Постановка рид при бруцеллезе

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник

Для постановки реакции агглютинации на бруцеллёз применяют свежие сыворотки, взятые от исследуемых животных. Допускается исследование сыворотки, консервированной фенолом до 0,5% со сроком их давности не свыше 15 дней.

Реакцию ставят на физиологическом растворе (0,85 о/о) поваренной соли в четырёх разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 :25; 1 :50; 1 :100; 1 :200; для крупного рогатого скота, лошадей верблюдов 1 :50; 1 :100; 1 :200; 1 :400 в количестве 1 см 3 каждого разведения, в пробирках с ровным выпуклым дном. При массовых исследованиях допускается постановка реакции в двух первых разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 :25 и 1 :50; для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов 1 :50 и 1 :100. Для предохра-

нения от прорастания посторонней микрофлоры рекомендуется постановка реакции на фенолизированном 0,5 °/о физиологическом растворе.

Одновременно ставят следующие контроли: а) с отрицательной (негативной) сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые сыворотки, б) с положительной (позитивной) сывороткой до предельного её титра, в) антиген с 1 см 3 физиологического раствора. Во все пробирки, в том числе и контроли, при постановке реакции микронипеткой вводят по 0,05 см 3 антигена, содержащего в 1 см 3 10 млрд. микробных тел. Затем все пробирки тщательно встряхивают до получения равномерной взвеси.

Допускается разлив сывороток в соответствующих дозах микропипеткой. В этом случае приливают по 1 см 3 антигена, предварительно разведённого до 500 млн. микробных тел в 1 см 3 . Сыворотки разливают в дозах: 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005, что соответствует разве-дениям: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200. При разливе сывороток обязательна тщательная промывка пипеток после каждой сыворотки не менее шести раз в 2—3 посудах. После тщательного встряхивания, пробирки ставят на 4—10 часов в термостат при температуре 37—38° С, после чего их выдерживают при комнатной (16—18° С) температуре 18—24 часа и затем учитывают реакцию. Учёт реакции производят макроскопически.

Диагностически положительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации в разведении 1:50 для свиней, овец, коз и собак и 1:100 для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов с оценкой их не менее, чем на два креста.

Диагностически сомнительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации только в разведении I :25 для свиней, овец, коз, собак и 1 :50 для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов с оценкой не менее чем на два креста.

Все сыворотки, давшие агглютинацию в каких-либо разведениях исследуются повторно из той же пробы в четырёх разведениях: для свиней, овец, коз и собак 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов 1 :50; 1 :100; 1 :200; 1 :400. При получении сомнительной реакции кровь от животного берут повторно через 3—4 недели. При получении положительных или сомнительных реакций в отчёте хозяйству указывают разведение, в котором получена реакция.

Сыворотки крупного рогатого скота, поступившие из хозяйств, в которых имеются аборты на почве бруцеллёза или где реакцией агглютинации выделяется значительное количество положительно реагирующих на бруцеллёз (свежая инфекция), исследуются в четырех разведениях: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200. При наличии, макроскопической агглютинации в разведениях 1 :25 или 1 :50 не менее чем на два креста, проба считается диагностически сомнительной. Если при повторном исследовании сомнительно реагирующих животных титр агглютинации не будет превышать 1 : 25, то проба признаётся диагностически отрицательной.

Если при исследовании сывороток свиней и лошадей будут получены только сомнительные реакции (у свиней 1 :25, у лошадей 1 :50) и при повторной проверке этих животных титр агглютинации не повысится, то при условии отсутствия в хозяйстве клинических признаков бруцеллёза среди этих видов животных и реагировавших в более высоких разведениях, пробы признаются диагностически отрицательными.

В благополучных по бруцеллёзу хозяйствах реакции в указанных разведениях считаются сомнительными.

Оценка реакции агглютинации в крестах следующая: ++++ — полное просветление жидкости при наличии явно выраженного зонтика (при встряхивании зонтик разбивается на хлопья, комочки, в крупинки). +++ те же явления, которые отмечаются для четырёх крестов, но жидкость слегка опалесцирует (недостаточно полное просветление). ++ — просветление жидкости выражено слабо. Имеется наличие зонтика, который при встряхивании разбивается на хлопья, комочки и крупинки.

+ — отсутствие или весьма незначительное просветление при наличии слабо выраженного зонтика или его следов. При встряхивании жидкости заметны комочки и крупинки.

— отрицательная реакция агглютинации. Отсутствие просветления и зонтика. Микробы могут оседать в виде точки—пункта; при встряхивании разбиваются в равномерную муть.

источник

Основными тестами при массовых диагностических исследованиях явля­ются пробирочная РА, РА на стекле (Роз-бенгал проба), РСК и РДСК, коль­цевая реакция с молоком, реакция диффузионной преципитации.

Пробирочная реакция агглютинации.Используют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота, шец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей, собак, пушных зверей И т.д. Реакцию проводят в объеме
1 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов исследуют в разведениях 1:50-1:400; онец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — 1:25 -1:200; пушных зве­рей и морских свинок — 1:10-1:80. При массовых исследованиях до­пускается постановка РА в двух первых разведениях, но при этом надо иметь в виду возможность феномена «прозоны». Сыворотки крови круп­ного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разво­дят 0,85%-ным раствором натрия хлорида с 0,5% фенола; сыворотки кро­ви овец, коз и буйволов разводят 5%-ным, а сыворотки крови оленей — 10%-ным фенолизированным раствором натрия хлорида. Разведения сы­воротки крови делают в объеме 0,5 мл, затем в каждую пробирку вносят 0,5 мл единого бруцеллезного антигена, разведенного 1:10, при этом раз­ведения сыворотки крови удваиваются. Компоненты перемешивают Встряхиванием и штатив с пробирками помещают в термостат при 37-38° С на 18-20 часов, затем выдерживают несколько часов при комнат­ной температуре и учитывают результат общепринятым способом (техни­ку постановки и учета результатов РА см. в разделе «Серологические ре­акции»). В качестве контролей параллельно исследуют заведомо положи­тельную и отрицательную сыворотки. РА при бруцеллезе крупного рога­того скота, лошадей и верблюдов считают положительной при титре 1:100 и более (1:50 — сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 — сомнительный результат). При получении сомни­тельных результатов сыворотки крови от этих животных исследуют через три-четыре недели повторно.

Помимо титра результаты пробирочной РА выражают в международ­ных единицах (ME). В разных странах готовят антигены, различающиеся по агглютинабилыюсти, что приводит к несопоставимости титров РА. По­этому была предложена международная стандартная бруцеллезная сыво­ротка, по отношению к которой определяют активность национальных ан­тигенов. Активность стандартной сыворотки определена в 1000 МЕ/мл. Например, при исследовании этой сыворотки с определенным нацио­нальным антигеном она показывает в РА титр 1:500. Следовательно, если в РА с этим антигеном исследуют сыворотку крови от животного из хозяй­ства и получают титр РА 1:500, то она также содержит 1000 ME бруцеллез­ных антител, а вторая сыворотка, давшая титр 1:400, содержит 1000 х 400 : 500 = 800 ME и т.д. В настоящее время в странах разработаны национальные стандартные бруцеллезные сыворотки, соответствующие по активности международной сыворотке. В РФ в соответствии с «Наставлением по диаг­ностике бруцеллеза животных» (2000) приняты следующие критери оценки РА в ME. Реакцию считают положительной у невакцинироваппого крупного рогатого скота, верблюдов, лошадей, а также иммунизированных неаг-глютиногенными вакцинами при наличии 200 ME антител (сомнительной — 50-100 ME); у овец и коз — 100 ME; оленей и собак — 50 ME; пушных зверей и морских свинок —10 ME. PA считают сомнительной у овец, коз, оленей, собак этой группы на уровне 25-50 ME. При сомнительных пока­заниях РА животных повторно исследуют через 15-30 суток. В случае повышения уровня антител животных признают больными, при отсутствии динамики — здоровыми. Выявление в стадах крупного рогатого скота, иммунизированного ра­нее агглютиногенными вакцинами, животных с уровнем антител не более 200 ME предполагает через 15-30 суток их повторное исследование. Если при повторном исследовании наблюдают повышение уровня антител, то животных признают больными. При отсутствии повышения дополнитель­ными методами уточняют специфичность результатов РА.

При обнаружении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота (ранее иммунизированного или не иммунизированного) жи­вотных с уровнем антител 100 ME и более их признают больными,
50 ME — результат РА сомнительный. В случае сомнительной РА животных исследу­ют через 15-30 суток повторно и при вторичном сомнительном результате животных признают больными.

При исследовании в РА невакцинированных баранов-производителей, пробников, ярок, козлов, содержащихся в благополучных отарах, где про­водилась иммунизация, РА оценивают как положительную при уровне ан­тител 100 ME и более, сомнительной — 50 ME. В последнем случае живот­ных через 15-30 суток исследуют повторно, и, если содержание антител не увеличилось, их признают здоровыми.

Роз-бенгал проба (РБП).РА на стекле с корпускулярным антигеном, окрашенным розовым бен­гальским, используют для диагностики бруцеллеза крупного рогатого ско­та, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей. Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре не ниже 18°С. Исследуемые сыворотки в дозе 0,03 мл вно­сят на дно лунки, затем в лунку рядом с сывороткой помещают при исследо­вании крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней 0,03 мл ан­тигена, сывороток овец, коз, буйволов и северных оленей — 0,015 мл анти­гена. Компоненты должны иметь температуру не ниже 18°С.

Затем компоненты перемешивают в течение 4 минут, одновременно учи­тывая результат. В положительных случаях в течение указанного времени появляются розовые хлопья агглютината. В РБП исследуют неразведен-ные сыворотки, влияние нормальных антител нивелируется использовани­ем кислого антигена со значениями рН, при которых нормальные антитела с низкой авидностыо не реагируют с антигеном, что обеспечивает специ­фичность результата реакции. Перед началом исследований антиген проверяют в РБП на активность, специфичность и на спонтанную агглютинацию соответственно с позитивной, негативной сыворотками и в последнем случае — с физиологическим раствором. В соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных» в РФ результат РБП считают положительным при наличии четко выраженной агглютинации. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах в случае позитивной РБП сыворотки крови исследуют в РА и РСК (РДСК) или РА и РИД. Если при этом получают отрицательные результаты, то животных с позитивной РБП повторно исследуют через 15-30 дней в этих же серологических реакциях. В неблагополучном по бруцеллезу хозяйствах овец, коз, северных оленей с позитивной РБП признают больными. Сыворотку крови крупного рогатого скота, вер­блюдов и лошадей дополнительно исследуют в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД, животных с положительными результатами этих серологических ре­акций признают больными, сомнительно реагирующих исследуют повторно через 15-30 суток в РА, РСК (РДСК) или РА и РИД. При получении положительных или сомнительных результатов животных признают больными бруцеллезом.

Кольцевая реакция с молоком (КР).Реакцию применяют для проверки благополучных по бруцеллезу стад крупного рогатого скота и молока на рынках.

В РФ, в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза животных», реакцию и оценку результатов проводят следующим образом. В уленгутовские пробирки наливают 0,05 мл антигена (клетки бруцелл, окрашенные гематоксилином) и 1 мл исследуемого молока. Если используют пробирки Флоринского — 2 мл молока и 0,1 мл антигена, компоненты пе­ремешивают, пробирки помещают в водяную баню (37-38° С) на 1 час, затем учитывают результат по нижеследующим критериям:

КР на 2-3 креста считают положительной, 1 крест — сомнительной. При положительной КР от всех животных стада берут кровь для исследо­вания в РА или РСК (РДСК) или РА и РИД. Если получают их отрицатель­ный результат, то независимо от позитивной КР животных признают здоро­выми.

Реакция связывания комплемента (РСК, РДСК). Данную серологическую реакцию применяют для диагностики бруцел­леза практически у всех видов животных. Согласно «Наставлению по ди­агностике бруцеллеза животных» исследуемые сыворотки крови крупного рогатого скота для РСК инактивируют разведенными 1:5 в водяной бане в течение 30 минут при 60-62°С; сыворотки крови ослов, мулов при 64-65°С; буйволов — 62-64° С; свиней — 60-62° С 50 минут; при постанов­ке РДСК 30 минут при 62-64° С. Используют единый бруцеллезный анти­ген в рабочем титре, гемолизин для РСК в удвоеном титре, для РДСК — в утроенном, 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана для РСК и 3%-ную для РДСК. Комплемент в количестве 1,2 единицы (титр комплемента принима­ется за 1 единицу). Реакцию проводят в объеме 1 мл с сыворотками, разве­денными 1:5 или 1:10 (технику постановки и учета результатов см. в разде­ле «Серологические реакции»).

При исследовании сывороток в одном разведении (1:5) и задержке гемо­лиза на один крест эти сыворотки повторно исследуют в двух разведениях (1:5, 1:10). В случае сомнительной РСК животных повторно исследуют че­рез 15-30 суток. Если при повторном исследовании животных из благопо­лучного по бруцеллезу хозяйства вновь получена сомнительная РСК — жи­вотных признают здоровыми. Если аналогичный результат получен у жи­вотных неблагополучного хозяйства, их рассматривают как больных. По­лучение только позитивной РСК в разведении 1:10 в благополучных по бруцеллезу стадах ранее вакцинированного крупного рогатого скота пред­полагает повторное исследование через 15-30 суток. При нарастании титров РСК диагноз на бруцеллез считают установленным, в обратном слу­чае результат исследования считают отрицательным («Наставление по ди­агностике бруцеллеза животных», 2000).

Реакция иммунодиффузии (РИД). Согласно «Наставлению по диагностике бруцеллеза животных» (2000) в РФ РИД используют при плановых исследованиях в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где не применяются вак­цины, одновременно с РА, а также при проверке сомнительно реагирую­щих в РА или РСК (РДСК) животных для дифференциации неспецифичес­ких реакций; в благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация крупного рогатого скота аг-глютиногенными вакцинами при контроле эпизоотического состояния (не ранее 1,5 месяца после вакцинации); для дифференциации реакций, полу­ченных в РА (не более
200 ME) или РСК (РДСК) в разведениях не выше 1:10; при плановых исследованиях животных одновременно с РА; в не­благополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах через 1,5 месяца после иммунизации; среди телок и нетелей в течение первых шести месяцев после иммунизации (реиммунизации) 2-4-кратно; через месяцев после иммунизации (реиммунизации) животных для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе предусмотренных реакций; при постановке хозяйства на контроль и снятии ограничений одновременно с РА и РСК (РДСК).

При диагностике бруцеллеза северных оленей для оценки эпизоотического состояния стад, благополучных по бруцеллезу, вакцинированных против бруцеллеза; для исследования на бруцеллез не ранее чем через два месяца после применения вакцин; для дифференциации неспецифических реакций.

Техника проведения РИД. Расплавленный агар разливают по 2,5 мл на предметные стекла, пластинки размером 6×9 см —12 мл, стандартные чашки Петри слоем не менее 2 мм, которые предварительно размещают на строго горизонтальной поверхности. В застывшем агаровом геле штампом делают лунки: центральную диаметром 5 мм и шесть переферических по 3 мм.

В центральную лунку вносят 20 мкл О-полисахаридного антигена, в пе­риферические — 40 мкл исследуемых сывороток крови. Одновременно на каждой пластинке (чашке Петри) ставят контроль с позитивной сывороткой крови. Затем стекла (чашки Петри) выдерживают во влажной камере при температуре не ниже 18° С и учитывают результат в косопроходящем свете через 24 и 48 часов. Как положительный результат оценивают наличие ли­нии преципитации, появившейся через 24 часа. Сыворотки крови, давшие реакцию преципитации через 48 часов, исследуют повторно и при получении линии преципитации через 24 или 48 часов результат реакции признают по­ложительным.

Печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар.Готовят печеночный отвар: 500 г свежего фарша говяжьей печени смешивают с 500 мл воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют в автоклаве, смешивают равные объемы печеночного отвара и водопроводной воды, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2% агар-агара. На 1000 мл смеси вносят 17 мл 10%-ной двууглекислой соды, автоклавируют 20-25 минут при 115° С, фильтруют через ватный фильтр, ус­танавливают рН 7,0-7,2, добавляют 1% глюкозы и 2% глицерина, разливают по колбам и стерилизуют 20-25 минут при 110° С. Перед использо­ванием агар расплавляют, остужают до 50° С, добавляют 10-20% сыво­ротки крови лошади или крупного рогатого скота (печеночно-сывороточ-иый агар) или 10-15% аминопептида (печеночно-аминопептидный агар) и разливают по чашкам или пробиркам. Также готовят полужидкие агары, внося 0,15-0,2% агар-агара. Рекомендуют среды данного типа для культивирования В. ovis.

Печеночный агар Хеддльсона.В 500 мл воды вносят 10 г пентона,
5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, автоклавируют 30 минут, добавляют 500 мл печеночного отвара, охлаж­дают до 60° С, устанавливают рН 7,0. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют 30 минут при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,0, разливают по емкостям и стерилизуют 30 минут при 115° С.

Плотный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (ППГГА). 400 г свежей говяжьей печени освобождают от жира и пленок, измель­чают, добавляют 500 мл водопроводной воды, кипятят 1 час, фильтруют через ватный фильтр. Полученный печеночный отвар разводят водопро­водной водой 1:1, добавляют 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 2,5% ага­ра и
17 мл 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия на 1000 мл. Среду автоклавируют 20 минут при 115° С, отстаивают в автоклаве 3-4 часа, фильтруют через ватный фильтр, устанавливают рН 7,2. Затем в среду вно­сят 1% глюкозы и 2-3% глицерина, разливают по пробиркам, колбам, сте­рилизуют 20-25 минут при 110° С. Данную среду рекомендуется приме­нять для культивирования В. abortus, В. melitensis и В. suis, при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл. ППГГБ готовят так же, но агар не добавляют.

Сывороточно-декстрозиый агар.К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15г агар-агара, 10г пептона, 5 г химически чистого натрия хлорида и 165 мл мягкой воды. Прогре­вают 1 час текучим паром, устанавливают рН 7,8, автоклавируют 30 мин при 127° С, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,4. Среду разливают по сосудам и стерилизуют при 116° С 15 минут. Перед использованием среду расплавляют, охлаждают до 50° С, добавляют сте­рилизованные фильтрованием сыворотку крови лошади или крупного ро­гатого скота до концентрации 5% и раствор декстрозы до уровня 1%. Сре­да рекомендуется для первичного выделения бруцелл.

Сывороточно-декстрозный бульон.Готовят так же, как сывороточно-декстрозный агар, но без добавления агар-агара.

Альбими-агар.В 1000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,3, все компоненты растворяют в аппарате Коха, фильтруют через ватный фильтр. Вносят 1 г глюкозы, 0,2 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2 0-7,3, разливают по колбам и стерилизуют 40 минут текучим паром, затем 20 минут в автоклаве при 110° С. Дрожжевую воду получают путем кипячения 1 кг хлебных дрожжей в 1000 мл дистиллированной воды, затем фильтруют через полотно и хранят под флороформом в темноте (не более 15 дней).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

У собак и кошек болезнь протекает бессимптомно и может быть обнаружена при серологическом исследовании.

Картина вскрытия при бруцеллезе нехарактерная. У абортировавших животных плодные оболочки набухшие, покрыты хлопьями фибрина и гноя. Возможны признаки гнойно-катарального мастита, у самцов – гнойно-некротических орхитов. У абортированных плодов находят отеки подкожной клетчатки и пупочного канатика, а также катаральное воспаление слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, легких, некротические участки в печени.

Диагностика и дифференциальная диагностика

Диагноз на бруцеллез устанавливают комплексно на основании анализа эпизоотологических данных, клинических признаков, лабораторных и аллергических (у свиней) исследований.

Из эпизоотологических данных учитывают благополучие местности по бруцеллезу, факты приобретения животных из других хозяйств. При клиническом обследовании животных обращают внимание на наличие абортов, задержание последов, эндометритов, а у самцов – бурситов, орхитов.

Для бактериологического исследования в лабораторию посылают патологический материал (плод с плацентой, содержимое бурс, кусочки паренхиматозных органов, кровь, молоко и др.) свежий или консервированный. Одновременно в лабораторию направляют для серологического исследования молоко, сыворотку крови или кровь от абортировавшего или убитого с диагностической целью животного.

Бактериологическая диагностика бруцеллеза предусматривает бактериоскопию мазков из патологического материала и при необходимости постановку биопробы на морских свинках. Бактериоскопия мазков-отпечат-ков, окрашенных по Граму и специальными методами (по Козловскому, Шуляку–Шину), имеет ориентировочное значение. Выделение культуры бруцелл при посеве биоматериала на специальные питательные среды и положительная биопроба на морских свинках имеют решающее значение при постановке бактериологического диагноза на бруцеллез.

Для массовых профилактических и диагностических прижизненных исследований скота на бруцеллез широко используют РА, РСК, РДСК, РДП и РИД. Применяют также РБП (роз-бенгал проба) и кольцевую реакцию (КР) с молоком коров. Все указанные реакции используют в серологической диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, яков, зебу, буйволов.

Сыворотки крови животных благополучных хозяйств, дающие положительную РБП, сразу же исследуют в РА и РСК для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Кольцевая реакция (КР) с молоком применяется для контроля за благополучием стада по бруцеллезу, положительные результаты необходимо перепроверять по РА, РСК, РДСК. У мелкого рогатого скота, лошадей, верблюдов, оленей используют РА, РСК/РДСК, РБП, а у свиней – аллергический метод. У собак и животных других видов используют РА и РСК. Аллергический метод исследования используется у свиней, и наибольшую диагностическую ценность он имеет на поздних стадиях развития болезни. Для аллергических исследований применяют бруцеллин ВИЭВ.

Диагноз на бруцеллез считают установленным: 1) при выделении культуры бруцелл из биоматериала; 2) при положительной биопробе; 3) при положительных результатах серологических исследований невакциниро-ванных животных в следующих показателях: для крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей – РА с наличием антител 200 МЕ/мл и выше, а также при положительных результатах в РИД; для овец и коз – РА 100 МЕ/мл и выше; для оленей (маралов) и собак – РА 50 МЕ/мл и выше; для всех видов животных РСК в разведении сыворотки 1:5 и выше. При выявлении среди крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, реагирующих только в РА с содержанием антител 50… 100 МЕ/мл, а среди овец, коз, оленей (маралов) – 25… 50 МЕ/мл, их обследуют повторно через 15… 30 дней; 4) свиней признают больными бруцеллезом, если аллергическая проба с бруцеллином подтверждена положительной РСК.

Иммунизированных животных исследуют на бруцеллез согласно утвержденным правилам.

Бруцеллез дифференцируют от других инфекционных болезней, которые сопровождаются абортами: кампилобактериоза, трихомоноза, сальмонеллеза, хламидийного аборта, лептоспироза, инфекционного эпидидимита, иерсиниоза, а также от незаразных болезней с симптомами аборта.

Иммунитет, специфическая профилактика

Иммунитет при бруцеллезе относительно напряженный и формируется медленно. Ведущее значение в иммунной защите при бруцеллезе играет клеточный иммунитет. Наличие антител в сыворотках крови животных не предохраняет их от повторного заражения. Для специфической профилактики возможно применение живых, аттенуированных, инактивированных и генно-инженерных вакцин. Наибольшее применение нашли живые вакцины из штамма В. abortus 19 и слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82 для вакцинации крупного рогатого скота. Для иммунизации овец и коз используют вакцину из штамма В. melitensis Рев-1.

Мероприятия по профилактике бруцеллеза животных в благополучных хозяйствах, населенных пунктах и мероприятия по его ликвидации в неблагополучных хозяйствах предусмотрены в соответствии с действующими Санитарными и ветеринарными правилами. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах и населенных пунктах проводят ветеринарно-санитарные мероприятия по охране хозяйств от заноса в них возбудителя инфекции (контроль за приобретением, перемещением животных и реализацией животноводческой продукции, профилактическое карантинирование и т.д.). С профилактической целью в плановом порядке на бруцеллез исследуют быков-производителей, коров, буйволов, зебу, яков, верблюдов, оленей, маралов и телок в возрасте старше 1 года, баранов-производителей, овцематок и козематок, оставшихся без ягнят, хряков и свиноматок 1 раз в год. Лошадей и других животных исследуют в хозяйстве, неблагополучном по бруцеллезу, при выявлении признаков данного заболевания (аборты, бурситы) и др. Положительно реагирующих на бруцеллез лошадей отправляют на убой. В звероводческих хозяйствах ветеринарный контроль заключается в бактериологических исследованиях абортированных плодов. В хозяйствах, поставляющих молоко в детские и медицинские учреждения и торговую сеть по прямым связям, крупный рогатый скот исследуют на бруцеллез 2 раза в год (весной и осенью) в РА и РСК или РА и РИД. В племенных хозяйствах быков исследуют на бруцеллез 2 раза в год в РА и РСК или РА и РИД. Всех животных, поступающих из других областей, исследуют в период карантина в РА и РСК, свиней – в РСК/РДСК и аллергическим методом. Откормочное поголовье обследуют на бруцеллез перед сдачей на убой за 30 дней до отправки на мясокомбинат.

Лечение животных, больных бруцеллезом, не проводится, они подлежат убою.

При установлении диагноза на бруцеллез хозяйство (населенный пункт) объявляют неблагополучным и вводят ограничения, по условиям которых запрещаются: 1) провоз (прогон) животных через неблагополучную территорию, ввоз на эту территорию восприимчивых к бруцеллезу животных, перегруппировка животных внутри хозяйства без разрешения главного ветеринарного врача хозяйства; 2) использование больных (положительно реагирующих) бруцеллезом животных и полученного от них приплода для воспроизводства стада; 3) продажа населению с целью откорма или выращивания животных, содержащихся на неблагополучных фермах; 4) совместный выпас, водопой и иной контакт больных животных и поголовья неблагополучных стад со здоровыми животными; 5) вывоз сена и соломы за пределы неблагополучного хозяйства.

Животных всех видов, положительно реагирующих на бруцеллез, немедленно изолируют и в течение 15 дней сдают на убой без откорма и нагула независимо от их племенной ценности, возраста, состояния беременности.

Молоко от коров, положительно реагирующих на бруцеллез, обеззараживают кипячением или перерабатывают на топленое масло. Молоко от нереагирующих коров неблагополучного стада обеззараживают в хозяйстве при температуре 70° С в течение 30 мин или при температуре 85…90 «С в течение 20 с. Перед отправкой с молочного завода молоко и обрат должны быть подвергнуты обеззараживанию. Запрещается их использование без термической обработки для кормления молодняка.

Оздоровление хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота, осуществляют двумя способами: 1) полной заменой неблагополучного поголовья и проведением комплекса мер по санации помещений, территорий ферм, пастбищ и т.д.; 2) иммунизацией скота противо-бруцеллезными вакцинами с последующим систематическим исследованием, согласно утвержденным наставлениям по их применению.

Первый метод применяют при установлении бруцеллеза в благополучных областях, краях, республиках и районах, не проводящих иммунизацию скота против бруцеллеза, находящихся на территории неблагополучных административных территорий, а также во всех случаях острого течения бруцеллеза, сопровождающегося массовыми абортами коров в стаде, и когда не достигается оздоровление хозяйства в течение 2…5 календарных лет с применением противобруцеллезных вакцин.

Второй способ оздоровления неблагополучных хозяйств с использованием противобруцеллезных вакцин применяют в районах, областях, краях и республиках с широким распространением бруцеллеза по разрешению ветеринарной службы области, края, республики и согласованию с ветеринарными органами МСХ РФ.

Хозяйство признается оздоровленным от бруцеллеза крупного рогатого скота в следующих случаях: при полной замене неблагополучного поголовья и проведении комплекса мер по санации животноводческих помещений, территории (механическая очистка, санитарный ремонт животноводческих помещений, дезинфекция) и получении двух отрицательных результатов серологических исследований на бруцеллез всех видов животных с интервалом 30 дней, включая скот, принадлежащий гражданам, проживающим в данном населенном пункте.

источник

Владельцы патента RU 2417098:

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает исследование сыворотки крови в реакции иммунодиффузии. В качестве диагностикума используют антиген, приготовленный путем механического смешивания равных частей O-поисахаридного М-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, и O-полисахаридного А-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. abortus 19. Использование предложенного способа повышает точность и достоверность диагностики бруцеллеза как мелкого рогатого скота, так и крупного рогатого скота. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных заболеваний.

Известен способ диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота с помощью реакции иммунодиффузии (РИД) с O-полисахаридным антигеном (O-ПС), который готовится из вакцинного штамма В. abortus 19 (автор В.М.Чекишев), (1, 5, 6, 9, 10, 11, 12).

O-полисахаридный (O-ПС) антиген, изготавливавшийся из бруцелл вида abortus (RU 2035188 C1, 20.05.1995), изначально предназначался для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. При этом следует особо отметить, что его использовали в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) при диагностике бруцеллеза как дополнительный метод, позволяющий из числа положительно реагировавших в РА и РСК выявлять только животных, зараженных вирулентными бруцеллами.

Таким образом, за счет использования указанного диагностикума, решалась только проблема дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Однако при бруцеллезе овец реакция иммунодиф4)узии (РИД) с O-ПС антигеном, изготовленным из бруцелл вида abortus, оказалась недостаточно чувствительной, что объясняется гетерогенностью антигена по отношению к возбудителю инфекции В. melitensis (2, 7, 8).

Разработан способ диагностики бруцеллеза овец в реакции иммунодиффузии (РИД), отличающийся тем, что в качестве диагностикума используют O-ПС М-антиген, приготовленный из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, вместо O-ПС А-антигена, изготовляемого из вакцинного штамма В. abortus 19 (3, 4).

Однако известный способ диагностики может оказаться недостаточно эффективным в случаях, когда крупный рогатый скот заражается бруцеллами не только вида abortus, но и melitensis, а мелкий рогатый скот — abortus.

В настоящее время в стране существует реальная угроза возникновения эпизоотических очагов бруцеллеза как мелкого рогатого скота, так и крупного рогатого скота за счет заноса возбудителей болезни из неблагополучных регионов и даже стран (Монголия, Казахстан и др.). При этом могут иметь место факты циркуляции в стадах крупного рогатого скота бруцелл не только вида abortus, но и melitensis, а в отарах мелкого рогатого скота, наоборот — не только вида melitensis, но и abortus.

Задачей изобретения является повышение точности и достоверности выявления эпизоотически опасных в отношении бруцеллеза животных, которая решается путем исследования сыворотки крови в реакции иммунодиффузии (РИД). При этом в качестве диагностикума используется антиген, приготовленный путем механического смешивания равных частей O-ПС М-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, и O-ПС А-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. abortus 19.

Предлагаемый способ диагностики позволяет дополнительно выявить эпизоотически опасных животных в РИД до 40% по сравнению с известными способами, используемыми на основе O-ПС М-антигена и O-ПС А-антигена.

Пример 1. Определяли в РИД оптимальное соотношение частей антигенов при механическом смешивании: O-ПС М-антигена и O-ПС А-антигена. Для опыта использовали следующие соотношения М:А — 1:1, 1:2, 2:1. Предварительно сыворотки крови от крупного и мелкого рогатого скота с естественным течением инфекции исследовали в реакциях: РА и РСК. Из реагирующих на бруцеллез животных сформировали по две группы.

Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показывают, что в 1 группе из 36 гол. мелкого рогатого скота в РИД всего реагировало 31 гол. (86%), во 2 группе из 48 гол. — 20 гол. (41,7%). В РИД с помощью O-ПС М-антигена в 1 группе реагировало 28 гол. (90,3%), во 2 группе — 12 гол. (60%). С помощью O-ПС А-антигена в 1 группе реагировало 20 гол.(64,5%), во 2 группе — 8 гол. (40,0%). С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 1:2 в 1 группе реагировало 18 гол. (58%), во 2 группе — 7 гол. (35%) от общего числа животных, реагирующих в РИД. С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 2:1 в 1 группе реагировало 31 гол. (100%), во 2 группе — 19 гол. (95%). С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 1:1 в 1 группе реагировало 31 гол. (100%), во 2 группе — 20 гол.(100%). В 3 группе из 9 гол. крупного рогатого скота в РИД реагировало 5 гол. (55,6), в 4 группе из 21 гол. — 15 (71,4%). В РИД с помощью O-ПС М-антигена в 3 группе реагировало 4 гол. (80%), в 4 гр. — 12 гол. (80%). В РИД с помощью 0-ПС А-антигена в 3 группе реагировало 4 гол. (80%), в 4 группе — 14 гол. (93,3%). С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 1:2 в 3 группе реагировало 4 гол. (80%), в 4 группе — 14 гол.(93,3%); при соотношении частей М:А 2:1 в 3 группе — 3 гол. (60%), в 4 гр. — 13 гол. (86,7%); при соотношении частей М:А 1:1 в 3 группе — 5 гол. (100%), в 4 группе — 14 гол. (93,3%).

Таким образом, исследования показали, что оптимальное соотношение частей O-ПС М- и O-ПС А-антигенов при их механическом смешивании является 1:1, так как выявляет максимальное количество (от 90 до 100%) заболевших бруцеллезом животных.

Пример 2. Для опыта исследовали шесть отар овец с естественным течением инфекции. Из реагирующих на бруцеллез в реакциях РА (реакция агглютинации) и РСК (реакции связывания комплемента), сформировали шесть групп животных.

Из таблицы 2 видно: из шести групп животных — 315 голов, исследованных в реакциях РА и РСК, выявлено всего реагирующих в РИД 182 гол. (57,8%), в том числе с помощью O-ПС М-антигена выявлено больных животных — 158 (86,8%), O-ПС А-антигена — 114 (62,6%), O-ПС МА-антигена — 182 т.е. (100%). Проведенные исследования показывают, что O-ПС МА-антиген дополнительно выявляет в среднем до 13% животных, а по отдельным группам от 4 до 40%.

Бактериологические исследования биоматериала, взятого от трех животных, реагирующих на O-ПС МА-антиген, подтвердили носительство возбудителя бруцеллеза.

Пример 3. Для опыта исследовали 4 гурта крупного рогатого скота с естественным течением инфекции. Из реагирующих на бруцеллез в реакциях РА (реакция агглютинации) и РСК (реакция связывания комплемента) сформировали четыре группы животных.

Из таблицы 3 видно, что из четырех групп, исследованных животных в реакциях РА и РСК, выявлено 49 гол., из них реагирующих в РИД — 25 (51,0%), в том числе с помощью О-ПС М-антигена выявлено больных животных — 18 (72,0%), О-ПС А-антигена — 22 (88,0%), О-ПС МА-антигена — 23 т.е. (92,0%). Проведенные исследования показывают, что О-ПС МА-антиген дополнительно выявляет в среднем до 12,0%, а по отдельным группам от 7,0 до 25,0%. Бактериологические исследования биоматериала, взятого от двух животных, реагирующих на О-ПС МА-антиген, подтвердили носительство возбудителя бруцеллеза.

Результаты проведенных исследований доказывают, что предложенный смешанный О-ПС МА-антиген повышает точность и достоверность выявления как мелкого, так и крупного рогатого скота, инфицированного вирулентными бруцеллами, от 90,0 до 100% по сравнению с известными О-ПС А- и М-антигенами.

1. Антонов Б.И. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с О-ПС антигеном ИЭВСиДВ при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота /Б.И.Антонов, В.М.Чекишев, К.М.Шумилов и др. //Ветеринария. — 1994. — №11. — С.19-22.

2. Аракелян П.К. Дифференциация больных и вакцинированных против бруцеллеза овец. /П.К.Аракелян //Ветеринария. — 1996. — №11. — С.10-13.

3. Аракелян П.К. Способ диагностики мелкого рогатого скота. / П.К.Аракелян, И.А.Косилов, Е.Б.Барабанова, К.С.Димов, В.М.Чекишев // Патент РФ №2303458. — 2007.

4. Аракелян П.К., Косилов И.А., Димов К.С., Чекишев В.М., Бондарева О.В. РИД с O-ПС антигеном из В. melitensis для диагностики бруцеллеза у овец. //Ветеринария. — 2007. — №3. — С.23-25.

5. Димов С.К. Система противоэпизоотических мероприятий при бруцеллезе крупного рогатого скота для зон приуроченности болезней. /С.К.Димов, А.Г.Хлыстунов //Материалы науч.-практ. Российско-Монгольской конф. по проблемам развития АПК Монголии. /PACXTI. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1998. — С.67-68.

6. Киселев Е.А. Дифференциация вакцинированных и больных бруцеллезом животных с помощью 0-полисахаридного антигена. /Е.А.Киселев //Автореф. дис.… канд. вет. наук. — Новосибирск, 1993. — 13 с.

7. Косилов И.А. Изучение специфичности и чувствительности РИД с О-полисахаридным антигеном при бруцеллезе овец. /И.А.Косилов, П.К.Аракелян, Г.С.Клочков //Туберкулез и бруцеллез с.-х. животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири. — Новосибирск, 1995. — С.86-87.

8. Морозова Н.А. Значение РИД с О-полисахаридным антигеном при поствакцинальной диагностике бруцеллеза овец. /Н.А.Морозова //Автореф. дис.… канд. вет. наук. — Новосибирск, 2002. — 21 с.

9. Новицкий А.А. Изучение значимости методов серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 /А.А.Новицкий, Л.В.Дегтяренко, Т.Г.Попова и др. //Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. — Омск, 2001. — С.44-50.

10. Стеблева Г.М. Усовершенствование дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. /Г.М.Стеблева / Автореф. дис.… канд. вет. наук. — Новосибирск, 1998. — 23 с.

11. Филиппенко М.Л. Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. /М.Л.Филипенко, Е.А.Киселев, В.М.Чекишев., Ш.Р.Файзрахманов //Патент РФ №2035188. — 1995.

12. Чекишев В.М. Тест-система для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. /В.М.Чекишев //Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы: Материалы Междунар. науч.-практ. конф. — (Гродно, 23-24 октября). — Минск, 1997. — С.107-108.

Способ серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота с целью выявления эпизоотически опасных животных, включающий исследование сыворотки крови в реакции иммунодиффузии, отличающийся тем, что в качестве диагностикума используют антиген, приготовленный путем механического смешивания равных частей O-полисахаридного М-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1 и O-полисахаридного А-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. abortus 19.

источник

НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ инструкция по применению