Меню Рубрики

Реакция рбп при бруцеллезе

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях явля­ются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, коль­цевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зве­рей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях до­пускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови круп­ного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разво­дят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки кро­ви овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сы­воротки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом раз­ведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнат­ной температуре и учитывают результат общепринятым способом (техни­ку постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические ре­акции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положи­тельную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рога­того скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомни­тельных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международ­ных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. По­этому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыво­ротка, по отношению к которой определяют активность национальных ан­тигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным нацио­нальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяй­ства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллез­ных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диаг­ностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных пока­заниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ра­нее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнитель­ными методами уточняют специфичность результатов РА.

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) жи­вотных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследу­ют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где про­водилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне ан­тител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае живот­ных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бен­гальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого ско­та, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вно­сят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследо­вании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл ан­тигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл анти­гена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учи­тывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использовани­ем кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специ­фичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, вер­блюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических ре­акций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты пе­ремешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

«+++» Четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, молоко белое Результат положительный
«++» Достаточно выраженное синее кольцо в слое сли­вок, остальная часть молока имеет синеватый цвет Результат положительный
«+» Синее кольцо в слое сливок выражено слабо, столбик молока имеет синий цвет Результат сомнительный
«-» Столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, слой сливок белого или желтоватого цвета Результат отрицательный

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследо­вания в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицатель­ный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоро­выми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцел­леза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по ди­агностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постанов­ке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный анти­ген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принима­ется за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разве­денными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разде­ле «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемо­лиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют че­рез 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благопо­лучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — жи­вотных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у жи­вотных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. По­лучение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота пред­полагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном слу­чае результат исследования считают отрицательным («Наставление по ди­агностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вак­цины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирую­щих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифичес­ких реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полу­ченных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в не­благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в пе­риферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие ли­нии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают по­ложительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, ус­танавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использо­ванием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыво­ротки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаж­дают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измель­чают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопро­водной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% ага­ра и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вно­сят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, сте­рилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется приме­нять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогре­вают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют сте­рилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного ро­гатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Сре­да рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Читайте также:  Роз бенгал проба на бруцеллез

источник

Gard — test (РБП) продолжена Р. Nicoletti в 1967 г., принцип реакции состоит в том, что присходит взаимодействие антигена с антителом, это является основой многих реакций и по своей сущности весьма подобен РА за исключением того, что этот антиген окрашен Rose Bengal, но краситель можно заменить другим кислотоустойчевым красителем (РН — 3,65) и применяется он как экспресс — метод, диагностическую ценность которого отмечают многие исследователи [34].

Также высокую чувствительность и специфичность РБП отмечают и другие исследователи.

В постсоветском пространстве РБП — тест начали применять с 1978 года [35].

Основой высокой активности названного теста является РН среды (РН — 3,65) в этих условиях создаются условия для проявления активности IgG, участвующего в реакции связывания комплемента.

При этом высокую активность и специфичность многие ученые объясняют этому способствует кислая среда антигена. [36].

Несмотря на положительные отзывы, ряд исследований отмечают недостаточную диагностическую ценность РБП — теста другие отмечают достаточно — высокую диагностическую ценность [37].

Некоторые ученые утверждают, что позитивные показания РБП — теста совпадают с выделением культуры.

Предложенный для практики тест показал высокую диагностическую активность в условиях производства, но противоречивые высказывания исследователей требуют углубленных исследований как при совершенствовании теста, так и при применении его при различных эпизоотических ситуациях по бруцеллезу животных [38].

Термин «химиотерапевтические средства» связан с ранними этапами развития микробиологии, когда противомикробные препараты получали химическим путем. Несмотря на колоссальное разнообразие химиотерапевтических препаратов их можно объединить в несколько основных групп — в зависимости от происхождения, структуры и механизма действия. Для терапии инфекционных болезней, вызываемых микробами, вирусами и многоклеточными паразитами применяют разные препараты. Именно в таком порядке их и уместно рассматривать.

Из группы антимикробных химиотерапевтических препаратов наибольшее значение в основном антибиотики, аминогликозиды, сульфаниламиды, фторхинелы и др. [39,40].

Отрицательная эпизоотологическая ситуация по бруцеллезу сельскохозяйственных животных создавшаяся в республике требует от научных и практических ветеринарных специалистов срочных неотлагательных мер направленных на купирование инфекционного процесса. При этом наиболее перспективным направлением является антибиотикотерапия. Известно, что не ко всем антибиотикам чувствительны патогенные микроорганизмы, и поэтому перед применением их надо обязательно проверить на чувствительность микроорганизмов (бруцелл) к ним.

Однако при проведении работ мы должны учитывать следующие факторы: действие антибиотиков в основном кратковременное; одни из них обладают бактериостатическим действием; другие — бактерицидным; одни организмы в основном проживают внутри клетки; другие — внеклеточные.

Многие исследователи пытались при помощи антибиотиков бороться с возбудителем бруцеллеза, получали положительный эффект: другие — нет. Это связано с тем, что возбудитель живет внутри клетки, при длительном персистировании находит такие места обитания, куда затруднен доступ фагоцитов лимфоцитов и других влияний, могущих отрицательно сказаться на их жизнедеятельности. Поэтому кроме веществ пролангирующих действие препарата, необходимо, подбирать вещество усиливающие работу иммунной системы. Работая в этом направлении важно подобрать препараты активизирующие действие иммунной системы (иммуностимуляторы). Насколько правильно будет подобран комплекс препаратов, настолько эффективно будет происходить борьба, борьба за здоровье организма, за купирование инфекционного процесса и снижение риска распространения ее среди других животных [41,42].

При подборе иммуностимуляторов необходимо подбирать такие стимуляторы, которые заставили работать иммунную систему, даже при высоком иммунодефиците.

К антибиотикам тетрациклинового ряда чувствительны хламидии, микоплазмы, грам-положительные, грам-отрицательные кокки и многие другие микроорганизмы, в том числе бруцеллы [43].

Доксициклин эффективен при борьбе со стрептококками, стафилококками, гонококками возбудителями хламидиоза, туляремии, бруцеллеза и др.

В настоящее время многие ученые пришли к выводу, что наиболее перспективным антибиотиком в борьбе с бруцеллезом является антибиотики тетрациклинового ряда или в сочетании их со стрептомицином [44].

Но несмотря на высокую перспективность весьма важным является его высокая стоимость. Поэтому изыскание препаратов, сочетанного применения их, снижающих себестоимость профилактической дозы, архиважно для ветеринарной практики.

Важнейшей задачей научных работников является совершенствование способов и путей купирования развития инфекционного процесса, снижение риска миграции возбудителя во внешнюю среду, в организм здорового животного и человека. Как было сказано выше, работы в этом направлении ведутся, но не достаточно активно. Поэтому изыскание перспективных препаратов, снижающих риск угрозы распространения инфекции, защищающих организм животных от внедрения ее в организм — перспективное направление.

Со времени открытия возбудителя бруцеллеза прошло много времени. Ученые обстоятельно изучили бруцеллез животных, людей и пришли к выводу, что это серьезная проблема для сельского хозяйства и складывается она с огромных экономических потерь, также это проблема для государства. Это связано с тем, что государство, имея неблагополучные по бруцеллезу хозяйства не может свободно вести торговлю в другие государства продукцию животноводства. Кроме того, известно, что у больных людей происходят самые разнообразные климатические проявления, связанные с поражением опорно-двигательной, мочеполовой, сердечнососудистой, желудочно-кишечной, центрально-нервной систем. В связи с этим у людей нарушаются зрительная, слуховые функции, появляются проблемы с центральной нервной системой (до инфарктов, инсультов и др.), желудочно-кишечной (до язв желудка, нарушения функции печени и др.), мочеполовой-системой (до нарушения детородной функций) и многое другое.

Клинически бруцеллез у крупного рогатого скота проявляется в виде абортов у стельных животных и в редких случаях нарушением в виде опорно-двигательной системы (артриты и др.), орхитов у мужских особей.

До настоящего времени борьба с бруцеллезом складывалась в основном из выявления возбудителя, прерывание путей передачи и профилактика восприимчивых животных.

В КХ «Нур» Бурлинского района был разработан «Комплексный план по профилактике и борьбе бруцеллезом сельскохозяйственных животных на 2006-2012 годы по Бурлинскому району».

План по профилактике и борьбе с бруцеллезом сельскохозяйственных животных при полном выполнении указанных мероприятий достаточно эффективный, но сложность его выполнения приводит тому, что в основном в области усугубляется эпизоотическая ситуация по бруцеллезу крупного рогатого скота.

В связи с этим многие ученые предлагают свои (разработанные или) меры борьбы с нею [45].

Современное время борьба с бруцеллезом животных стала сложнее по причине того, что на смену крупным специализированным по выращиванию одного вида хозяйствам пришли в основном, мелкие фермерские хозяйства, что затрудняет соблюдение таких норм, как движение животных с учетом пола, возраста, даже вида. Усложняют прогнозированию эпизоотической ситуации в районе, регионе, бесконтрольная миграция животных связанная с куплей, продажей, создание новых сельхозформирований, распадом их.

Поэтому важным является изменение тактики борьбы с бруцеллезом в зависимости от создавшейся ситуации [46].

источник

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РБП С в- И РА С И-БРУЦЕЛЛЕЗНЫМИ АНТИГЕНАМИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук. ■

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Дегтяренко Людмила Владимировна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Храмцов Виктор Викторович,

доктор ветеринарных наук Альбертян Мкртич Погосович

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная

Защита состоится « 29 » февраля 2012 г. в «Р » часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при ХНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Каликин, Игорь Николаевич, Омск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РБП С 8- И РА С К- БРУЦЕЛЛЕЗНЫМИ АНТИГЕНАМИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук Дегтяренко Л.В.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Лабораторная диагностика бруцеллеза Бактериологическое исследование Полимеразная цепная реакция (ПНР) Серологические методы Реакция агглютинации пробирочная (РА) Роз бенгал проба (РБП) Реакция связывания комплемента (РСК) Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) Реакция иммунодиффузии (РИД)

Серологическая диагностика бруцеллеза животных инфицированных диссоциированными (К) формами бруцелл

Дифференциальная диагностика больных бруцеллезом животных от иммунизированных противобруцеллезными вакцинами

Заключение к обзору литературы

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка эффективности РБП с 8-бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза животных, в том числе в условиях широкого использования слабоагглютиногенных противобруцеллезных вакцин

Изучение диагностической ценности РБП в опыте на морских свинках, сенсибилизированных разными штаммами бруцелл

Результаты испытания РБП при бруцеллезе животных в

Результаты испытания специфичности РБП на крупном и мелком рогатом скоте

Результаты изучения диагностической чувствительности РБП в неблагополучных по бруцеллезу гуртах крупного рогатого скота

Результаты испытания РБП в неблагополучных по бруцеллезу отарах овец

Результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РБП при обследовании животных, иммунизированных вакциной из штамма В. abortus 82, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах Результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РБП у крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма В. abortus 82, в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах

Изучение эпизоотической опасности животных, положительно реагировавших в РБП Дифференциально-диагностическая эффективность РА с R-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях Изучение специфичности R-бруцеллезного антигена для РА Изучение диагностической ценности R-бруцеллезных антигенов в опыте на морских свинках Изучение дифференциально-диагностической

эффективности R-бруцеллезного антигена РА в производственных условиях

Изучение диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена РА в благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота,

иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82, 75/79-АВ

2.3.3.2. Изучение диагностической эффективности R-бруцеллезного антигена для РА при обследовании крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82, 75/79-АВ, в неблагополучных по бруцеллезу стадах

2.3.3.3. Изучение иммунного ответа у телочек, иммунизированных вакциной из штамма В. abortus 82 96

2.4. Изучение диагностической ценности R-бруцеллезных

антигенов для РА и РСК при выяснении эпизоотической ситуации по бруцеллезу крупного рогатого скота 98

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 124

Актуальность темы. Бруцеллез животных продолжает оставаться актуальным в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношении.

Несмотря на достигнутые в последнее десятилетие успехи по его ликвидации в Российской Федерации, во многих Федеральных округах сохраняются стационарно неблагополучные пункты и появляются новые. Так, в течение 2010 г. на территории России было выявлено 223 новых неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота пункта, из них на конец года оставалось 112 (О.Д. Скляров, 2011).

В настоящее время повышается вероятность появления новых очагов

бруцеллезной инфекции, как среди крупного рогатого скота, так и среди овец

по разным причинам, в т.ч. в связи с заносом источника возбудителя из сопредельных территорий.

В ранее оздоровленных стадах и отарах рецидивы инфекции могут быть связаны с латентно больными животными из-за несовершенства официальных диагностических реакций (РА, РСК, РИД) о которых сообщали К.В. Шумилов с соавт. (1981), Н.П. Иванов (1987), О.Д. Скляров (2005), М.П. Альбертян, М.И. Искандаров, А.И. Федоров (2006) и др., в том числе в связи с изменчивостью антигенной структуры возбудителя и переходом его в менее вирулентные формы — R-, L- (П.А. Триленко, 1976; И.А. Косилов, Л.В. Дегтяренко, 1987; В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко 1988 и др.).

При массовой диагностике бруцеллеза животных, особенно в условиях отгонного животноводства, предпочтительно применение экспресс-методов, доступных по цене, простых в исполнении, не требующих дорогостоящего оборудования, обеспечивающих объективную постановку диагноза и максимальное выявление эпизоотически опасных животных.

Кроме того, в связи с применением в системе противобруцеллезных мероприятий живых вакцин из слабоагглютиногенных штаммов В. abortus 82

И 75/79-AB экспресс-методы диагностики бруцеллеза должны выполнять и дифференцирующую функцию.

В РФ для экспресс-диагностики бруцеллеза у неиммунизированных сельскохозяйственных животных используют роз бенгал пробу (РЕП), эффективность которой подтверждена многими исследователями (JLB Дегтяренко, Б.И. Кондауров, 1978; В.Б. Бельченко, 1980; П.С. Уласевич, А.И. Касьянов с соавт., 1981; К.Д. Дусейнов с соавт., 1989 и др.).

Однако целесообразность использования указанного теста при обследовании крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ, достаточно не изучена.

Поскольку в антигенной структуре вакцин из штаммов В. abortus 82 и

75/79-АВ преобладают R-компоненты, при определении реактогенных

свойств вакцин, реактивности организма привитых животных, проведения

дифференциально-диагностических исследований возникает необходимость

использования R-бруцеллезных диагностикумов, которые до настоящего

времени в ветеринарной практике широко не применяются, хотя РСК с R-

бруцеллезными антигенами была успешно апробирована в производственных

условиях (A.M. Фомин, Д.А. Хузин, 1989; Л.В. Дегтяренко, 1977, 2005- ИП

Никифоров, 1995; С.К. Димов, 1997; В.В. Сочнев, 2004; K.M.; Салмаков с соавт., 2007; М.Ю. Карлова, 2010 и др.).

Сведения о целесообразности применения РА с R-бруцеллезным диагностикумом для оценки иммунного статуса крупного рогатого скота, иммунизированного слабоагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ крайне ограничены.

Вышеизложенное и определило направленность исследований.

Цель исследований. Цель исследования — изучение эффективности РБП с S- и РА с R-бруцеллезными антигенами при диагностике бруцеллеза животных, в том числе в условиях широкого использования живых слабоагглютиногенных противобруцеллезных вакцин.

— изучить эффективность РБП с Б-бруцеллезным антигеном в экспресс-диагностике бруцеллеза животных, в том числе после их иммунизации живыми слабоагглютиногенными вакцинами;

— изучить дифференциально-диагностическую эффективность РА с Я-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях.

Научная новизна. Выявлено соответствие показаний РБП с

биофабричным Б-бруцеллезным антигеном при оценке степени

выраженности реакции в крестах и других официальных серологических

тестов у животных при их искусственном и естественном заражении вирулентными бруцеллами.

Доказана возможность использования РБП с биофабричным бруцеллезным антигеном при оценке степени выраженности реакции в крестах у крупного рогатого скота через 2 и более месяцев после иммунизации вакциной из слабоагглютиногенного штамма В.аЬоПш 82 в качестве дифференциально-диагностического экспресс-метода при эпизоотической оценке стад по бруцеллезу.

В экспериментальных и производственных условиях подтверждено

дифференциально-диагностическое значение РА с Л-бруцеллезным

антигеном, установлена целесообразность ее использования при

осуществлении контроля иммунного ответа и эпизоотической оценке по

бруцеллезу животных, иммунизированных слабоагглютиногенными вакцинами.

Практическая и теоретическая значимость работы. Внедрение в ветеринарную практику экспресс-теста — РБП по предлагаемой методике оценки степени выраженности реакции позволит проводить дифференциальную эпизоотическую оценку животных по бруцеллезу через 2 и более месяцев после иммунизации их слабоагглютиногенными вакцинами.

Применение РБП с учетом степени выраженности реакции в крестах даст возможность более эффективно осуществлять контроль благополучия по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и оздоровление неблагополучных пунктов за счет своевременного и объективного удаления источников возбудителя инфекции.

Применение R-бруцеллезного антигена в РА позволит контролировать иммунный ответ (реактогенность вакцин) у крупного рогатого скота, иммунизированного вакцинами из штаммов В. abortus 82, 75/79-АВ, что повысит качество вакцинопрофилактики. Комплексное использование R-бруцеллезных антигенов в РА и РСК повысит эффективность дифференциально-диагностических исследований и значительно снизит экономический ущерб при проведении оздоровления неблагополучных по бруцеллезу хозяйств за счет исключения необоснованного убоя животных с поствакцинальными реакциями.

Читайте также:  Анализ на бруцеллез у человека где сдать

Результаты научных исследований могут быть использованы при изучении патогенеза бруцеллеза животных, инфицированных типичными (S-) и диссоциированными (R, RS, SR) формами бруцелл.

Апробация полученных результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 7-й межрегиональной научно-практической конференции «Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала» (Омск, 2008); международной научно-практической конференции «Развитие АПК азиатских территорий» (Новосибирск, 2008); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционных и незаразных патологий животных» (Омск, 2010); международной научно-практической конференции «Инфекционная патология животных» (Омск, 2011).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи — в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ

(«Достижение науки и техники АПК», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 6 рисунками. Список литературы включает 202 источника, из них 44 — зарубежных.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований использованы для разработки методических рекомендаций по дифференциальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными вакцинами (прот. № 7 от 24.11.2006 г.); по контролю иммунного ответа крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 (прот. № 5 от 28.11.2007 г.); комплексу противоэпизоотических мероприятий по профилактике и ликвидации хронических болезней животных (прот. № 9 от 15.11.2008г.), утвержденных секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК Омской области при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области; «Контроль поствакцинального иммунного ответа у крупного рогатого скота, иммунизированного противобруцеллезными слабоагглютиногенными вакцинами из штаммов 82, 75/79-АВ» (прот. № 4 от 1 о. 11.2009), утвержденных подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Основные положения, выносимые на защиту:

— результаты изучения эффективности РБП с 8-бруцеллезным антигеном в экспресс-диагностике бруцеллеза животных, в том числе после их иммунизации живыми слабоагглютиногенными вакцинами-

результаты изучения дифференциально-диагностической эффективности РА с Я-бруцеллезным антигеном при бруцеллезе животных в экспериментальных и производственных условиях.

1.1. Лабораторная диагностика

Специфическую диагностику бруцеллеза у животных проводят с использованием различных иммунологических реакций. Диагноз на бруцеллез ставят, основываясь на результаты бактериологического, серологического, аллергического, молекулярно-генетического исследований.

1.1.1. Бактериологическое исследование

Международным подкомитетом по таксономии бруцелл было признано шесть видов бруцелл, вызывающих инфекции у животных: В. abortus, В. melitensis, В. suis, В. neotome, находящиеся в S-форме, и В. canis, В. ovis в R-форме (шестой доклад экспертов по бруцеллезу ФАО-ВОЗ, 1986).

С прогрессирующим развитием новых методов типирования бактерий

происходит процесс расширения рода Brucella. В настоящее время признано

десять разновидностей в пределах рода Brucella: В. abortus, В. melitensis, В. suis,

В. neotome, В. canis, В. ovis, В. ceti, В. pinnipedialis, В. microti, В. inopinata (М.И. Искандаров, 2012).

Бактериологический метод включает микроскопические и бактериологические исследования, в необходимом случае постановку биопробы.

Культуры бактерий, обладающие типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, дающие положительную РА с S- и R-бруцеллезными сыворотками, относят к бруцеллам.

Виды бруцелл дифференцируют по способности роста в отсутствии повышенной концентрации С02, выделению HS2, чувствительности к фагу Тб, бактериостатическому действию анилиновых красителей и агглютинации моноспецифическими сыворотками.

Применение вакцины из штамма В. abortus 82, обладающей выраженными абортогенными свойствами, на маточном поголовье крупного рогатого скота, а также длительная приживаемость его в организме иммунизированных животных вызвало необходимость дифференциации культур бруцелл, выделенных из органов и плодов привитых животных. Автором вакцины разработана схема дифференциации культур бруцелл, включающая ряд основных биологических признаков. Однако, если учесть выделение значительного количества культур диссоциантов, то можно понять, насколько усложняется дифференциация подобных культур. (Е.А. Тягунина, A.A. Новицкий, 1980).

Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред, концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени, прошедшего с момента заражения животного (К.В. Шумилов с соавт, 1996; Т.С. Мальцев с соавт., 2011). Поэтому отрицательные результаты бактериологического исследования не могут исключать бруцеллез.

Согласно «Рекомендациям по дифференциальной диагностике бруцеллеза и иерсиниоза и мерам их профилактике» (2000), для культивирования бруцелл рекомендованы такие питательные среды, как картофельный агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночный глюкозо-глицириновый агар и бульон (ПГГА, ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицириновый агар (МППГГА), мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), эритрит-агар и др.

С целью подавления посторонней микрофлоры в среды можно добавлять генцианвиолет (1:200000) или кристаллвиолет (1:100000). При исследовании материала от крупного рогатого скота одну часть посевов инкубируют в атмосфере с содержанием 10-15 % С02, другую — в обычных условиях. Для выделения культур В. ovis и В. abortus используют плотные или полужидкие питательные среды, печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар при содержании 10-15 % С02. В. melitensis

растет в обычных атмосферных условиях. Посевы инкубируют при 37-38 °С течение 30 суток.

1.1.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В последние годы для определения ДНК бруцелл в различных объектах используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая впервые была предложена в 1983 г. Мюллесом.

В 1990 году D. Fekete et al. впервые применили метод ПЦР для детекции бруцелл.

В основе метода ПЦР лежит многократное копирование

(амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является

маркерным для данного вида. ПЦР обладает высокой чувствительностью,

позволяет выявить 100-1000 бактериальных клет

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

Читайте также:  Наставление вакцина против бруцеллеза штамм 82

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник

Реакция Хеддльсона (пластинчатый метод)

Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут. Контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации; контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена. Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме: а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100 % агглютинации (4+); б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75 % агглютинации (3+); в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50 % агглютинации (2+); г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+); д) равномерная мутная жидкость (-).

Для оценки результатов рекомендуется следующая схема: а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат «резко положительный»; б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки — результат «положительный»; в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат «сомнительный»; г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — реакция «отрицательная».

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.

Роз-Бенгал проба (РБП)

Роз-Бенгал проба, по сравнению с другими методами серологической диаг­ностики бруцеллеза, обладает следующими преимуществами: большой чувстви­тельностью, способностью в короткие сроки после заражения выявлять специ­фические бруцеллезные антитела и, благодаря кислой реакции антигена, ингибировать проявления неспецифических антител, а также стабильностью показаний, технической простотой постановки, требующей небольшой затраты труда и времени, четкостью и быстротой получаемых результатов.

Сыворотки крови, подлежащие исследованию, должны быть прозрачные, без примеси эритроцитов. Их исследуют не позднее, чем через 4 дня хранения при температуре плюс 4-8 °С.

Допускается исследовать сыворотки, консервированные сухой борной кис­лотой (2 % борной кислоты к объему сыворотки). Консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 14 дней.

Антиген представляет собой суспензию инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в буферном растворе, окрашенных бенгальским розовым в розовый цвет. Расфасован во флаконы из темного стекла, подлежит хранению в темном сухом месте при температуре плюс 4-12 °С. Срок годности антигена при соблюдении условий хранения 18 месяцев со дня его изготовления.

Антиген во флаконах без этикетки (надписи) или с трещинами, содержащий постороннюю примесь, неразвивающиеся хлопья, плесень, с истекшим сроком годности или подвергавшиеся замораживанию, для применения не годен.

Перед употреблением антиген выдерживают 30-40 мин. при комнатной температуре и затем тщательно встряхивают.

Техника постановки Роз-Бенгал пробы: реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках или изразцовых плитках с лунками при комнатной температуре (плюс 18-30 °С).

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки шприцем-полуавтоматом или микропипеткой, которые трижды промывают фенолизированным (карболизированным) физиологическим раствором и подсушивают фильтро­вальной бумагой.

В каждую лунку рядом с сывороткой пипеткой-капельницей вносят равное количество (0,03 мл антигена) и тщательно смешивают активным движением ручного полисмесителя на 5 или 25 проб для получения однородной смеси, рас­пределяя ее при этом по всей поверхности лунки.

Пластину с внесенными на нее сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного для этой цели. При положительной реакции появляются хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с нормальной (отрицательной) и положительной агглютинирующей сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).

Учет реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 мин. после смеши­вания сыворотки с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Агглютинацию, которая наступает позже, чем через 4 мин — не учитывают.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

При отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена) реакцию считают отрицательной.

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 3 % раствор фенола или 1 %-ный раствор хлорамина, затем тщательно промывают водопроводной водой, высушивают и используют повторно. Для этих целей можно применять кассеты и штативы сушилки.

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование.

По результатам повторного исследования дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

Сыворотки, с которыми получена положительная РБП, исследуют в РА и РСК (РДСК) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют.

Кольцевая реакция с молоком

Кольцевая реакция применяется с целью ориентировочной проверки благо­получных по бруцеллезу молочных стад и для проверки молока на рынках.

Сущность кольцевой реакции заключается в том, что в молоке бруцеллезных животных при добавлении антигена образуется комплекс антитела с антигеном, который адсорбируется жировыми частицами молока. Жировые частицы вслед­ствие своего малого удельного веса поднимаются наверх, увлекая адсорбиро­ванный агглютинат, который в зависимости от цвета антигена образует на по­верхности жидкости окрашенное кольцо.

Для кольцевой реакции применяют цветной антиген Триленко, представ­ляющий взвесь убитых, окрашенных бруцеллезных микробов.

Для исследования необходимо брать цельное, лучше свежее, молоко или консервированное формалином (из расчета 0,1 мл 10 % раствора формалина на 10 мл молока).

В пробирку берут 2 мл молока и добавляют 0,1 мл (2 капли) концентрирован­ного антигена, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню или термостат на 45-50 мин при температуре 37-39 °С.

Учет реакции: а) если в верхней части столбика молока (в слое сливок) четко выражено синее кольцо, а остальная часть молока белая, реакция оценивается положительной — 100 или 75 % агглютинации (+ + + + и + + +); б) при наличии достаточно выраженного синего кольца в слое сливок, а ос­тальная часть молока синеватого цвета, реакция оценивается положительной – 50 % агглютинации (+ +); в) если синее кольцо в слое сливок слабо выражено и весь столбик молока имеет синий цвет, реакция считается сомнительной — 25 % агглютинации (+ и ±); г) если столбик молока равномерно окрашен в синий цвет, а слой сливок ос­тается белым или слегка желтоватым, реакция отрицательная (-).

Молоко от коров с сомнительной реакцией исследуют повторно через 10-15 суток. При получении отрицательного или снова сомнительного результата животных считают благополучными по бруцеллезу.

Пластинчатая реакция агглютинации (исследование молока)

Данная реакция применяется для исследования только свежего молока и молочной сыворотки. Не подлежит исследованию пастеризованное, кипяченое и замороженное молоко (в таком молоке антибруцеллезные агглютинины раз­рушаются), а также молоко, имеющее кислотность выше 30 °С по Тернеру (во избежание получения неспецифических результатов).

Реакцией агглютинации можно исследовать молоко жирное (цельное), обез­жиренное (снятое) и молозиво. Жирное молоко предварительно обезжиривают отстаиванием или центри­фугированием, затем из-под слоя сливок забирают молоко для исследования. Обезжиренное молоко и молозиво исследуют без предварительной подго­товки, но так, чтобы сливок попало минимальное количество.

Обезжиренное молоко наносят на стекло (чашку Петри) в коли­честве 0,1 мл (или двух капель) и 0,05 мл (или одной капли). К каждой дозе испытуемого молока добавляют по одной капле бруцеллезного диагностикума. Реакция сопровождается двумя контролями: к 0,05 мл диагностикума добавляют 0,1 мл физиологического раствора и 0,1 мл испытуемого молока смешивают с 0,05 мл 12 % раствора хлористого натрия. Путем покачивания стекла смеши­вают ингредиенты. Учет реакции производят в первые 3-5 мин.

Положительная реакция агглютинации характеризуется выпадением хлопьев с большим или меньшим обесцвечиванием молока. При отрицательном резуль­тате молоко остается равномерно окрашенным в голубой цвет (цвет антигена).

Исследование молочной сыворотки

Перед получением молочной сыворотки жирное молоко обезжиривают путем центрифугирования или отстаивания. Молочную сыворотку получают при ство­раживании молока сычужным ферментом. Для этого к 5 мл молока добавляют 1-2 капли 10 % сычужного фермента на физиологическом растворе хлористого натрия. Пробирки помещают при температуре 37 °С на 20-30 мин (до свертывания молока). Молочную сыворотку можно получить также путем помещения молока при 37 °С на сутки. Молочную сыворотку сразу отделяют путем фильтрования через бумажный фильтр. Дальнейшие манипуляции: постановка реакции и учет результатов анало­гично постановке и учету реакции агглютинации с цельным молоком.

При оценке результатов исследования молока на бруцеллез при помощи пластинчатой реакции агглютинации необходимо учесть возможность образования мелкохлопчатого агглютината, который из-за мутности молока может быть не отмечен и результаты реакции могут быть приняты за отрицательные. В отри­цательных реакциях рекомендуется молоко исследовать в реакции агглютинации с молочной сывороткой.

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник