возбудитель — Brucella melitensis, в 5-15%, если — Brucella abortus). Культура ликвора бывает положительной у 45% пациентов с менингитом. При посевах крови, костного мозга, мочи культуру бруцелл можно получить через 5-10 сут, а в части случаев — через 20-30 сут. В связи с этим для диагностики бруцеллёза широкое распространение получили серологические методы.

Самым надёжным серологическим тестом определения антител к возбудителю бруцеллёза в сыворотке крои служит стандартный тест пробирочной агглютинации (реакция Райта), с помощью него определяют содержание антител, реагирующих главным образом с липополисахаридными антигенами бруцелл. Увеличение титров антител в 4 раза и более в пробах сыворотки крови, полученных с интервалом 1-4 нед, позволяет идентифицировать этиологический фактор заболевания. У большинства больных титры специфических антител повышаются на 3-5-й день от начала заболевания. Достоверным считают титр антител не менее 1:160 с последующим его нарастанием. Повышенный титр антител выявляют у 97% больных в первые 3 нед заболевания. Наиболее высокий титр антител отмечают обычно через 1-2 мес от начала заболевания, в дальнейшем он начинает быстро снижаться. Стандартный тест пробирочной агглютинации выявляет антитела к B. abortus, B. suis, B. melitensis, но не к B. canis. Повышенный титр антител может сохраняться у 5-7% пациентов в течение 2 лет после перенесённой инфекции. Поэтому реакцию Райта нельзя использовать для дифференциальной диагностики бруцеллёза с другими инфекционными заболеваниями при наличии в анамнезе бруцеллёза в течение 2 последних лет. Причиной ложноположительных результатов могут быть проведение кожной пробы на бруцеллёз, вакцинация против холеры, а также инфекции, вызванные холерным вибрионом, иерсиниями, Francisella tularensis. В части случаев возможны ложноотрицательные результаты реакции агглютинации у больных бруцеллёзом, что объясняется эффектом прозоны, или так называемым блокированием антител. При хронических локализованных формах бруцеллёза титры могут быть отрицательными или ниже 1:160. На фоне проводимого лечения титры антител класса IgG быстро снижаются и в течение года приближаются к нулю. При рецидивах уровень антител IgG снова повышается. Наличие однократного повышения титра антител IgG более 1:160 — надёжное объективное указание на текущую или недавно перенесённую инфекцию. После лечения и выписки больного из стационара рекомендуют проведение серологических исследований в течение первого года через 1, 2, 3, 6, 9 и 12 мес, а в течение второго года — ежеквартально.

РПГА более чувствительна и специфична для обнаружения бруцеллёзных антител в сыворотке крови. Нередко гемагглютинины выявляют в тех случаях, когда реакция агглютинации даёт отрицательный или сомнительный результат.

РСК позволяет выявлять комплементсвязывающие антитела к бруцеллам, появляющиеся в крови позже агглютининов. Максимальные титры антител в РСК регистрируют к 4-му месяцу заболевания, в дальнейшем их титр снижается, но в небольшом количестве их обнаруживают в течение 1 года. Существенных преимуществ РСК по сравнению с реакцией агглютинации не имеет.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

источник

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Возбудителями бруцеллеза являются бактерии из рода Бруцелла (Brucella), основным местом обитания которых являются домашние и дикие животные. У животных данные микроорганизмы не вызывают явной клинической картины заболевания, однако могут приводить к массовым абортам и другим патологиям. Науке известно 6 видов бруцелл, однако патологию у человека могут вызывать 4 из них.

Опасными для человека являются:

  • B. melitensis – основными хозяевами являются овцы, козы и другой мелкий рогатый скот.
  • B. abortus – развивается преимущественно у крупного рогатого скота.
  • B. suis – характерна для свиней и диких животных (зайцев, оленей).
  • B. canis – основным резервуаром являются собаки.

Все виды бруцелл характеризуются высокой инвазивной способностью, то есть могут легко проникать в организм человека через слизистые оболочки или поврежденные кожные покровы. Хотя бруцеллы и считаются внутриклеточными паразитами (развиваются внутри клеток организма-хозяина), они могут длительное время находиться вне клеток. Также они являются достаточно устойчивыми во внешней среде, однако могут быть уничтожены при воздействии различных химических и физических факторов.

Бруцеллы могут выживать:

  • В воде – до 2 месяцев.
  • В сыром мясе – до 3 месяцев.
  • В шерсти животных – до 4 месяцев.
  • При температуре 60 градусов – до 30 минут.

При кипячении данные микроорганизмы погибают практически моментально, так же как при воздействии различных дезинфицирующих растворов (0,2 – 1% раствора хлорной извести, хлорамина и так далее).

Больные бруцеллезом люди друг для друга не заразны, то есть заразиться данной инфекцией человек может только от животного.

От животного к человеку бруцеллез может передаваться:

  • Фекально-оральным (пищевым) путем. Это основной путь инфицирования, при котором бактерии проникают в организм человека через слизистые оболочки пищеварительной системы (при контакте человека с мочой или калом зараженных животных и несоблюдении правил личной гигиены). Также человек может заразиться при употреблении в пищу молока, сыра, брынзы, плохо обработанного (термически) мяса и других продуктов животного происхождения.
  • Контактно-бытовым путем. Характеризуется проникновением бактерий в человеческий организм через поврежденные кожные покровы или слизистые оболочки. Больные животные обсеменяют (заражают) бактериями практически всю окружающую их обстановку – подстилки, воду, землю. Вот почему работающему с животными человеку заразиться бруцеллезом довольно просто (например, при уборке загонов для животных и несоблюдении правил личной гигиены, при работе с овечьей шерстью и так далее).
  • Аэрогенным путем. В данном случае человек вдыхает микрочастицы пыли или шерсти, на которых располагаются бруцеллы. Данные микрочастицы задерживаются на слизистой оболочке верхних дыхательных путей, откуда возбудитель и проникает в организм.

Стоит отметить, что бруцеллез распространен практически повсеместно. Тем не менее, в группу риска входят люди, занятые животноводством (пастухи, доярки), а также работники мясокомбинатов. Иммунитет после перенесенной инфекции сохраняется в течение 6 – 12 месяцев, после чего возможно повторное инфицирование.

Как говорилось ранее, бруцеллы проникают в организм человека через слизистые оболочки либо через поврежденные кожные покровы (при этом повреждения не обязательно должны быть массивными и заметными, иногда достаточно микротрещин, имеющихся на руках практически любого работника сельского хозяйства). Важно отметить, что в месте внедрения бруцелл не остается никаких видимых следов или патологических изменений, поэтому определить точное время инфицирования бывает довольно сложно.

После проникновения в организм человека бруцеллы проходят через несколько последовательных стадий развития, что и обуславливает клинические проявления заболевания.

В развитии бруцеллеза выделяют несколько фаз, а именно:

  • Лимфогенную фазу. Сразу после попадания в ткани организма бруцеллы проникают в лимфатическую систему и с током лимфы заносятся в регионарные лимфатические узлы. Лимфоузлы представляют собой своеобразные фильтры, состоящие из большого количества лимфоцитов (клеток иммунной системы). Данные фильтры задерживают все патогенные микроорганизмы и другие чужеродные частицы, проникающие в них из тканей. Проникшие в организм бруцеллы также задерживаются в лимфоузлах и взаимодействуют с лимфоцитами, стимулируя их усиленное деление.
  • Фазу первичной латенции. В этой фазе происходит размножение бруцелл в лимфатических узлах, а также активация иммунитета и усиленное деление лимфоцитов в ответ на проникновение чужеродных агентов (то есть организм начинает бороться с инфекцией). Первые две фазы бруцеллеза соответствуют латентному (скрытому) течению заболевания, когда никаких клинических проявлений не наблюдается.
  • Фазу гематогенного заноса. На данном этапе бактерии прорывают лимфатический барьер и поступают в кровь. Выделение ими токсических веществ, а также активация иммунной системы обуславливают развитие клинических проявлений острого бруцеллеза.
  • Фазу поражения различных органов и систем. С током крови бактерии разносятся по многим органам и тканям, где поглощаются особыми клетками иммунной системы (макрофагами), целью которых является уничтожить (переварить с помощью различных ферментов) чужеродные агенты. Однако макрофаги не могут полностью «переварить» бруцеллы, которые продолжают развиваться внутри них. В результате этого в различных тканях и органах образуются так называемые гранулемы, состоящие из поглотивших бруцеллы макрофагов и окружающих их клеток иммунной системы. Со временем макрофаг погибает, а возбудитель инфекции высвобождается в окружающие ткани и вновь поступает в кровоток, что обуславливает повторные случаи обострения заболевания.
  • Фазу реактивно-аллергических изменений. В результате длительного присутствия патогенных агентов в организме происходит патологическая перестройка иммунной системы. Иммунные реакции становятся более выраженными, что само по себе начинает оказывать повреждающее действие на различные ткани и органы.

Симптомы бруцеллеза во многом зависят от стадии его развития, от состояния иммунной системы больного, а также от первоначально попавшей в организм дозы возбудителя (чем она выше, тем быстрее и возникнут и тем выраженнее будут клинические проявления заболевания). Также стоит отметить, что большинство тяжелых форм бруцеллеза обусловлено B. melitensis, которой человек может заразиться от мелкого рогатого скота.

Клиническими проявлениями бруцеллеза могут быть:

  • повышение температуры тела;
  • увеличение лимфатических узлов;
  • поражения костей;
  • поражения суставов;
  • поражения легких;
  • поражения сердечно-сосудистой системы;
  • поражения нервной системы;
  • поражения половой системы;
  • поражения глаз.

Скорость развития и выраженность лихорадки при бруцеллезе определяется видом возбудителя, а также его первоначальной дозой. В большинстве случаев в течение нескольких дней после инфицирования у больных может отмечаться незначительный субфебрилитет (повышение температуры тела до 37 – 37,5 градусов), сопровождающийся другими неспецифическими признаками инфекции (общей слабостью, повышенной утомляемостью, головными болями и мышечными болями, болями в суставах, ломотой во всем теле и так далее). Данные симптомы прогрессируют в течение нескольких дней (пока бруцеллы размножаются в лимфатических узлах), после чего температура тела может подниматься до 38 – 39 градусов, что обычно сопровождается ознобом, проливным потом и ухудшением общего самочувствия.

Лихорадка при бруцеллезе характеризуется волнообразным течением, то есть продолжается в течение нескольких дней, после чего на некоторое время стихает, а затем вновь возобновляется (периоды обострения в данном случае связаны с разрушением макрофагов и поступлением большого количества бруцелл в кровоток).

В течение инкубационного периода патологических изменений в лимфатических узлах и лимфатических сосудах обычно не наблюдается. Генерализованное (повсеместное) увеличение периферических лимфатических узлов может отмечаться на ранних стадиях заболевания, что обусловлено проникновением бактерий в кровь и разносом их по всему организму. Лимфоузлы при этом увеличиваются до 5 – 7 мм в диаметре, становятся плотными и слегка болезненными при пальпации (прощупывании). Кожа над ними обычно не изменена. Особенно четко патологические изменения могут определяться в шейных, подмышечных и паховых группах лимфатических узлов.

Также стоит отметить, что у большинства пациентов при бруцеллезе отмечается увеличение печени и селезенки, что обусловлено проникновением и развитием бруцелл в мелких кровеносных сосудах данных органов.

При длительном течении заболевания в патологический процесс вовлекается все больше групп лимфоузлов, которые со временем могут разрушаться и замещаться соединительной (рубцовой) тканью, утрачивая в результате этого свою функциональную активность.

Поражение опорно-двигательного аппарата (как и других органов и тканей) возникает в результате проникновения бруцелл в ткани суставов и костей с последующим развитием в них инфекционно-воспалительных процессов и образованием гранулем. Данные гранулемы со временем могут замещаться фиброзной рубцовой тканью, что приведет к необратимому нарушению структуры и функции пораженного органа. Наблюдаются данные явления при подостром или хроническом течении заболевания.

Для бруцеллеза характерно возникновение:

  • Артритов.Артриты (воспаления суставов) при бруцеллезе множественные, то есть одновременно поражаются сразу несколько суставов во всем организме (вначале мелкие суставы кистей и стоп, затем более крупные). Артриты возникают при проникновении бруцелл в суставные полости и поражении внутрисуставных структур (синовиальной оболочки, суставных поверхностей хрящей и так далее). Проявляется артрит выраженными болями и ограничением подвижности в пораженных суставах, возникающими в результате прогрессирования воспалительного процесса. Кожа над пораженным суставом при этом может быть отечной, припухшей, гиперемированной (красного цвета) и сильно болезненной при прикосновении или при движении.
  • Периартритов. Периартрит характеризуется воспалением околосуставных компонентов (капсулы сустава, околосуставных связок и так далее), что клинически проявляется болями и нарушением подвижности в суставе (более выраженными, чем при простом артрите).
  • Бурситов.Бурсит – это воспаление синовиальной оболочки, которая выстилает внутреннюю поверхность суставной полости. В нормальных условиях синовиальная оболочка продуцирует определенное количество синовиальной жидкости, которая питает суставные хрящи и облегчает скольжение их друг относительно друга во время движений. При бурсите количество образующейся жидкости значительно возрастает. В результате этого она скапливается в полости сустава, обуславливая повышение внутрисуставного давления, нарушение подвижности и возникновение болей.
  • Тендовагинитов. Данным термином обозначается воспаление внутренней оболочки синовиальных влагалищ мышечных сухожилий, что обычно наблюдается в области кистей и стоп. В нормальных условиях данные влагалища окружают сухожилия, обеспечивая их свободное скольжение во время мышечного сокращения (это осуществляется благодаря наличию в них синовиальной жидкости). При развитии тендовагинита стенки влагалищ утолщаются, а количество продуцируемой жидкости возрастает, что приводит к сдавливанию сухожилий и возникновению болей.
  • Периоститов. Периоститом называется воспаление надкостницы – наружной оболочки кости, отвечающей за защиту и обновление костной ткани.
  • Фиброзитов. Фиброзитом называется воспаление фасциальных оболочек, окружающих мышцы. Вначале это может проявляться легкой болезненностью в области мышц, а затем в месте болезненности формируются плотные узелки, которые легко смещаются под кожей.

Для бруцеллеза характерно поражение как дыхательных путей, так и самой легочной ткани.

При бруцеллезе может развиться:

  • Катаральная ангина.Ангиной называется воспаление небных миндалин (гланд). Гланды состоят из скопления клеток иммунной системы (лимфоцитов), которые одними из первых контактируют с инфекционными агентами, проникающими через верхние дыхательные пути. А так как при бруцеллезе повышается активность всей иммунной системы, гланды реагируют на внедрение бруцелл особенно интенсивно. Ангина при бруцеллезе характеризуется развитием негнойного воспалительного процесса, что проявляется першением и болями в горле, усиливающимися во время речи и при глотании. При осмотре слизистая оболочка гланд и задней стенки глотки ярко-красного цвета, отечна.
  • Фарингит (воспаление слизистой оболочки глотки).Фарингит обычно сопровождает катаральную ангину и имеет схожие клинические проявления. Температура тела при ангине и фарингите может быть слегка повышенной (до 38 – 39 градусов).
  • Бронхит.Бронхитом называется воспаление слизистой оболочки бронхов, приводящее к ее отеку и усиленной секреции бронхиальной слизи. Клинически бронхит проявляется кашлем и болями в грудной клетке. Кашель вначале сухой, мучительный, однако через несколько дней становится продуктивным, то есть сопровождается выделением мокроты слизистого характера. При выслушивании легких у таких больных определяются сухие (в первые несколько дней заболевания) или влажные (в более поздние сроки) хрипы. При тяжелом течении бронхита кашель может стать причиной появления одышки (чувства нехватки воздуха).
  • Пневмония.Пневмонией называется воспаление легочной ткани, сопровождающееся нарушением процесса газообмена в пораженном участке легкого. Стоит отметить, что при бруцеллезе пневмония встречается не более чем у 1 – 2 % больных. Основными жалобами пациентов при этом являются постепенно прогрессирующая одышка и продуктивный кашель, во время которого может выделяться слизистая или слизисто-гнойная (серого или желтоватого цвета) мокрота. При выслушивании легких у таких больных определяется ослабление дыхания над пораженным участком (из-за того что воздух не проходит в пораженную альвеолярную ткань). Общее состояние также может быть нарушено (может отмечаться повышение температуры тела до 39 и более градусов, общая слабость, разбитость и так далее).

Поражение сердечно-сосудистой системы при бруцеллезе может проявляться:

  • Миокардитом. Миокард – это непосредственно сердечная мышца, ответственная за выполнение органом своей насосной функции. При ее воспалении (миокардите) может отмечаться одышка, усиленное и учащенное сердцебиение (особенно на фоне лихорадки), нарушение частоты и ритма сердечных сокращений (аритмия). Также больные могут жаловаться на колющие боли в области сердца, не зависящие от интенсивности выполняемой работы или от положения тела.
  • Эндокардитом. Эндокард – это внутренняя оболочка сердца, которая выстилает его камеры и непосредственно контактирует с кровью. Эндокард очень гладкий, ввиду чего клетки крови не прилипают к нему. Развитие эндокардита при бруцеллезе характеризуется нарушением целостности эндокарда и повышенным риском образования тромбов (кровяных сгустков), которые могут отрываться и с током крови переноситься в различные органы, закупоривая кровеносные сосуды и нарушая кровообращение в них. Наиболее опасным при эндокардите является поражение клапанов сердца (их патологическое сужение в результате поражения воспалительным процессом), что со временем может стать причиной развития сердечной недостаточности.
  • Перикардитом. Перикард – это наружная оболочка сердца (сердечная сумка), состоящая из двух листков — внутреннего (непосредственно окружающего сердечную мышцу) и наружного, который крепится к окружающим тканями и органам. Главной функцией перикарда является обеспечение подвижности сердца во время сокращений и расслаблений, при которых внутренний и наружный листки смещаются друг относительно друга. Если при бруцеллезе развивается перикардит, это приводит к образованию большого количества экссудата (воспалительной жидкости). Эта жидкость скапливается между листками перикарда и сдавливает сердечную мышцу, нарушая процесс сердечных сокращений и расслаблений.
  • Тромбофлебитом. Процесс проникновения бруцелл в кровь сопровождается активацией иммунной системы, что может привести к нарушению целостности внутренней оболочки кровеносных сосудов (эндотелия) и к воспалению венозных стенок. В результате этого к поврежденным участкам эндотелия прикрепляются тромбоциты (клетки крови, ответственные за остановку кровотечений) и формируется тромб, который нарушает ток крови по сосуду. Проявляется это выраженными болями в месте образования тромба, а также отеком тканей, отток крови из которых нарушен (например, при тромбофлебите вен бедра будет отмечаться отек в области стопы и голени). Наиболее опасным в данном случае является повышенный риск отрыва тромба и переноса его с током крови в легкие, где он может закупорить легочные сосуды и привести к смерти пациента.

Функциональные поражения нервной системы могут выявляться при подостром бруцеллезе, в то время как при хронической форме заболевания обычно возникают более серьезные нарушения.

Поражение нервной системы при бруцеллезе может проявляться:

  • Менингитом. Воспаление оболочек головного мозга при бруцеллезе встречается относительно редко, обычно развиваясь через 3 – 4 недели после инфицирования. Клинически менингит проявляется ригидностью затылочных мышц (голова больного не сгибается вперед из-за выраженного напряжения мышц задней части шеи) и другими менингеальными признаками. Также может отмечаться выраженное повышение температуры, озноб, тошнота или рвота, нарушение сознания.
  • Энцефалитом.Энцефалит развивается при поражении воспалительным процессом ткани головного мозга. Помимо общей симптоматики (повышения температуры, головных болей и так далее) могут наблюдаться симптомы очагового поражения мозга (нарушения чувствительности или двигательной активности в конечностях, а также нарушение или исчезновение различных других функций, за которые отвечал пораженный участок головного мозга).
  • Миелитом. Данным термином обозначается поражение спинного мозга, возникающее при заносе в него бруцелл с током крови. Клинически это проявляется нарушением чувствительности в области верхних или нижних конечностей. Больные жалуются на онемение, парестезии (чувство ползания мурашек), покалывание или жжение в различных участках тела. Через некоторое время после этого присоединяются и двигательные нарушения (вплоть до полного паралича).
  • Плекситом. Данным термином обозначается воспалительное поражение нервных пучков и сплетений, иннервирующих те или иные участки тела. При бруцеллезе может развиваться плексит шейного сплетения (иннервирует мышцы и кожу шеи), плечевого сплетения (иннервирует верхнюю конечность), пояснично-крестцового сплетения (иннервирует нижнюю конечность). Клинически плексит также проявляется нарушением чувствительности или двигательной активности в пораженной области.
  • Межреберными невралгиями. Характеризуется периодически возникающими болями тупого, ноющего или жгучего характера в одном или сразу в нескольких межреберных промежутках. Причиной болей является повреждение межреберных нервов воспалительным процессом. Боль обычно усиливается во время вдоха, что может стать причиной выраженного нарушения дыхания.

Поражение органов половой системы может произойти даже при подостром бруцеллезе. Без своевременного лечения патологический процесс будет прогрессировать, что со временем приведет к развитию необратимых изменений в пораженных органах и может стать причиной бесплодия.

При бруцеллезе у мужчин может развиться:

  • Орхит. Воспаление яичка, проявляющееся выраженными колющими или ноющими болями, которые могут иррадиировать (отдавать) в паховую область, промежность, в нижнюю часть живота или в поясницу. При осмотре пораженное яичко увеличено в размерах, резко болезненно при пальпации (прощупывании). При выраженном отеке могут сглаживаться естественные складки в области мошонки, она становится гладкой, гиперемированной (красного цвета), более теплой (по сравнению с невоспаленными участками).
  • Эпидидимит (воспаление придатка яичка). Клинически проявляется болями в области мошонки, а также болезненностью во время мочеиспускания или эякуляции (семяизвержения). При пальпации (прощупывании) в мошонке определяется объемное болезненное образование. Само яичко при этом может быть нормальным или также воспаленным (в данном случае речь идет об орхоэпидидимите).
  • Простатит. Воспаление предстательной железы, проявляющееся болями в паховой и/или поясничной области, а также в нижних отделах живота. Характерной особенностью простатита является выраженное жжение или режущая боль в паху во время мочеиспускания.

Бруцеллез у женщин может проявляться:

  • Эндометритом. Воспаление эндометрия (слизистой оболочки матки, выстилающей ее внутреннюю поверхность) может проявляться болями в нижних отделах живота, а также патологическими кровотечениями (возникающими вне менструального цикла). Без своевременного лечения воспалительный процесс может перейти на мышечный слой матки или на маточные трубы, что приведет к развитию осложнений.
  • Сальпингитом.Сальпингит – это воспаление маточных труб, соединяющих матку с яичниками. При прогрессировании воспалительного процесса может поражаться не только слизистая оболочка, ни и вся толщина стенки маточной трубы, что без лечения может стать причиной ее непроходимости и связанного с этим бесплодия.
  • Оофоритом. Воспаление яичников, которое часто сочетается с воспалением маточных труб. Проявляется острыми или ноющими болями в нижней части живота, а также болями во время полового акта. У большинства женщин при этом отмечаются нарушения менструального цикла (нерегулярные менструации, боли при выделении менструальной крови и так далее). Без своевременного лечения оофорит также может стать причиной бесплодия и снижения полового влечения у женщин.

Поражение глаз при бруцеллезе может проявляться:

  • Увеитом.Увеит (воспаление сосудистой оболочки глаза) может включать в себя иридоциклит (воспаление радужки и ресничного тела), хориоидит (воспаление задней стенки сосудистой оболочки, при котором может поражаться сетчатка) или панувеит (воспаляются все структуры сосудистой оболочки глаза). Проявляется увеит покраснением глаза, выраженностью сосудистого рисунка и нарушением зрения. Возникающее при этом нарушение кровообращения может стать причиной развития более грозных изменений, вплоть до потери зрения.
  • Кератитом. Воспаление роговицы глаза, проявляющееся ее помутнением или изъязвлением. Больные обычно жалуются на нарушение зрения, слезоточивость и светобоязнь, покраснение глаза.

В зависимости от стадии заболевания, а также от выраженности клинических проявлений выделяют несколько форм бруцеллеза, каждая из которых имеет особый прогноз и требует особого лечения.

В зависимости от выраженности клинических проявлений различают:

  • острый бруцеллез;
  • подострый бруцеллез;
  • хронический бруцеллез;
  • резидуальный бруцеллез.

Острый период заболевания начинается вместе с первыми клиническими проявлениями (обычно через месяц после инфицирования патогенными видами бруцелл) и длится не более полутора месяцев. Однако стоит отметить, что в некоторых случаях (например, у людей с ослабленным иммунитетом либо при малой первоначальной дозе возбудителя) первые симптомы заболевания могут появиться через 2 или 3 месяца после заражения.

Читайте также:  Передается ли бруцеллез от кошек

Развиваться острый бруцеллез может быстро (полная клиническая картина заболевания определяется уже через несколько дней после появления первых его симптомов) либо медленно, что обычно наблюдается у пожилых людей (их иммунная система не может быстро реагировать на проникновение бруцелл в кровоток, в связи с чем новые симптомы могут появляться и прогрессировать в течение нескольких недель).

Первыми и основными жалобами больных при острой форме заболевания являются выраженная слабость, снижение трудоспособности, лихорадка и другие симптомы интоксикации. У большинства пациентов при этом выявляется генерализованное увеличение лимфоузлов.

Важно отметить тот факт, что даже при выраженной интоксикации и повышении температуры тела общее самочувствие больных остается относительно стабильным, что является частой причиной ошибок во время постановки диагноза. Поражения различных органов для острого бруцеллеза не характерны, однако в особо тяжелых случаях уже в течение первых недель у больных могут появляться боли в суставах и в мышцах, поражения половой, нервной и других систем.

О подостром бруцеллезе говорят в том случае, если клинические симптомы сохраняются в течение 1,5 – 4 месяцев. Отличительной особенностью подострой формы заболевания является волнообразное течение лихорадки. Температура тела у таких пациентов обычно повышена, причем у большинства больных отмечается колебание температурной кривой даже в течение суток (утром может отмечаться легкий субфебрилитет, а к вечеру температура может переваливать за отметку в 40 градусов). Через несколько дней температурная кривая нормализуется (что сопровождается стиханием других симптомов), однако после непродолжительного промежутка времени лихорадка вновь обостряется.

Возникающие при подостром бруцеллезе поражения органов и систем носят функциональный характер, то есть при своевременно начатом и адекватно проводимом лечении могут быть полностью устранены.

Хронический бруцеллез диагностируются у пациентов, у которых клинические и/или лабораторные признаки заболевания наблюдаются в течение 4 месяцев и дольше. В течение этого времени иммунная система организма успевает перестроиться, вследствие чего начинает по-другому реагировать на развивающиеся в нем бруцеллы. Обострения заболевания наблюдаются реже, а лихорадка при этом не так выражена. Периоды ремиссии между двумя последующими обострениями могут длиться по несколько месяцев, однако полного исчезновения всех симптомов при этом не происходит, так как имеет место поражение различных органов и систем.

Такая клиническая картина может наблюдаться в течение 2 – 3 лет, при этом симптомы поражения различных органов и систем будут прогрессировать после каждого нового обострения заболевания. В то же время, при повторном инфицировании (например, если больной человек продолжает контактировать с зараженными животными) возможно более длительное течение заболевания. Прогноз в данном случае крайне неблагоприятен, так как развивающиеся органные поражения могут приобретать необратимый характер.

Заподозрить диагноз бруцеллеза можно после тщательного опроса больного, а также на основании данных клинического обследования и данных об эпидемиологической обстановке в районе. В то же время, для подтверждения диагноза необходимо провести ряд лабораторных исследований.

Во время опроса больного врач может спросить:

  • Как давно появились первые симптомы заболевания (лихорадка, общее недомогание и так далее)?
  • Кем работает пациент (в частности врача интересует, не занят ли больной в сфере животноводства)?
  • Имел ли место контакт с домашними или дикими животными, которые могли бы быть переносчиками бруцеллеза (с крупным или мелким рогатым скотом, со свиньями, с собаками, зайцами, оленями и так далее)? Если да – как давно?
  • Употреблял ли пациент в пищу термически необработанные (или плохо обработанные) продукты животного происхождения (мясо, молоко и так далее)?
  • Болел ли пациент бруцеллезом ранее? Если да – как давно?
  • Имеются ли схожие симптомы у кого-либо из окружения пациента (у коллег по работе, жены/мужа, детей)?

Для уточнения диагноза врач может назначить:

  • анализ крови;
  • серологическую диагностику;
  • микробиологическое исследование.

В общем анализе крови (ОАК) обычно не выявляется никаких специфических изменений. Тем не менее, неспецифические признаки воспаления в организме помогают определить стадию заболевания и оценить активность инфекционно-воспалительного процесса.

При обострении бруцеллеза в ОАК может быть выявлено:

  • Увеличение общего числа лейкоцитов (норма – до 9,0 х 10 9 /л). Лейкоциты – это клетки иммунной системы организма, которые реагируют на внедрение чужеродных агентов. Однако стоит отметить, что иногда при бруцеллезе количество лейкоцитов остается нормальным (это характерно для пожилых людей с ослабленным иммунитетом).
  • Увеличение количества моноцитов (норма – 3 – 9%). Моноциты представляют собой разновидность лейкоцитов, которые переходят из крови в ткани различных органов, превращаясь в макрофаги. Именно макрофаги ответственны за поглощение и переваривание попавших в организм бруцелл, поэтому у больных с бруцеллезом может отмечаться умеренный моноцитов (увеличение количества моноцитов в крови) через несколько недель после инфицирования.
  • Уменьшение количества нейтрофилов. Является неспецифическим, но часто встречающимся лабораторным признаком бруцеллеза.
  • Увеличение скорости оседания эритроцитов (норма – до 10 мм в час у мужчин и до 15 мм в час у женщин). Этот лабораторный показатель может использоваться для оценки степени активности воспалительного процесса в организме. При активации иммунной системы в кровь выделяются так называемые белки острой фазы воспаления, которые крепятся на поверхности эритроцитов (красных клеток крови), способствуя их склеиванию друг с другом, в результате чего они быстрее оседают на дно пробирки во время проведения исследования.

При проникновении в организм чужеродных микроорганизмов (бактерий, патогенных грибков и любых других) иммунная система реагирует определенным образом, вырабатывая специфические антитела. Данные антитела попадают в кровоток и связываются только с тем чужеродным микроорганизмом, против которого они были синтезированы (то есть антитела против бруцелл не будут взаимодействовать ни с какими другими бактериями). Исходя из этого, следует, что чем больше бруцелл в организме, тем выше будет количество синтезируемых против них антител в сыворотке крови. На данном принципе основано множество диагностических методов, называемых серологическими.

При серологической диагностике бруцеллеза может быть использована:

  • Реакция Райта (реакция агглютинации). Реакция Райта становится положительной уже с первых недель заболевания и может применяться с диагностической целью на протяжении всего острого периода болезни. Суть данной реакции заключается в том, что при взаимодействии антигенов бруцелл (особых комплексов, располагающихся на поверхности бактерий) со специфическими антителами они выпадают в осадок. Для проведения реакции в пробирку помещается специально подготовленная взвесь антигенов, после чего добавляется определенное количество сыворотки пациента, которую нужно исследовать. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела против бруцелл (то есть если организм больного контактировал с данными бактериями и его иммунная система начала против них бороться), они будут взаимодействовать с антигенами и выпадать в осадок, что будет видно при оценке результатов. Если же антител в крови пациента нет, никакой реакции не произойдет.
  • Реакция Кумбса. При хроническом бруцеллезе возможно образование так называемых неполных антител, которые не выявляются при реакции агглютинации. Однако данные антитела (являющиеся иммуноглобулинами) фиксируются на многих клетках человеческого организма, в том числе на эритроцитах. Суть реакции Кумбса заключается в добавлении к исследуемой крови специфических реагентов, которые взаимодействуют с неполными антигенами. Если таковые имеются на поверхностях эритроцитов, произойдет склеивание красных клеток крови, то есть реакция окажется положительной.
  • Проба Бюрне. Суть данной пробы заключается в следующем. Пациенту внутрикожно вводят очень маленькую дозу бруцеллезных антигенов и наблюдают за последующей реакцией. Если пациент никогда не болел и не болеет бруцеллезом, его иммунная система не подготовлена к борьбе с данными антигенами (на выработку специфических антител необходимо минимум несколько недель). Никаких выраженных реакций при этом не будет (возможно непродолжительное и безболезненное покраснение кожи в области введения, что является естественной реакцией организма на чужеродное вещество). Если же пациент заражен бруцеллезом, его иммунная система активно вырабатывает антитела против антигенов данного возбудителя. Внутрикожное введение таких антигенов вызовет ярко выраженную местную аллергическую реакцию, которая будет проявляться покраснением, отечностью и болезненностью кожи в месте введения в течение 24 – 48 часов. Данная проба будет положительной уже через 20 – 30 дней после заражения (когда явные клинические признаки болезни могут отсутствовать).

Суть данного исследования заключается в выделении возбудителей из различных биологических тканей организма (из крови, из пунктатов лимфатических узлов, из спинномозговой жидкости и так далее). Для выявления бруцелл производят посев исследуемого материала на специальные питательные среды и выращивают их при специальных условиях в течение длительного времени.

Стоит отметить, что ввиду сложности проведения и частых ложноотрицательных результатов, а также из-за высокой заразности исследуемого материала данное исследование проводится крайне редко (оно может выполняться только в специально оборудованных лабораториях и специально обученным персоналом).

Дифференциальную диагностику проводят для того, чтобы отличить бруцеллез от заболеваний, имеющих схожую клиническую картину. Так, например, при остром бруцеллезе следует исключить заболевания, протекающие с выраженной лихорадкой. В пользу бруцеллеза при этом будет свидетельствовать волнообразное повышение температуры, генерализованное увеличение лимфатических узлов и относительно удовлетворительное общее состояние пациента.

Острый бруцеллез следует дифференцировать:

  • От малярии. При данной патологии лихорадка также характеризуется волнообразным течением, однако имеются данные о пребывании пациента в очагах распространения данного заболевания (обычно это тропические страны), а также об укусах комаров, являющихся переносчиками малярии.
  • От СПИДа (синдрома приобретенного иммунодефицита). При данной патологии также может наблюдаться генерализованное увеличение различных групп лимфоузлов, однако отсутствует лихорадка.
  • От сепсиса. При данной патологии в кровь попадают гноеродные микроорганизмы, которые разносятся по всему организму и поражают многие органы и ткани. Температура тела при этом может повышаться до 40 – 42 градусов и сохраняться на таком уровне в течение всего периода заболевания, что обычно сочетается с крайне тяжелым общим состоянием пациента (вплоть до развития комы).
  • От лимфогранулематоза. Это опухолевое заболевание системы крови, при котором также поражаются лимфатические узлы и возможно волнообразное повышение температуры. В отличие от бруцеллеза, при лимфогранулематозе вначале увеличивается одна группа лимфатических узлов, а со временем (в течение нескольких недель или месяцев) патологический процесс распространяется на другие группы. Помочь в постановке диагноза в данном случае поможет подробный опрос больного (в частности уточняется, не контактировал ли он с животными-переносчиками бруцеллеза) и лабораторная диагностика.

Подострый и хронический бруцеллез следует дифференцировать от артритов (воспаления суставов) при ревматических заболеваниях. Для ревматических артритов характерно преимущественное поражение мелких суставов, а также наличие выраженной скованности в суставах по утрам, которая проходит через 30 – 60 минут после пробуждения (при бруцеллезе утренняя скованность практически не наблюдается).

источник

Определить это заболевание – непростая задача. Очень часто при вяло протекающих симптомах врачи могут спутать бруцеллез с раком, лейкозом, различными инфекциями. Большое значение имеют эпидемиологический анамнез и клиническая картина.

Анализ на обнаружение бруцеллеза.

Когда человек сталкивается с домашним рогатым скотом, то возникает большая вероятность заболевания бруцеллезом.

Основываясь на симптомах, нельзя с точностью подтвердить правдивость диагноза. Для того чтобы наверняка удостовериться в диагнозе, используются аллергологический, бактериологический и серологический анализы. Также актуальны стандартные анализы на бруцеллез, с использованием крови, мочи, пункции лимфатических узлов, суставной жидкости.

Бактериальное исследование имеет значительную отрицательную сторону – очень медленный рост бруцелл на питательных средах. Колонии вызревают лишь через 20–30 дней, что осложняет и замедляет диагностирование бруцеллеза. Такой анализ делать очень долго, поэтому сейчас актуально использовать серологические методы.

Для того чтобы убедиться, что у вас бруцеллез, необходимо провести следующие анализы. Важную информацию дает анализ крови на бруцеллез. Ее можно сдать практически в любом медицинском учреждении.

Биохимический анализ крови.

Сначала делают стандартный набор исследований:

  1. Общий анализ крови. В ней нужно определить содержание лейкоцитов. Если показатель повышен, это означает, что в организме присутствует воспалительный процесс. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) ускоряется, но не намного. Запущенная стадия заболевания приводит к понижению показателей всех элементов крови.
  2. Общий анализ мочи. Здесь необходимо определить, присутствует ли белок в моче, и в каких количествах. Для этого следует повторять такой анализ мочи несколько раз.
  3. Биохимический анализ крови. Здесь анализируют уровни печеночного цитолиза (АлАТ, АсАТ), если эти показатели становятся выше нормы, то это говорит о гипербилирубинемии, снижается уровень альбуминов (гипоальбуминемия), при этом общий белок остается на нормальном уровне.

Чтобы определить возбудителя заболевания, применяют следующие методы.

Он дает практически 100% достоверный результат.

Однако этот метод отличается сложностью и длительностью. В качестве биологического материала используются кровь, моча, спинномозговая, внутрисуставная жидкость, желчь, а также проба из лимфатических узлов. Эти жидкости засевают на питательные среды и ждут роста микроорганизмов. Длительность этого метода составляет чуть меньше месяца, а порой и целый месяц, все зависит от роста колониальных бруцелл.

Это самый популярный анализ для определения бруцеллеза. Результаты можно узнать уже через неделю. Принцип заключается в нахождении иммуноглобулинов (антител) в сыворотке к бруцеллезным антигенам. По их классу можно определить продолжительность и скорость процесса. Для определения используют реакции Райта и Хеддельсона.

Бруцеллы убивают при помощи нагревания, и эта взвесь реагирует с сывороткой крови пациента. Если в процессе реакции бруцеллы склеиваются в маленькие шарики и оседают – это означает, что в сыворотке содержатся антитела и, значит, человек действительно болеет бруцеллезом. При отрицательной реакции заболевание не диагностируется. Этот метод хорош тем, что уже на ранних стадиях заболевания он может дать положительный результат. При помощи такой реакции находят бруцеллез не только у человека, но и у животных.

Она не дает такого достоверного результата. Здесь агглютинация делается на стекле. Часто эта реакция дает ложный результат.

Его проводят для обнаружения антител, которые атакуют эритроциты.

Для обнаружения бруцеллеза используется прямая реакция. Эта реакция различает антитела, которые напрямую связаны с эритроцитами. Если антиглобулиновый тест показывает отрицательный результат, значит, кровь чистая, и антител нет. Положительный результат означает появление антител, которые активно борются с эритроцитами.

ПЦР-диагностика основывается на обнаружении ДНК-цепей бруцелл из биологического материла пациента. Для этого материал обеззараживают, добавляя метиолят натрия в концентрации 0,01% с дальнейшим прогреванием в течение получаса. Когда завершится инкубирование в лизирующем растворе, который содержит все необходимые реагенты для экстракции ДНК при поддержании температуры 66 °С на протяжении 10–15 минут, биологическая ткань обезвреживается.

ПЦР-диагностика на обнаружении ДНК-цепей бруцелл.

Этот анализ особенно приемлем в том плане, что можно использовать абсолютно любую биологическую ткань пациента.

К одним из популярных методов относится реакция Бюрне. Она основана на введении внутрикожно бруцеллина. Если есть бруцеллез, то на месте укола начинается покраснение и небольшая пастозность. Именно этот участок и оценивается как аллергологическая проба Бюрне. Пятно измеряют и делают заключение: если пятно превышает 6 сантиметров, то реакция считается положительной.

Такая проба действительна, когда бруцеллез в хронической форме. Также необходимо учитывать и тот факт, что положительная реакция может возникнуть у людей, которые проходили вакцинирование по профилактике бруцеллеза.

источник

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Метод исследования: РА, реакция агглютинации.

Бруцеллез – острое инфекционно-аллергическое, зоонозное заболевание. Возбудитель бруцеллеза относится к роду Brucella. Род Brucella состоит из 9 самостоятельных видов, вызывающих заболевание у животных и людей. Заболевания людей преимущественно вызывают B. melitensis, B. abortus и B. suis биовары 1-4, реже B. сanis, B. сeti и B. рinnipedialis. Основные источники инфекции — овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи. Факторы передачи — сырье животного происхождения (шерсть, пух, шкуры), мясомолочные продукты. Болезнь начинается, как правило, с острой лихорадки с неспецифическими гриппоподобными проявлениями, склонна к хронизации и появлению осложнений в виде артритов, спондилитов, эндокардитов, менингитов, нейропатии, васкулитов, нефритов, лимфоаденопатии.

Референсные значения (вариант нормы):

Параметр Результат Референсные значения
Anti-Brucella species,РА (антитела к возбудителям бруцеллёза), качественное Обнаружено Не обнаружено

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

» [«serv_cost»]=> string(3) «560» [«cito_price»]=> NULL [«parent»]=> string(2) «25» [10]=> string(1) «1» [«limit»]=> NULL [«bmats»]=> array(1) array(3) string(1) «N» [«own_bmat»]=> string(2) «12» [«name»]=> string(31) «Кровь (сыворотка)» > > >

Биоматериал и доступные способы взятия:
Тип В офисе
Кровь (сыворотка)
Подготовка к исследованию:

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Метод исследования: РА, реакция агглютинации.

Бруцеллез – острое инфекционно-аллергическое, зоонозное заболевание. Возбудитель бруцеллеза относится к роду Brucella. Род Brucella состоит из 9 самостоятельных видов, вызывающих заболевание у животных и людей. Заболевания людей преимущественно вызывают B. melitensis, B. abortus и B. suis биовары 1-4, реже B. сanis, B. сeti и B. рinnipedialis. Основные источники инфекции — овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи. Факторы передачи — сырье животного происхождения (шерсть, пух, шкуры), мясомолочные продукты. Болезнь начинается, как правило, с острой лихорадки с неспецифическими гриппоподобными проявлениями, склонна к хронизации и появлению осложнений в виде артритов, спондилитов, эндокардитов, менингитов, нейропатии, васкулитов, нефритов, лимфоаденопатии.

Референсные значения (вариант нормы):

Параметр Результат Референсные значения
Anti-Brucella species,РА (антитела к возбудителям бруцеллёза), качественное Обнаружено Не обнаружено

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 — 2019

Центральный офис: 111123, Россия, Москва, ул. Новогиреевская, д.3а, метро «Шоссе Энтузиастов», «Перово»
+7 (495) 788-000-1, info@cmd-online.ru

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

— реакция агглютинации с S — и R -бруцеллезными антигенами;

— пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

— реакция связывания комплемента;

— реакция длительного связывания комплемента на холоде;

— реакция непрямой гемагглютинации;

— реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

— реакция иммунодиффузии в геле агара с R -бруцеллезным антигеном;

— кольцевая реакция с молоком;

— иммуноферментный анализ;

— иммунохроматографический анализ.

Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

Читайте также:  Бруцеллез прививки для коров

— РА — реакция агглютинации;

— РСК — реакция связывания комплемента;

— РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

— РДСК — реакция длительного связывания комплемента;

— РИД — реакция иммунодиффузии;

— ЛПС — липополисахаридный антиген;

— О-ПС — олигополисахаридный антиген;

— РНГА — реакция непрямой гемагглютинации;

— КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;

— ИФА — иммуноферментный анализ;

— ИХА — иммунохроматографический анализ;

— PKг-G — раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;

— ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с твином;

— РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;

— ТМБ-субстрат — тетраметилбензидин-субстрат;

— К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

— К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.

4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности*, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
________________
* Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0,2) МПа и температуре (132±2)°С.

При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животных:

— pH-метр с точностью калибровки ±0,1 ед.pH при температуре от 20°С до 55°С;

— спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм, разрешением 1 нм и точностью ±2 нм;

— пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см по ГОСТ 29230;

— колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;

— центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000-3000 об/мин;

— автоклав лабораторный;

— термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С;

— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100°С;

— холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317;

— насос вакуумный;

— иглы препаровальные;

— штамп для формирования лунок в агаре;

— осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0-360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;

— чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;

— чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;

— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:

1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;

2) пипетка-капельница для дозирования антигена;

3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;

4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;

— пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);

— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;

— групповые дозаторы Флоринского;

— пробирки серологические Флоринского;

— микропипетки вместимостью от 0,1 до 0,5 см ;

— дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;

— наконечники для дозаторов вместимостью 0,2; 0,5; 1,0 см ;

— фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;

— бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

— салфетки марлевые;

— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

— вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

— кислота соляная по ГОСТ 3118 х.ч;

— фенол по ГОСТ 23519 — 5%-ный раствор;

— формалин по ГОСТ 1625 — 1%-ный и 10%-ный растворы;

— натрий хлористый по ГОСТ 4233;

— кислота борная по ГОСТ 18704 — 3%-ный раствор;

— натрия бихромат по ГОСТ 2651;

— калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;

— кислота серная по ГОСТ 4204;

— натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

— сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;

— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;

— кровь барана-донора;

— свинки морские массой 300-400 г;

— сыворотки крови животных;

— набор для ИФА, содержащий в своем составе:

1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella ;

7) флакон N 6 — ТМБ-субстрат;

8) флакон N 7 — стоп-реагент объемом 6 см ;

— тест-система для определения антител к ЛПС антигену В.abortus и В. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА, содержащая в своем составе компоненты:

1) К — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;

2) К — буферный раствор для разведения проб объемом 0,8 см ;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);

— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);

— роз бенгал антиген для РБП;

— антиген бруцеллезный для КР с молоком;

— 0,85%-ный раствор хлористого натрия;

— 0,85%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— 5%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— 10%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— раствор хлорамина 5%-ный;

— взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

— молоко от здоровой коровы (буйволицы);

— набор для РИД, содержащий в своем составе:

1) О-ПС бруцеллезный антиген;

3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;

— набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:

1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;

2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

4) сыворотку негативную.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.

6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4°С-10°С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).

6.1.2 Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 см (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 см сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (3-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2°С до 8°С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.

6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10-15 см . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 см молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.

6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.

7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.

7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)

7.2.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.

7.2.2 Подготовка к исследованию

7.2.2.1 Приготовление 5%-ного раствора хлорамина

Для приготовления 5%-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.

7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.

Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.

Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

7.2.3 Проведение исследования

7.2.3.2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0,03 см антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0,015 см антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 см 0,85%-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0,03 см роз бенгал антигена).

По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5%-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37°С-38°С и используют повторно.

7.2.4 Обработка результатов

Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).

При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА, или в ИХА.

7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком

Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.

7.3.1 Подготовка к исследованию

Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.

7.3.2 Проведение исследования

В пробирки вносят по 2 см молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0,1 см в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т.д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.

При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

— смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см сыворотки на 2 см молока).

Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37°С-38°С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

«+++» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

«++» (два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

«+» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;

«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.

7.3.3 Обработка результатов

Все пробы молока с оценкой в «+++» (три креста) и «++» (два креста) считают положительными, «+» (один крест) — сомнительными.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР, исследуют на бруцеллез в РБП, или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках

7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5%

В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5, 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С, и используют в течение 1 мес.

7.4.3 Проведение исследования

7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

7.4.3.2 Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в объеме 1 см :

— для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— для овец, коз, оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— для собак с R -бруцеллезным антигеном ( B.canis ) — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.

7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:

— сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0,1 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25);

— сыворотки крови овец, коз и собак по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 5%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);

— сыворотку крови оленей и маралов по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 10%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);

— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0,3 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 1,2 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);

— при исследовании с R -бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0,1 см вносят в пробирки, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25).

В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.

В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,5 см исходного разведения сыворотки.

После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0,5 см переносят в пробирки четвертого ряда и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 см жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.

7.4.3.4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 см антигена в рабочем разведении 1:10 (1,0+9,0 см ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.

В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютинацию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях. Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского, или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0,02 и 0,01 см (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 см при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1,0 см антигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.

Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.

7.4.4 Обработка результатов

Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

«+++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75% агглютинации);

«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50% агглютинации);

«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME, 1:200 — 200 ME и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75%, 50%, 25% и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно вносят 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 см антигена, разведенного 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1,0 см в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75%, 50% и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см ).

Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.

7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Сущность реакции состоит в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.

7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих антикомплементарными свойствами.

Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.

Читайте также:  Реакция агглютинации при бруцеллезе животных

7.5.3 Подготовка к исследованию

7.5.3.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия

Для приготовления 1 дм раствора 8,5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6,8-7,2 ед.pH 5%-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0,85%-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.

20 — исходное разведение комплемента (1:20).

Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см (0,2·100), то к 0,6 см регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.

Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.

Эритроциты барана — 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85%-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446 . Дефибринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата, растворенного в 10-20 см стерильного 0,85%-ного раствора хлористого натрия, на 100 см крови. Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10-14 сут.

Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37°С-38°С в течение 15-35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.

Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60°С-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64°С-65°С, буйволов — 62°С-64°С, свиней — 58°С-60°С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63°С-64°С в течение 30 мин.

Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1 — Проверка антикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Комплемент в разведении 1:20

Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении

Антиген в рабочем разведении

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 10 мин при 37°С-38°С

Полная задержка гемолиза эритроцитов

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

7.5.4 Проведение исследования в РСК

При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).

Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:

— при массовом исследовании в одной пробирке к 0,05 см исследуемой сыворотки добавляют 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);

— при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1 см исследуемой сыворотки, добавляют 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0,5 см ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0,2 см во вторую пробирку и 0,1 см — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.

Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пипеточных дозаторов с наконечником.

Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

Таблица 2

При массовом исследовании

При исследовании в двух разведениях

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

Водяная баня 30 мин при 58°С-65°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

Примечание — Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.

При постановке реакции ставят следующие контроли:

— негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);

— гемолитической системы (0,4 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— комплемента (0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз;

— антигена (0,2 см антигена в рабочем разведении, 0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,2 см 0,85%-ный раствор хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз.

При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0,8 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, 0,2 см пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого, пятого и шестого рядов вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0,2 см в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0,2 см разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20, и так далее до шестого разведения 1:80. Из пробирок последнего ряда по 0,2 см разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомплементарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.5.1 Подготовка к исследованию

Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06-0,1 или в разведении 1:20-1:15 при титре 0,1-0,14.

Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.

Таблица 3

Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С

Холодильник 16-18 ч при 2°С-6°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

7.5.5.2 Проведение исследования

Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.

Таблица 4

При массовом исследовании

При исследовании в трех пробирках

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Антиген в рабочем раведении

Комплемент в рабочем разведении

Холодильник 2-6°С 16-18 ч и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система в рабочей дозе

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

При постановке реакции ставят контроли:

— негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;

— гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0,6 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— антиген с 0,85%-ным раствором хлористого натрия и гемолитической системой (0,2 см антигена в рабочем разведении; 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,6 см гемолитической системы) — полная задержка гемолиза.

7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках — через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;

«+++» (три креста) — гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;

«++» (два креста) — гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;

«+» (один крест) — гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;

«-» (минус) — гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.

Таблица 5

Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.

Реакцию считают:

— положительной — при задержке гемолиза на два-четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.

7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном (О-ПС)

7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антител и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.

7.6.2 Приготовление 0,8%-ного агар-агара и подготовка чашек Петри

Для приготовления 200 см агара 17 г хлористого натрия и 1,6 г микробиологического агар-агара переносят в стеклянную колбу вместимостью 500 см , добавляют 200 см дистиллированной воды.

Колбу закрывают непромокаемым материалом (пергаментной бумагой, фольгой и т.п.) и помещают на водяную баню, которую также накрывают для предотвращения испарения воды при кипении водяной бани. Для полного расплавления агара колбу выдерживают в водяной бане в течение 35-45 мин с момента закипания воды. В чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность, вносят по 14-18 см расплавленного агара. Чашки оставляют в течение 1 ч с приоткрытыми крышками. После застывания агара чашки Петри закрывают крышками и помещают в холодильник при температуре от 2°С до 8°С, хранят не более 5 сут.

При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм, остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).

7.6.3 Проведение исследования

7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных; для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.

Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4°С до 8°С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

7.6.3.2 Реакцию иммунодиффузии проводят в чашках Петри. В центральную лунку вносят 0,02 см О-ПС антигена, а в периферические — по 0,04 см исследуемых сывороток крови.

На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (преципитирующей).

После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18°С до 26°С.

7.6.4 Обработка результатов

7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.

Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.

Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат повторному исследованию.

Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.

При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.

7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза

а) крупного рогатого скота в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза, исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;

— для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

б) северных оленей в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллезные вакцины не применяют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

— при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:

— для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес, только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

— для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями;

3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:

— с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес, только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

— при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА, РСК (РДСК).

7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с R -бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза собак, вызываемым B.canis

7.7.1 Подготовка к исследованию

7.7.1.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия

В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5 г хлористого натрия. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С и используют в течение 1 мес.

7.7.1.2 Приготовление 0,8%-ного геля агара по 7.6.2

7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.

7.7.2 Проведение исследования

Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб — диаметром 40 мм, для исследования 6-40 проб — диаметром 90 мм.

В центральную лунку геля вносят 0,02 см антигена, в периферические — по 0,04 см исследуемых проб сыворотки крови.

В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R -бруцеллезной сывороткой для РИД.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18°С до 26°С.

7.7.3 Обработка результатов — по 7.6.4.

7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

7.8.1 Сущность метода

Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.

7.8.2 Подготовка к исследованию

7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси

В фарфоровую чашку вместимостью 300-500 см помещают 5 г тонкоизмельченного в фарфоровой ступке двухромовокислого калия или 6 г бихромата натрия, добавляют 100 см концентрированной технической серной кислоты и осторожно нагревают на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (бихромата натрия). Хромовую смесь хранят при комнатной температуре до момента изменения цвета с темно-оранжевого до темно-зеленого.

7.8.2.3 Подготовка планшетов

Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.

Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.

При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.

Реакцию ставят на 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую регидратируют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором хлористого натрия.

7.8.3 Проведение исследования

Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.

Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.

Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.

Реакцию проводят в объеме 0,55 см (0,5 см разведения сыворотки и 0,05 см антигена) в пробирках Флоринского.

При массовых исследованиях постановку реакции можно проводить с использованием исследуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания исследуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см вносят в лунки планшетов и добавляют в них по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

В каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см антигена в рабочем разведении.

Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 26°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.

Сыворотки от неиммунизированного или иммунизированного неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разведения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разведение 1:50 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирку с 4,9 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия или по 0,05 см сыворотки и 2,45 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, если используются пробирки вместимостью до 5 см .

Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное разведение 1:12,5 готовят путем внесения 0,2 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,3 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.

Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до 60°С-62°С в течение 30 мин.

При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении, для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.

Все сыворотки (исследуемые и контрольные) проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.

В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0,5 см и пятого ряда по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

В лунки первого ряда добавляют по 0,5 см , а в лунки пятого ряда по 0,25 см исследуемых и контрольных сывороток в исходном разведении. После смешивания путем пипетирования по 0,5 см разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго — в лунки третьего, из лунок третьего — в лунки четвертого, из лунок четвертого ряда по 0,5 см разведенных сывороток удаляют.

Во все лунки первых четырех рядов с разведенными сыворотками добавляют по 0,05 см антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и 0,85%-ного раствора хлористого натрия. В лунки пятого ряда вносят 0,05 см взвеси несенсибилизированных эритроцитов в рабочем разведении (один объем несенсибилизированных эритроцитов + один объем 0,85%-ного раствора хлористого натрия).

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 24°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.

Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.

Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2°С до 8°С и на следующий день исследуют.

После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1,5-2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.

7.8.4 Обработка результатов

Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — 100%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде «зонтика»;

«+++» (три креста) — 75%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов;

«++» (два креста) — 50%-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него;

«+» (один крест) — на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета;

«-» (минус) — эритроциты оседают в виде компактной «пуговки» или колечка.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста («++»), один крест («+») и минус («-«) считают отрицательными.

7.9 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Сущность метода заключается в выявлении в образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.

7.9.1 Подготовка к исследованию

7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т

ФСБ-Т — концентрированный раствор буфера (флакон N 1) разводят в 25 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата в объеме 26 см переносят в мерную колбу и доводят объем до 650 см дистиллированной водой. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают. В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отбирают необходимое для данного исследования количество составных частей ФСБ-Т в соответствии с таблицей 6.

Таблица 6 — Разведения ФСБ-Т

источник