Реакция агглютинации на бруцеллез животных

Один из методов лабораторной диагностики — выделение культуры возбудителя от больных с острым бруцеллезом. Для посева используется кровь, реже моча, желчь, костный мозг. Материал засевается на мясо-пептонный агар и мясопептонный бульон с добавлением 1% глюкозы и 2% химически чистого глицерина, а также питательный бульон и агар Д.

Для возбудителей бруцеллеза при выделении их от больных характерен крайне медленный рост на питательных средах. Посев выдерживают при 37°С в течение 30 дней, а в случае выделения В. abortus необходимо присутствие в воздухе повышенного содержания углекислого газа. Бактериологическое исследование длится от 20 до 30 дней.

Выделенные культуры идентифицируются на основании морфологических и культуральных признаков, в реакции агглютинации и фаголизиса.

Иммунологическая диагностика бруцеллеза у человека является ведущей, поскольку бактериологические исследования практически не применяются.

Широкое распространение получили серологические реакции агглютинации, связывания комплемента, непрямой гемагглютинации, опсонофагоцитарная проба, аллергическая проба и, за последнее время, иммунофлуоресцентный анализ.

Реакция агглютинации бруцелл сывороткой больного или переболевшего (и привитого) осуществляется в пробирочном варианте (реакция Райта) и в ускоренном, за 8 минут, на оконном стекле (реакция Хеддльсона).

Первая производится в лабораторных условиях, вторая, как правило, — при массовых полевых обследованиях и не исключает в последующем постановки реакции Райта.
Для обеих реакций применяется стандартный единый бруцеллезный диагностикум.

При постановке реакции Райта положительные результаты учитываются при титре 1:200 и выше, при постановке реакции Хеддльсона положительной считают агглютинацию во второй или третьей дозе (0,02— 0,01 мл сыворотки); агглютинация на 4 креста во всех дозах сыворотки (от 0,04 до 0,01 мл) — результат резко положительный.

Разведения сыворотки в реакции Хеддльсона не сопоставляют с титрами реакции Райта, первая играет в основном роль качественной реакции, о высоте титров агглютининов судят по результатам пробирочной реакции.

Наиболее высокие титры реакции агглютинации наблюдаются обычно через 1—2 месяца от начала заболевания (у 80% обследованных больных), затем они начинают падать. Реакция Райта может сохраняться положительной в течение 3—7 лет после перенесенного заболевания, если данное лицо продолжает находиться в условиях возможной реинфекции. В случае отрицательного или сомнительного результатов реакцию следует повторить через 7—10 дней.

Реакция связывания комплемента при бруцеллезе специфична и более чувствительна, чем реакция агглютинации. Она широко применяется ветеринарными специалистами при обследовании сельскохозяйственных животных. Для повышения чувствительности РСК используют ее модификацию — связывание комплемента при 4°С в течение 18 часов. У людей эту реакцию можно применять с 20-го по 25-й день болезни.

Для выявления неполных (блокирующих) антител при бруцеллезе проводят реакцию Кумбса. На выполнение реакции требуется 18—20 часов. Неполные антитела, в отличие от агглютининов — полных антител, появляются в крови больного раньше и сохраняются дольше, что делает эту реакцию пригодной для целей ранней и ретроспективной диагностики.

За последние годы для определения агглютининов успешно используется реакция непрямой гемагглютинации. В качестве диагностикума служат эритроциты барана или человека О-группы, сенсибилизированные полисахаридным антигеном бруцелл.

Кожно-аллергическая проба при бруцеллезе становится, как правило, положительной на 3-й неделе заболевания, у привитых она нарастает значительно медленнее и достигает 72—90% к 6 месяцам после иммунизации, сохраняясь до 1 года. У больных реакция Бюрне сохраняется много лет после перенесенного бруцеллеза. На практике для текущей или ретроспективной диагностики бруцеллеза у человека или определения иммунологической эффективности прививок, следует проводить комплекс серо-аллергических исследований, которые взаимно дополняют друг друга.

Молоко больных коров, коз и овец может содержать агглютинины к бруцеллезному антигену. Для их выявления обезжиренное свежее молоко или молочная сыворотка исследуются по реакции Хеддльсона с единым бруцеллезным диагностикумом. Для этой же цели, но с цельным молоком, применяется так называемая кольцевая реакция (КР), сущность которой заключается в том, что применяют специальный окрашенный бруцеллезный антиген.

При наличии в молоке специфических агглютининов они соединяются с антигеном, образуя в верхней части пробирки (где скапливаются сливки) окрашенное кольцо, остальная часть молока остается неокрашенной. КР в настоящее время приобретает все большее значение как полевая ориентировочная серологическая проба на бруцеллез и представляет интерес как для медицинских, так и для ветеринарных работников.

В настоящее время при помощи флуоресцирующих бруцеллезных антител можно выявить бруцеллы из разнообразных субстратов — воды, крупяных продуктов, молока, брынзы, абортированных плодов, а также непрямым методом можно выявить антитела в сыворотке .крови больных, переболевших или привитых. В последнем случае положительным следует считать свечение бруцелл на 2—3 креста при разведении сыворотки 1:10—1:20. По некоторым данным, в реакции иммунофлуоресценции можно обнаружить специфические антитела в 2,5 раза чаще, чем в реакции Райта.

Опсонофагоцитарная реакция (ОФР) основана на способности сегментоядерных нейтрофилов фагоцитировать бруцеллы благодаря наличию в крови больного специфических опсонинов, нарастающих в процессе инфекции или иммунизации. Реакцию ставят с нейтрофилами крови больного или привитого со специальным антигеном (взвесь убитых бруцелл в физиологическом растворе без консерванта).

На проведение реакции уходит 1 час. Подсчитывают количество фагоцитированных бруцелл в 25 лейкоцитах. Если общее количество этих бруцелл более 25, реакцию считают ясно положительной, от 50 до 75 бруцелл — резко положительной. У здоровых людей показатель ОФР не превышает 5.

Некоторые данные свидетельствуют о высокой результативности ОФР. У больных она бывает положительной в 95,4% случаев, у переболевших—в 100%, у работников боен — в 57%, у ветработников — в 72%, у контактировавших с животными — в 5%. ОФР имеет также и прогностическое значение, показатели ее увеличиваются к периоду выздоровления или при хорошо компенсированном инфекционном процессе. ОФР при бруцеллезе воспроизводится не менее длительно, чем реакция Райта.

Широко применяется кожно-аллергическая проба с бруцеллином (реакция Бюрне), которая дает положительные результаты у больных, переболевших и привитых. Постановку и учет пробы проводят как обычно. Средний размер кожной реакции (гиперемии и инфильтрата), отмечаемой через 24 часа, — 4×6 см. Диагностическое значение имеет инфильтрат не менее 2×3 см через 24 часа.

— Читать «Профилактика бруцеллеза и противоэпидемические меры»

Оглавление темы «Бруцеллез. Сибирская язва»:

Профилактика сальмонеллеза и противоэпидемические меры
Бруцеллез — история, география, возбудители
Источник бруцеллеза и его резервуар
Клиника бруцеллеза у животных и человека
Лабораторная диагностика бруцеллеза
Профилактика бруцеллеза и противоэпидемические меры
Сибирская язва — история, география, возбудители
Источник сибирской язвы и ее резервуар
Клиника сибирской язвы у животных и человека
Лабораторная диагностика сибирской язвы

•Предисловие
•I. Краткие сведения об инфекции и иммунитете
•II. Бактерийные препараты и химиотерапевтиче- ские средства, применяемые в ветеринарной практике
•Вакцины
•Вакцины, изготовленные из ослабленных живых (матриксов) культур
•Вакцины, изготовленные из культур, убитых формалином
•Вирусы. Используемые для вакцинации
•Иммунные сыворотки, применяемые для серотерапии и серопрофилактики
•Средства, применяемые для диагностической цели
•Препараты, применяемые для диагностических реакций на животных
•Препараты, применяемые для лабораторных диагностических реакций
•Химиотерапевтические препараты
•III. Хранение и транспортировка прививочных средств
•IV.Инструментарий, применяемый при прививках
•V. Организация и техника проведения прививок организация прививок
•Фиксация животных
•Подготовка препаратов и инструментария
•Способ введения препаратов
•VI. Предохранительные, лечебные и вынужденные прививки
•1. Прививки против сибирской язвы
•Предохранительные прививки
•Вынужденные прививки
•Комбинационные прививки
•Пассивные прививки
•Возможные осложнения при прнпивках
•Учёт результатов прививок
•Производство прививок против сибирской язвы северным оленям
•2. Прививки против эмфизематозного (шумящего) карбункула
•3. Прививки против паратифа и колибациллеза телят
•4. Прививки против рожи свиней
•Способ применения
•Возможные осложнения после прививки
•Учет результатов
•5. Прививки против паратифа поросят
•6. Прививки против дизентерии ягнят
•7. Прививки против столбняка
•8. Прививки против геморрагической септицемии сельскохозяйственных животных и холеры птиц
•9. Прививки при мыте лошадей
•10. Прививки против чумы свиней
•11. Прививки против оспы овец
•12. Прививки против чумы крупного рогатого скота
•13. Прививка против бешенства
•14. Прививки крупного рогатого скота против перипневмонии
•15. Прививки против оспы-дифтерита птиц
•VII. Аллергические реакции у животных
•1. Диагностика туберкулёза у крупного рогатого скота. Свиней и птиц
•Внутрикожная нроба у крупного рогатого скота
•Внутрикожная туберкулинизация у свиней
•Глазная туберкулинизация
•Подкожная туберкулинизация
•Диагностика туберкулёза птиц с помощью туберкулина
•2. Диагностика сапа у однокопытных животных с помощью маллеина
•Глазная маллеинизация
•Подкожная маллеинизация
•3. Диагностика бруцеллёза у овец и коз с помощью бруцеллизата
•4. Диагностика бруцеллёза у крупного рогатого скота с помощью абортина
•VIII. Серологические методы лабораторной диагностики
•1. Методика постановки реакции преципитации на сибирскую язву
•2. Методика постановки реакции агглютинации (реакции райта) на бруцеллёз сельскохозяйственных животных
•8. Методика постановки реакции агглютинации при инфекционном аборте лошадей
•4. Методика постановки реакции агглютинации со свежей каплей крови при диагностике бациллоносителей белого поноса у кур
•5. Методика постановки реакции связывания комплемента при бруцеллезе
•Компоненты реакции
•Титрация компонентов реакции
•Титрация гемолизина
•Титрация комплемента в гемолитической системе
•Титрация комплемента в бактериологической системе
•Титрация бруцеллёзного антигена
•Примерный результат реакции
•Главный опыт
•Оценка результатов реакции
•6. Методика постановки реакции связывания комплемента при сапе
•Компоненты реакции
•Титрация компонентов реакции
•Титра ция гемолизина
•Титрация комплемента в гемолитической системе
•Титрация комплемента в бактериологической системе
•Разведение комплемента для главного опыта
•Главный опыт
•Титрация сапного антигена
•7. Методика постановки рск при перипневмонии крупного рогатого скота
•Титрация компонентов реакции
•Титрация комплемента в гемолитической системе
•Титрация комплемента в бактериологической системе
•Разведение комплемента для главного опыта
•Титрация антигена
•Главный опыт
•Учёт реакции
•8. Методика постановки реакции связывания комплемента при случной болезни
•Титрация компонентов реакции
•Титрация гемолизина
•Титрация комплемента в гемолигической системе
•Подтитровка комплемента на сыворотках
•Разведение комплемента в установленном титре
•Главный опыт
•Титрация трипанозомного антигена
•IX. Применение химиотерапевтических препаратов
•1.Применение наганина
•Техника приготовления раствора наганина
•Техника введения раствора
•Применение наганина с профилактической целью
•Применение наганина с лечебной целью
•Терапия осложнений после лечения
•2. Применение новарсенола
•3. Применение, флавакридина (трипафлавина, акрифлавина. Эифлавина)
•Способ применения и возможные осложнения
•4. Применение трипанблау (трипансинь)
•Признаки побочного действия трипанблау
•Профилактическое применение трипанблау
•Лечебное применение трипанблау
•Техника приготовления растворов
•5. Применение альбаргина
•6. Применение новоплазмина (лп4)
•7. Применение сульфантрола (сульфамид — с55)
•8. Применение пироплазмина (акаприн)
•

Реакция агглютинации— РА(от лат. aggluti-natio — склеивание) — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекуляр-ных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, име-

ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль
ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта,
Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак
ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диа-гностикумов (О- и //-антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно

реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предложено А. Кастелляни (1902).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглюти-нации (РНГА, РПГА)основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка (рис. 13.2). При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Иногда применяют антительные эритроцитарные диагнос-тикумы, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулиничес-кий токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА). РНГАприменяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.

Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство кFc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (рис. 13.3). РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (см. разд. 10.1.4.1) с помощью агглютинации эритроцитов антителами иммунной сыворотки против антигенов групп крови А (II), В (III).Контролем служат: сыворотка, не содержащая антител, т. е. сыворотка АВ (TV) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эритроциты группы 0 (I).

В реакции агглютинации для определения резус-фактора (см. разд. 10.1.4.1) используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные ирезус-отрицательные эритроциты всех групп крови.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисо-судистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с

резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему анти-резусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов (рис. 13.4). С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Дата добавления: 2016-02-04; просмотров: 1356;

Клинический подход к пациенту с желтухой должен базироваться на понимании метаболизма билирубина (рис. 14-2, 14-3).

Первый этап метаболизма билирубина заключён в распаде эритроцитов в ретикулоэндо- телиальной системе с выделением гема и образованием неконъюгированного (непрямого) билирубина.

Он относительно малорастворим и его обнаружение в сыворотке требует добавления спирта в качестве растворителя перед проведением реакции с диазореактивом в реакции Ванденберга. Добавление спирта — основа непрямой реакции Ванденберга. В норме билирубин в крови пребывает почти исключительно в этой форме. Любое усиление гемолиза может вызывать желтуху, но так как неконъюгированный билирубин плохо растворим в воде, он не появляется в моче, и поэтому гемолитическую желтуху также называют ахолурической. С другой стороны, конъюгированный билирубин растворим в воде и, следовательно, способен реагировать напрямую с реактивом в реакции Ванденберга и попадать в мочу. Ги- пербилирубинемию с повышением конъюгированного билирубина наблюдают при всех видах обструктивной желтухи.

Неконъюгированный билирубин в крови пребывает в связанном с белками виде, преимущественно с альбумином. При вытеснении его из связи с белком он, обладая аффинитетом к липидам, может проникать в головной мозг у новорождённых, но у взрослых он не проходит через гематоэнцефалический барьер. Некоторые препараты, например, сульфонамиды и салицилаты, способны воздействовать на связь билирубина с белком. У новорождённых при развитии физиологической желтухи, вызванной незрелостью конъюгирующих ферментов печени, назначение таких лекарственных средств иногда усиливает тяжесть желтухи и может спровоцировать развитие ядерной желтухи.

На следующем этапе билирубин захватывается печёночными клетками и переносится в эндоплазматический ретикулум, где находится фермент глюкуронил трансфераза. Здесь происходит конъюгация билирубина с глюкуро- нидом с образованием конъюгированного водорастворимого (прямого) билирубина. Нарушения на этих этапах обусловливают развитие врождённых гипербилирубинемий, из которых чаще всего встречают болезнь Жильбера. Данная патология наследуется по аутосомно-до- минантному типу. Преимущественно нарушен захват неконъюгированного билирубина печёночными клетками, но в некоторых случаях
возможен и дефект собственно конъюгиро- вания. В этом случае производство фермента глюкуронил трансферазы может быть индуцировано фенобарбиталом. Мужской папоротник, использовавшийся для лечения глистной инвазии, влияет на транспортировку билирубина в эндоплазматический ретикулум, а новобиоцин® воздействует на конъюгирование, что также приводит к развитию желтухи.

Конъюгированный билирубин затем накапливается в гепатоцитах и экскретируется в канальцы и далее переносится в более крупные ветви билиарного дерева.

Наследственный дефект экскреции по типу гипербилирубинемии болезнь Дубина—Джонсона характеризует коричнево-чёрное окрашивание печени, возмож
но, за счёт меланина. Контраст, применяемый для холецистографии, конкурирует с конъюгированным билирубином и поэтому при наличии его избытка он не концентрируется и даже может усиливать желтуху. Метилтестостероновая желтуха (а также желтуха, вызванная другими препаратами С17-алкилированного тестостерона для приёма внутрь) возникает из-за нарушения канальцевой экскреции билирубина. Данный феномен зависит от дозы, в отличие от внутрипечёночного холестаза по механизму гиперчувствительности, наблюдаемого у некоторых больных, принимающих фенотиазины.

Практически весь конъюгированный билирубин экскретируется в ЖКТ, где превращается в стеркобилиноген, а затем в стеркобилин. Не-

которая часть стеркобилиногена всасывается из кишечника и снова экскретируется с жёлчью. Определённая доля экскретируется с мочой в виде уробилиногена мочи. При неспособности печёночных клеток повторно экскретировать стеркобилиноген возникает избыток уробилиногена мочи, что является простым, но очень чувствительным методом для оценки функции печени. Это также имеет существенное значение для проведения дифференциальной диагностики при желтухе. Наличие полной обструкции любой этиологии предполагает исчезновение уробилиногена из мочи, так как жёлчь не попадает в кишечник. При вирусном гепатите возможно повышение концентрации уробилиногена на ранней стадии за счёт повреждения печёночных клеток. В фазу внутрипечёночного холестаза при вирусном гепатите уробилиноген отсутствует и появляется в моче вновь только при стихании холестаза. Обструктивную желту
ху характеризует осветление кала из-за исчезновения жёлчных пигментов, в то время как при гемолитической желтухе кал может быть темнее, чем обычно, из-за избытка образования стеркобилиногена. Стойкая полная обструкция с длительным отсутствием уробилиногена в моче свидетельствует о наличии рака головки поджелудочной железы, так как при камне в общем жёлчном протоке, как правило, всё же небольшое количество жёлчи проходит в кишечник. Ежедневная оценка внешнего вида кала и мочи, таким образом, простой метод обследования, но важный и для диагностики, и для прогноза.

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник

Сущность РА заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антигену антитела, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование глыбок, комочков, хлопьев, которые постепенно оседают на дно пробирки, формируя характерный осадок — агглютинат, жидкость над ним просветляется. Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки (антигена). Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, в течение 16—22 ч образуется мелкозернистый осадок. Если антигеном служит взвесь бактерий, имеющих жгутики (подвижные виды), и в агглютинации участвует наряду с соматическим еще жгутиковый Н-антиген, формируется крупнохлопчатый, крупнозернистый агглютинат. В ветеринарной практике РА используют для диагностики бруцеллеза, сальмонеллезов, колибактериоза, листериоза, вибриоза, лептоспирозов и других заболеваний. Существует несколько методов постановки РА: пробирочный (объемный), капельный (пластинчатый), кровяно-капельный, гемагглютинации, торможения гемаг- глютинации, антиглобулиновый Кумбса, кольцевая проба (реакция) с молоком по Кастеллани (метод адсорбции агглютининов).

Для определения антител (по известному антигену) берут 5—10 мл крови из яремной вены животного (у свиней — из хвостовой) в стерильные пробирки и помещают их в теплое место. После образования сгустка осторожно (стерильно!) отделяют его от стенок пробирки, обводя металлической проволокой (вязальной спицей), и ставят в холодное место для ретракции (отделения) сгустка. Сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, нумеруют их, с нарочным и сопроводительным письмом отсылают в лабораторию.

В РА (как и вообще при серологических исследованиях) используют свежие сыворотки без гемолиза или консервированные фенолом, мертиолятом натрия или борной кислотой. Антиген для РА представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых или живых бактерий. Для диагностических целей рекомендуется стандартный антиген биофабричного производства.

Если же необходимо идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из патологического материала, применяют стандартные сыворотки, а антиген готовят из суточной культуры — смыва с МПА. Специфические стандартные агглютинирующие сыворотки получают на биофабриках путем гипериммунизации животных соответствующим антигеном (специально подготовленной взвесью живых или убитых микробов, эритроцитами и др.). Готовую сыворотку консервируют, разливают в ампулы и запаивают. Нередко диагностические сыворотки подвергают лиофильному высушиванию. Перед употреблением такие сыворотки разводят дистиллированной водой. Но для постановки реакции (и промывания пипеток) ее разводят физиологическим раствором.

Постановка РА классическим (пробирочным)методом. Исследуемые сыворотки разводят в чистых сухих пробирках с ровным сферическим дном. Для каждой сыворотки берут отдельную пипетку. В зависимости от инфекции используют соответствующие степени разведения сывороток (согласно инструкции). Например, сыворотки разводят 1: 25; 1: 50; 1:100; 1: 200; 1:400.

Удобно разведения производить следующим образом. В отдельной пробирке готовят основное (исходное) разведение сыворотки —1:25, смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки разливают по 1 мл физиологического раствора. Затем из исходного разведения 1 мл жидкости переносят в первую опытную пробирку, смешивают с физраствором (разведение 1 : 50) и 1 мл переносят во вторую пробирку (1 : 100), из второй 1 мл — в третью и т.д. Из последней пробирки 1 мл выливают в сливную чашку, чтобы в каждой пробирке осталось по 1 мл разведенной сыворотки (рис. 9.9).

Рис. 9.9. Схема постановки РА

Во все пробирки добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием и выдерживают в термостате 4—6 ч при 37 °С, а затем при комнатной температуре 14—16 ч.

При постановке РА (как при каждой серологической реакции) обязательно проведение контроля: в тех же разведениях испытывают сыворотку нормальную (от здорового животного) и позитивную (от заведомо больного животного или стандартную биофабричного производства) с тем же антигеном.

Компоненты при постановке реакции вносят в пробирки индивидуальными мерными пипетками с резиновыми грушами или дозаторами, групповыми дозаторами (рис. 9.10 и 9.11) и автоматическими пипетками с изменяющимися объемами (5—250 мкл).

Рис. 9.10. Прибор Такачи — аппарат для микротитрования:

7 — общий вид; 2, а, б, в, г— последовательность работы с аппаратом Такачи

Рис. 9.11. Одиночные и групповые автоматические пипетки

Для контроля антигена в 1 мл физиологического раствора добавляют две капли антигена для исключения самоагглютинации.

Учет РА проводят невооруженным глазом или с помощью агглю- тиноскопа, начиная с контрольных пробирок. Результат РА принято выражать количеством крестов:

++++ (#) — полное просветление жидкости, образовавшийся агглютинат имеет вид перевернутого зонтика, при встряхивании он разбивается в глыбки, хлопья разной величины, жидкость остается прозрачной;

+ + + (///) — неполное просветление жидкости, агглютинат, как и в предыдущем случае, имеет вид зонтика, при встряхивании разбивается на более мелкие глыбки, комочки;

+ + (++) — так обозначают неполную реакцию агглютинации с неполным просветлением жидкости, агглютинат имеет вид зонтика, но при встряхивании разбивается на хлопья разной величины, жидкость мутная;

+ — наличие небольшого нехарактерного осадка в виде «пуговки», жидкость над ним мутная. При встряхивании такой осадок легко разбивается, увеличивая мутность;

— (минус) — вся жидкость в пробирке мутная, на дне пробирки небольшой осадок антигена с ровными краями в виде «пуговки», при встряхивании он разбивается в равномерную муть.

Результаты РА, показавшие 3—4 креста, учитывается как положительная степень проявления агглютинации, два креста — сомнительная, один крест или отсутствие агглютината — отрицательный результат. Реакцию оценивают не только по степени выраженности РА (++ + + , + + + или + +), но и по высоте титров, т.е. степени разведения сывороток, давших положительный результат РА. Например, при диагностике бруцеллеза крупных животных диагностическим титром считают положительный результат РА с сывороткой в разведении не ниже 1:100, при сальмонеллезном аборте кобыл — выше 1 : 500.

Капельный (пластинчатый)метод постановки РА используют для быстрого обследования поголовья животных в лаборатории и в условиях хозяйства. На чистую стеклянную пластинку наносят микропипеткой по 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005 мл исследуемой сыворотки. К каждой сыворотке добавляют по одной капле антигена определенной концентрации, постепенно их смешивают чистой стеклянной палочкой, начиная с наименьшего количества сыворотки. Условно считают, что сыворотка в первой капле соответствует разведению 1 : 50, во второй — 1 : 100, в третьей — 1 : 200, в четвертой — 1 :400. Через 2—3 мин производит учет. Для ускорения реакции стекло слегка подогревают высоко над пламенем горелки.

Положительный результат — образование в капле сыворотки комплекса антиген—антитело в виде крупинок, хлопьев, жидкость становится прозрачной. При отрицательном результате капля смеси сыворотки и антигена остается равномерно мутной (отсутствие в сыворотке антител).

Этим методом РА пользуются также для ориентировочного определения вида микроба или его идентификации (типизации). На предметное стекло наносят каплю известной специфической сыворотки и отдельно каплю физраствора (для контроля). В каждую каплю добавляют культуру испытуемого микроба в количестве, взятом бактериологической петлей, и равномерно размешивают. Положительная реакция указывает на гомологичность антигена с известным антителом.

Кровяно-капельный метод постановки РА чаще всего применяют для диагностики пуллороза (сальмонеллеза птиц) и бруцеллеза. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю цельной крови (взятой у птиц из гребешка или сережки), в нее добавляют каплю соответ- 156

ствующего антигена и смешивают стеклянной палочкой. Для лучшей видимости феномена агглютинации биопромышленность выпускает антиген, подкрашенный гематоксилином.

В положительных случаях РА (когда в крови имеются специфические антигену антитела) через 30—60 с в капле смеси появляются глыбки, хлопья склеенного антигена (агглютинат).

Кольцевую пробу в основном используют при обследовании крупного рогатого скота на бруцеллез и при контроле сборного молока. В агглютинационные пробирки наливают по 2—3 мл свежего цельного молока и добавляют по 0,2 мл (2 капли) антигена (окрашенного гематоксилином). Пробирки встряхивают до равномерного окрашивания молока, выдерживают на водяной бане (или в термостате) при 37 °С 45—60 мин. Если в молоке имеются антитела, образуется комплекс антиген—антитело, который адсорбируется на капельках жира и при отстаивании всплывает наверх, образуя синее кольцо в нижнем слое сливок; столбик молока обесцвечивается. Отрицательная реакция характеризуется синей окраской всего молока в пробирке и слегка желтоватым слоем сливок.

Постановка РА методом адсорбции антител У отдельных видов микробов наряду со специфическими видовыми антигенами имеются групповые, общие с другими видами одного рода или семейства бактерий. При введении в организм животного (и человека) таких бактерий (например, сальмонелл) образуются антитела против как видоспецифических, так и групповых (общих разным видам) антигенов. Если в реакции участвует микроб, обладающий групповым и типовым антигенами, то происходит полная агглютинация общих (групповых) и типоспецифических антигенов, при этом из сыворотки все антитела адсорбируются. Если антиген не типоспецифичен антителам, то происходит реакция агглютинации за счет групповых антигенов и групповых антител, типоспецифические антитела в сыворотке остаются.

Адсорбированные групповые антитела удаляют, сыворотки с групповым агглютинатом центрифугируют, а надосадочную жидкость (сыворотку с оставшимися типоспецифическнми антителами) отсасывают и вновь используют в РА. Так как сыворотка, истощенная групповыми антигенами, содержит только специфические антитела, она будет реагировать положительно лишь со специфическим антигеном. На этом принципе основан метод получения монорецепторных сывороток.

Реакция Кумбса. В ряде случаев при постановке РА не отмечают выпадения агглютината. Одной из причин этого является наличие в сыворотке больных животных наряду с полными антителами так называемых неполных или блокирующих антител, которые тормозят образование агглютината (выпадение комплекса антиген—антитело в виде осадка). Методика выявления неполных антител в организме больного разработана Кумбсом.

Прямая реакция Кумбса заключается в том, что к эритроцитам больного животного добавляют специфическую антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против глобулинов сыворотки). Эритроциты агглютинируют. При непрямой реакции исследуют сыворотку больного животного, которую соединяют с эритроцитами здорового животного. Затем, как и при использовании прямого метода, добавляют антиглобулиновую сыворотку. Блокирующие (неполные) антитела соединяются с эритроцитами, и добавленная антиглобулино- вая сыворотка, вступая в реакцию с неполными антителами, приводит к агглютинации эритроцитов, нагруженных неполными антителами (рис. 9.12).

Рис. 9.12. Реакция Кумбса (схема)

Для диагностических целей в ветеринарии разработана удобная модификация методики реакции Кумбса — бактерийный вариант, в котором вместо эритроцитов применяют специфический бактерийный антиген.

Бактерийный вариант реакции Кумбса. С исследуемыми сыворотками ставят обычную РА. После учета результата реакции в пробирки, в которых отсутствует агглютинация, добавляют по 2 мл физраствора и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Надосадоч- ную жидкость удаляют, к осадку добавляют 1 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре (установленный предварительно). Центрифужные пробирки встряхивают, содержимое переносят в агглюти- 158

национные пробирки, ставят их в термостат (температура — 37—38 °С) на 16—48 ч, а затем выдерживают еще 1 ч при комнатной температуре. Учет производят по характеру агглютината, как при использовании обычного метода РА. Реакция Кумбса очень чувствительна и позволяет наиболее точно выявлять больных.

источник

Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.

В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.

При проведении эпидемиологического исследования бруцеллеза в очагах применяют 1.реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и 2.Объемную (Райта), а так же реакции Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилактической вакцинацией населения можно ограничиться постановкой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.\

Реакция Райта (Реакция агглютинации с бруцеллезным антигеном в пробирках )

Реакция Райта проводится в пробирках в объеме 1 мл с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 и единым бруцеллезным диагностикумом. Последний представляет собой взвесь убитых нагреванием и фенолом бруцелл. Для пробирочной реакции диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физраствором. Методика разведения сыворотки обычна для пробирочной реакции агглютинации. Пробирки встряхивают, ставят в термостат при температуре 37° до следующего дня. Учет реакции проводят обычным способом или по 50% агглютинации (2+) в сравнении со стандартом мутности. Серийные титры 50% агглютинации 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,1:800 свидетельствуют о том, что в 1 мл исследуемой сыворотки содержится соответственно 50, 100, 200, 400, 800 МЕ антител. Выраженность реакции больного оценивают по следующей схеме: титр 1:50 оценивается как сомнительный, 1:100 – слабо положительный, 1:200 и 1:400 – положительный, 1:800 – резко положительный.

При остром бруцеллезе реакция Райта положительна у больных в титре 1:200-1:800, тогда как при хроническом бруцеллезе – в титре 1:50-1:100. В то же время обострение хронического бруцеллеза сопровождается повышением титра 1:200-1:400.

Перечисленные показатели относятся к больным, заражение которых происходило в период их кратковременного пребывания в сельской местности, неблагополучной по бруцеллезу, или в результате систематического употребления некипяченого «фляжного» молока в городе.

Иногда резко выраженная реакция Райта наблюдается у больных со слабо выраженными клиническими проявлениями бруцеллеза.

Серологическая реакция агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона)

Реакция Хеддльсона (пластинчатая – применяют на стекле) чувствительна, но менее специфична, дает возможность выявлять агглютинины в первые дни болезни, быстро получить ответ. На большое (9х12см) хорошо обезжиренное сухое стекло на расстоянии 3-4 см друг от друга микропипеткой наносят исследуемую сыворотку в дозах 0,04, 0,02, 0,01 мл (опытные капли) и 0,02 мл (контрольная капля). К трем первым каплям сыворотки добавляют по 0,03 мл единого неразведенного диагностикумума, к последней – 0,03 мл физраствора. Максимальный срок наблюдения – 8 минут. Учет осуществляют невооруженным глазом по 4+ системе. При положительной реакции в опытных каплях появляются хлопья и жидкость становится более или менее прозрачной. Агглютинацию во всех трех дозах 4+ принимают за резко положительный результат, в первой и второй дозах – за положительный результат, только в первой дозе – сомнительный результат, отсутствие агглютинации во всех дозах – отрицательный результат.

Реакция Кумбса либо антиглобулиновый тест.

Его проводит для обнаружения антител, которые атакуют эритроциты.

Для обнаружения бруцеллеза используется прямая реакция. Эта реакция различает антитела, которые напрямую связаны с эритроцитами. Если антиглобулиновый тест показывает отрицательный результат – значит кровь чистая, и антител нет. Положительный результат означает появление антител, которые активно борются с эритроцитами.

ПЦР-диагностика основывается, на обнаружении ДНК-цепей бруцелл из биологического материла пациента. Для этого материал обеззараживают, прибавляя метиолят натрия концентрацией 0,01% с дальнейшим прогреванием в течение получаса. Когда завершится инкубирование в лизирующем растворе, который содержит, все необходимые реагенты для экстракции ДНК при поддерживании температуры в 66С на протяжении 10-15 минут биологическая ткань обезвреживается.

Этот анализ обладает положительной чертой в том плане, что можно использовать абсолютно любую биологическую ткань пациента.

источник

Для постановки реакции агглютинации на бруцеллёз применяют свежие сыворотки, взятые от исследуемых животных. Допускается исследование сыворотки, консервированной фенолом до 0,5% со сроком их давности не свыше 15 дней.

Реакцию ставят на физиологическом растворе (0,85 о/о) поваренной соли в четырёх разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 :25; 1 :50; 1 :100; 1 :200; для крупного рогатого скота, лошадей верблюдов 1 :50; 1 :100; 1 :200; 1 :400 в количестве 1 см 3 каждого разведения, в пробирках с ровным выпуклым дном. При массовых исследованиях допускается постановка реакции в двух первых разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 :25 и 1 :50; для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов 1 :50 и 1 :100. Для предохра-

нения от прорастания посторонней микрофлоры рекомендуется постановка реакции на фенолизированном 0,5 °/о физиологическом растворе.

Одновременно ставят следующие контроли: а) с отрицательной (негативной) сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые сыворотки, б) с положительной (позитивной) сывороткой до предельного её титра, в) антиген с 1 см 3 физиологического раствора. Во все пробирки, в том числе и контроли, при постановке реакции микронипеткой вводят по 0,05 см 3 антигена, содержащего в 1 см 3 10 млрд. микробных тел. Затем все пробирки тщательно встряхивают до получения равномерной взвеси.

Допускается разлив сывороток в соответствующих дозах микропипеткой. В этом случае приливают по 1 см 3 антигена, предварительно разведённого до 500 млн. микробных тел в 1 см 3 . Сыворотки разливают в дозах: 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005, что соответствует разве-дениям: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200. При разливе сывороток обязательна тщательная промывка пипеток после каждой сыворотки не менее шести раз в 2—3 посудах. После тщательного встряхивания, пробирки ставят на 4—10 часов в термостат при температуре 37—38° С, после чего их выдерживают при комнатной (16—18° С) температуре 18—24 часа и затем учитывают реакцию. Учёт реакции производят макроскопически.

Диагностически положительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации в разведении 1:50 для свиней, овец, коз и собак и 1:100 для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов с оценкой их не менее, чем на два креста.

Диагностически сомнительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации только в разведении I :25 для свиней, овец, коз, собак и 1 :50 для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов с оценкой не менее чем на два креста.

Все сыворотки, давшие агглютинацию в каких-либо разведениях исследуются повторно из той же пробы в четырёх разведениях: для свиней, овец, коз и собак 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов 1 :50; 1 :100; 1 :200; 1 :400. При получении сомнительной реакции кровь от животного берут повторно через 3—4 недели. При получении положительных или сомнительных реакций в отчёте хозяйству указывают разведение, в котором получена реакция.

Сыворотки крупного рогатого скота, поступившие из хозяйств, в которых имеются аборты на почве бруцеллёза или где реакцией агглютинации выделяется значительное количество положительно реагирующих на бруцеллёз (свежая инфекция), исследуются в четырех разведениях: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200. При наличии, макроскопической агглютинации в разведениях 1 :25 или 1 :50 не менее чем на два креста, проба считается диагностически сомнительной. Если при повторном исследовании сомнительно реагирующих животных титр агглютинации не будет превышать 1 : 25, то проба признаётся диагностически отрицательной.

Если при исследовании сывороток свиней и лошадей будут получены только сомнительные реакции (у свиней 1 :25, у лошадей 1 :50) и при повторной проверке этих животных титр агглютинации не повысится, то при условии отсутствия в хозяйстве клинических признаков бруцеллёза среди этих видов животных и реагировавших в более высоких разведениях, пробы признаются диагностически отрицательными.

В благополучных по бруцеллёзу хозяйствах реакции в указанных разведениях считаются сомнительными.

Оценка реакции агглютинации в крестах следующая: ++++ — полное просветление жидкости при наличии явно выраженного зонтика (при встряхивании зонтик разбивается на хлопья, комочки, в крупинки). +++ те же явления, которые отмечаются для четырёх крестов, но жидкость слегка опалесцирует (недостаточно полное просветление). ++ — просветление жидкости выражено слабо. Имеется наличие зонтика, который при встряхивании разбивается на хлопья, комочки и крупинки.

+ — отсутствие или весьма незначительное просветление при наличии слабо выраженного зонтика или его следов. При встряхивании жидкости заметны комочки и крупинки.

— отрицательная реакция агглютинации. Отсутствие просветления и зонтика. Микробы могут оседать в виде точки—пункта; при встряхивании разбиваются в равномерную муть.

источник