Меню Рубрики

Реакция рск при бруцеллезе

Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.

В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.

При проведении эпидемиологического исследования бруцеллеза в очагах применяют 1.реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и 2.Объемную (Райта), а так же реакции Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилактической вакцинацией населения можно ограничиться постановкой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.\

Реакция Райта (Реакция агглютинации с бруцеллезным антигеном в пробирках )

Реакция Райта проводится в пробирках в объеме 1 мл с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 и единым бруцеллезным диагностикумом. Последний представляет собой взвесь убитых нагреванием и фенолом бруцелл. Для пробирочной реакции диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физраствором. Методика разведения сыворотки обычна для пробирочной реакции агглютинации. Пробирки встряхивают, ставят в термостат при температуре 37° до следующего дня. Учет реакции проводят обычным способом или по 50% агглютинации (2+) в сравнении со стандартом мутности. Серийные титры 50% агглютинации 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,1:800 свидетельствуют о том, что в 1 мл исследуемой сыворотки содержится соответственно 50, 100, 200, 400, 800 МЕ антител. Выраженность реакции больного оценивают по следующей схеме: титр 1:50 оценивается как сомнительный, 1:100 – слабо положительный, 1:200 и 1:400 – положительный, 1:800 – резко положительный.

При остром бруцеллезе реакция Райта положительна у больных в титре 1:200-1:800, тогда как при хроническом бруцеллезе – в титре 1:50-1:100. В то же время обострение хронического бруцеллеза сопровождается повышением титра 1:200-1:400.

Перечисленные показатели относятся к больным, заражение которых происходило в период их кратковременного пребывания в сельской местности, неблагополучной по бруцеллезу, или в результате систематического употребления некипяченого «фляжного» молока в городе.

Иногда резко выраженная реакция Райта наблюдается у больных со слабо выраженными клиническими проявлениями бруцеллеза.

Серологическая реакция агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона)

Реакция Хеддльсона (пластинчатая – применяют на стекле) чувствительна, но менее специфична, дает возможность выявлять агглютинины в первые дни болезни, быстро получить ответ. На большое (9х12см) хорошо обезжиренное сухое стекло на расстоянии 3-4 см друг от друга микропипеткой наносят исследуемую сыворотку в дозах 0,04, 0,02, 0,01 мл (опытные капли) и 0,02 мл (контрольная капля). К трем первым каплям сыворотки добавляют по 0,03 мл единого неразведенного диагностикумума, к последней – 0,03 мл физраствора. Максимальный срок наблюдения – 8 минут. Учет осуществляют невооруженным глазом по 4+ системе. При положительной реакции в опытных каплях появляются хлопья и жидкость становится более или менее прозрачной. Агглютинацию во всех трех дозах 4+ принимают за резко положительный результат, в первой и второй дозах – за положительный результат, только в первой дозе – сомнительный результат, отсутствие агглютинации во всех дозах – отрицательный результат.

Реакция Кумбса либо антиглобулиновый тест.

Его проводит для обнаружения антител, которые атакуют эритроциты.

Для обнаружения бруцеллеза используется прямая реакция. Эта реакция различает антитела, которые напрямую связаны с эритроцитами. Если антиглобулиновый тест показывает отрицательный результат – значит кровь чистая, и антител нет. Положительный результат означает появление антител, которые активно борются с эритроцитами.

ПЦР-диагностика основывается, на обнаружении ДНК-цепей бруцелл из биологического материла пациента. Для этого материал обеззараживают, прибавляя метиолят натрия концентрацией 0,01% с дальнейшим прогреванием в течение получаса. Когда завершится инкубирование в лизирующем растворе, который содержит, все необходимые реагенты для экстракции ДНК при поддерживании температуры в 66С на протяжении 10-15 минут биологическая ткань обезвреживается.

Этот анализ обладает положительной чертой в том плане, что можно использовать абсолютно любую биологическую ткань пациента.

источник

К основным методам диагностики бруцеллеза относятся реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК).

Реакция агглютинации (РА). РА является основным методом диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных в СССР. Техника постановки реакции изложена в специальной инструкции. РА, как установил Бордэ, протекает двухфазно. Первая фаза — это соединение антитела с антигеном или гаптеном. Эта фаза визуально не определяется, в связи с чем подбираются условия для косвенного ее определения. Установлено, что первая фаза может протекать при отсутствии электролитов (солей), тогда как вторая фаза при таких же условиях протекать не может. При этом оказалось, что активность проявления второй фазы РА зависит от концентрации солей в разбавителе. Вместе с этим было установлено, что чем менее активный иммунный сывороточный глобулин, тем большая концентрация соли требуется в растворе.

При исследованиях, проведенных «в проблемной лаборатории ЛВИ, было установлено, что иммуннуе сыворотки крови отдельных видов животных проявляют в реакции агглютинации свою иммунологическую активность неодинаково в зависимости от концентрации хлорида натрия, вводимого в качестве разбавителя компонентов РА. Так, например, если иммунные бруцеллезные сыворотки крупного рогатого скота проявляют иммунологическую активность по РА в 0,25%-ном растворе хлорида натрия, то для получения аналогичных показателей реакции у овец нужно их иммунную бруцеллезную сыворотку исследовать по РА в 7—20%-ной концентрации раствора хлорида натрия. Поэтому мы предложили (1953) исследовать сыворотки крови овец на бруцеллез по РА в 10%-ном растворе хлорида натрия вместо 0,85%-ного раствора. 13 широкой практике было показано, что РА в 10%-ном растворе хлорида натрия способствует выявлению большего количества больных овец в неблагополучных отарах, а феномен положительной реакции представляется более отчетливым.

РА для исследования на бруцеллез может быть совершенствована также за счет антигена. По данным Альтона (1971), с иммунными сыворотками против Br. melitensis титры в РА с антигеном Br. melitensis были в 3,6 раза выше, чем с антигеном из штаммов Br. abortus + Br. suis (показана кратность самого низкого титра РА с антигеном Br. abortus и Вг, suis к самому высокому титру в РА с антигеном Br. melitensis). Средние данные следующие. Антигены Br. abortus (Br. suis) дали титры в 2,4 раза выше, чем антиген Br. melitensis с иммунными сыворотками против Br. abortus, и в 2,6 раза выше с иммунными сыворотками против Br. suis. С иммунными сыворотками против Br. melitensis РА с антигенами Br. melitensis показывала титры в 3 раза выше, чем с антигенами Br. abortus и Br. suis.

При исследовании сывороток крупного рогатого скота, инфицированного Вт. melitensis, результат был аналогичен. Часто кратные величины были настолько большими, что, сравнивая результаты РА, можно было ставить диагноз у крупного рогатого скота на бруцеллез за счет антигена Br. melitensis. Все препараты, использованные в этом опыте, были стандартизированы по прямой методике для интернациональной стандартной бруцеллезной сыворотки. Антиген Br. melitensis для РА, по данным автора, может быть использованв практике не только для овец, но и для крупного рогатого скота в районах Средиземного моря и других районах, где распространен бруцеллез и овец и крупного рогатого скота.

Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (1971 г.) рекомендует выражать результаты пробирочных реакций агглютинации с сывороткой крови в международных единицах (ME). Для этой цели в центральной лаборатории Вейбридж изготовлена стандартная Anti Brucella abortus сыворотка (ISAbS).

Первая международная единица бруцеллезной сыворотки должна быть равна 0,091 мг сухого вещества, содержащегося в 1 мл сыворотки, изготовленной лабораторией Вейбридж. Эта лаборатория по заданию Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ приготовила сыворотку, которая была принята как стандарт экспертами ФАО/ВОЗ по бруцеллезу на втором заседании во Флоренции в октябре 1952 г. (сообщение 1953 г.).

Сухая стандартная первая интернациональная бруцеллезная сыворотка содержала 91 мг сухого вещества в 1 мл. Так как интернациональная единица в 1000 раз меньше обычной, то сухая сыворотка содержит, следовательно, 0,091 мг сухого вещества стандартной (первой) сыворотки (Квибридж). Следовательно, первый стандарт сыворотки — это 1000 интернациональных единиц; одна десятая стандарта равна 100 ИЕ и т. д.

Но в разных странах по-разному готовят антиген и учитывают РА. Поэтому сравнительный результат благодаря этой системе удовлетворяет как тест, но имеет второстепенное значение, поскольку РА применяется для диагностики бруцеллеза, а не для сравнения результатов. Поэтому была предложена (ФАО/ВОЗ) в масштабе всего мира «система единиц» (1957 г.). В основу этой системы положен титр агглютинации антигена (данной страны) международной стандартной сывороткой.

При таком критерии примеры следующие. Допустим, что в любой лаборатории титр стандартной сыворотки с местным антигеном равен 1 : 500, значит, по международному критерию при исследовании этим же антигеном сывороток при их титре 1 : 500 они будут содержать 1000 ИЕ. Если титр сывороток с местным антигеном 1 : 400, а со стандартной сывороткой 1 : 500, то тогда титр исследованной сыворотки по международному критерию будет равен 1 : 800 и так далее. Здесь применима следующая формула расчета: ab/c, где а — постоянная величина — 1000 ME; b — титр сыворотки, полученный с местным антигеном (в нашем примере 1 : 400); с — титр сыворотки, полученный с местным антигеном и стандартной сывороткой (в нашем примере 1 : 500).

В данном случае титр агглютинации антигена равен: (1000*400)/500 = 800 ME

Положительный результат считается, если сыворотка крови имеет агглютинационный титр 100 ИЕ в 1 мл. Для животных, вакцинированных вакциной из штамма № 19, титр повышается вдвое, т. е. до 200 ME.

В 1963 г. состоялось объединенное заседание Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, где было принято решение выражать уровень агглютининов в международных единицах на 1 мл сыворотки крови или молока (МЕ/мл).

К 1965 г. первая стандартная сыворотка, приготовленная в количестве 1000 ампул лабораторией Вейбридж и содержащая 91 мг сухого вещества в 1мл, была исчерпана. Поэтому Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по биологической стандартизации (1968 г.) поручил той же лаборатории изготовить новую стандартную сыворотку.

Новая сыворотка после широкой апробации в разных лабораториях была принята в качестве второго международного стандарта. Она содержит в 1 мл в среднем 95,52 мг сухого вещества, а международная единица — в тысячу раз меньше, т. е. 0,0955 мг сухого вещества. Из всех расчетов сохранились те, которые указаны для первой стандартной сыворотки.

Стандартная сыворотка, полученная на гладкий штамм Br. abortus биотипа 1, содержит преимущественно IgG-антитела. Выпускаемый в СССР стандартный антиген для РА подтитрован по количеству микробных клеток в 1 мл антигена, так что он соответствует по показаниям национальной стандартной сыворотке — международному стандарту. Диагностические титры при этом сохранились.

Ввиду принятия международного стандарта РА следует упомянуть о том, что минимальный диагностический титр для крупного рогатого скота, рекомендуемый Комитетом экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ, составляет 100 МЕ/мл для животных невакцинированных и 200 МЕ/мл для вакцинированных. Сомнительные титры установлены для невакцинированных животных 50 МЕ/мл, для вакцинированных — 100 МЕ/мл. Повторное исследование животных, давших сомнительные показания, производят через 60 дней.

Рекомендуется также проводить быстрый пластинчатый метод РА, хотя его считают менее чувствительным по сравнению с пробирочным.

Для овец диагностический титр пробирочной РА определяется 40 МЕ/мл.

Реакция связывания комплемента (РСК) и ее модификации. Наиболее чувствительная и достоверная модификация реакции связывания комплемента на холоде — реакция длительного связывании комплемента (РДСК) с титрованием гемолитической системы (метод П. А. Триленко). Эта реакция изложена в главе VI как официальный в СССР метод диагностики инфекционного заболевания овец, вызываемого Br. ovis. РДСК применяется также для диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных наравне с РСК. Новое наставление по постановке и учету РСК утверждено Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 27 мая 1976 г.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Реакцию связывания комплемента (РСК) используют для выявления антител на определенный антиген или определяют тип антигена по известному антителу. Это сложная серологическая реакция, в ней участвуют две системы и комплемент. Первая система – бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). Вторая система – гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело). РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитело, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему. Реакцию учитывают следующим образом. Если в первой (баксистеме) комплемент связался, то при добавлении гемсистемы гемолиз эритроцитов не произойдет – реакция положительная. Если же комплемент не связался в первой системе из-за отсутствия антител, то он свяжется с гемсистемой, в результате чего произойдет гемолиз эритроцитов – реакция отрицательная.

Антигены для РСК готовят из убитых и разрушенных микробов, чаще путем экстрагирования.

РСК широко используют для диагностики бруцеллеза, сапа, риккетсиозов, ящура и многих других.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Это вариант обычной РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16–18 ч на холоде (4°С). В таких условиях в первой системе в комплексе антиген – антитело – комплемент дополнительно связываются и криофильные (холодовые) антитела, что повышает чувствительность реакции. Этот вариант используют для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза и др.

Реакция связывания комплемента (РСК) впервые описана Борде и Жангу (1901). В отличие от РА и РП при РСК соединение антигена с антителом проявляется только в присутствии третьего компонента – комплемента.

Реакция образования комплекса, Антиген – антите Ло – комплемент – невидимая. Чтобы выявить указанное взаимодействие компонентов реакции, используют дополнительную индикаторную систему, которая по своей наглядности проявления косвенно отражает результат взаимодействия в первой системе. Таким образом; в РСК участвуют две системы: 1) бактериолитическая (диагностическая) и 2) гемолитическая (вспомогательно-индикаторная), которая позволяет установить, произошло ли связывание комплемента в первой системе. Ранее в качестве, антигена использовали взвесь бактерий, и в положительных случаях происходил их лизис (бактериолиз), поэтому первая система получила название бактериолитической. Следовательно, в основу РСК легли два явления – бактериолиз и гемолиз.

РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитическую систему – в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемую инактивированную сыворотку с антигеном, добавляют комплемент в строго определенном количестве (титре). Смесь антиген – антитело (сыворотка) – комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) при 37–38 °С на 20–40 мин. Далее приступают ко второму этапу реакции – во все пробирки добавляют компоненты второй гемолитической системы и вновь ставят в водяную баню на 15–20 мин. Затем учитывают предварительный результат (есть или нет гемолиза), оставляют при комнатной температуре до следующего дня и производят окончательный учет РСК. Отсутствие гемолиза (положительный диагностический результат) свидетельствует, что в испытуемой сыворотке имеются антитела, специфичные взятому антигену, комплекс антиген – антитело в первой системе образовался, комплемент связался. Добавляют компоненты второй системы – гемолизин и эритроциты, которые один по отношению к другому тоже являются антигеном (эритроциты) и антителом (гемолизин) и взаимодействуют в присутствии комплемента. Если же в исследуемой сыворотке нет антител, специфичных к взятому антигену, комплекс антиген – антитело не образуется и комплемент в первой бактериолитической системе не адсорбируется, остается в пробирке свободным, то при добавлении второй (гемолитической) системы комплемент взаимодействует с комплексом антиген – антитело (гемолизин – эритроциты) и происходит гемолиз (лизис эритроцитов). Диагностический результат отрицательный. Таким образом, в РСК участвуют 5 компонентов: антиген, антитело (исследуемая сыворотка), комплемент, гемолизин, взвесь эритроцитов барана. Для разведения всех компонентов используется электролитная среда–физраствор NaС1.

Для постановки РСК в диагностической лаборатории необходимо следующее: пробы сывороток от животных, поступившие в лабораторию для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, гипериммунные, обеспечивающие положительный результат – для контроля) и две нормальные сыворотки от здоровых животных – также для контроля (все сыворотки в разведении 1 : 10 инактивируют для разрушения их собственного комплемента нагреванием в водяной бане при 56–58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру (указанному биофабрикой на упаковке); комплемент (сыворотка морской свинки) в разведении соответственно установленному титру (при титрации); гемолизин в рабочем титре; взвесь эритроцитов барана в разведении 1 : 40, физиологический раствор, градуированные пипетки различной емкости, пробирки, штативы, водяная баня, резиновые груши.

источник

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях явля­ются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, коль­цевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зве­рей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях до­пускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови круп­ного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разво­дят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки кро­ви овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сы­воротки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом раз­ведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнат­ной температуре и учитывают результат общепринятым способом (техни­ку постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические ре­акции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положи­тельную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рога­того скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомни­тельных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международ­ных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. По­этому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыво­ротка, по отношению к которой определяют активность национальных ан­тигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным нацио­нальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяй­ства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллез­ных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диаг­ностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных пока­заниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ра­нее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнитель­ными методами уточняют специфичность результатов РА.

Читайте также:  Количественная серологическая реакция при диагностике бруцеллеза

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) жи­вотных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследу­ют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где про­водилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне ан­тител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае живот­ных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бен­гальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого ско­та, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вно­сят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследо­вании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл ан­тигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл анти­гена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учи­тывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использовани­ем кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специ­фичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, вер­блюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических ре­акций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты пе­ремешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

«+++» Четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, молоко белое Результат положительный
«++» Достаточно выраженное синее кольцо в слое сли­вок, остальная часть молока имеет синеватый цвет Результат положительный
«+» Синее кольцо в слое сливок выражено слабо, столбик молока имеет синий цвет Результат сомнительный
«-» Столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, слой сливок белого или желтоватого цвета Результат отрицательный

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследо­вания в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицатель­ный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоро­выми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцел­леза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по ди­агностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постанов­ке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный анти­ген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принима­ется за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разве­денными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разде­ле «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемо­лиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют че­рез 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благопо­лучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — жи­вотных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у жи­вотных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. По­лучение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота пред­полагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном слу­чае результат исследования считают отрицательным («Наставление по ди­агностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вак­цины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирую­щих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифичес­ких реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полу­ченных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в не­благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в пе­риферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие ли­нии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают по­ложительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, ус­танавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использо­ванием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыво­ротки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаж­дают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измель­чают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопро­водной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% ага­ра и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вно­сят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, сте­рилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется приме­нять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогре­вают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют сте­рилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного ро­гатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Сре­да рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

Читайте также:  Симптомы болезни бруцеллеза у человека

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник

1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.

Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).

Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).

От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.

1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.

1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:

— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;

— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.

При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);

— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;

— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.

1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.

Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.

Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.

Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.

1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.

2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 — 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 — 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.

2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок — путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 — 7 мл (от пушных зверей по 1 — 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 — 10 °С. Через 20 — 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 — 4 ч и повторно через 10 — 12 ч).

Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (2 — 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 — 8 °С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки — в течение 3 сут. после однократного оттаивания.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 — 10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 — 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.

При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование

Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.

При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину

засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую

— в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%)

в СО -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные

условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками

Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 — 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

Читайте также:  Массовое заболевание людей бруцеллезом

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.

Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 — 7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

+ (1 крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S- бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S- бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R — бруцеллезной сывороткой.

3.5. Биологическое исследование

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 — 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 — 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.

— бактериологического — до 1 мес.;

3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.

3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);

— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:

— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);

++ (2 креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен (50% агглютинации);

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 — 200 МЕ и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз — 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак — 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 МЕ и выше.

При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 — 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 — 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.

При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 — 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.

При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.

При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 — 4 креста — «положительная» 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 — 4 креста — «сомнительная» 100 МЕ).

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.

4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:

— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);

— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов — 64 — 65, буйволов — 62 — 64, свиней — 58 — 60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);

— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 — 4% борной кислоты).

Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 — 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 — 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;

— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);

— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 — 38 °С в течение 15 — 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;

— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 — 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

источник