Постановка рид на бруцеллез

Владельцы патента RU 2417098:

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает исследование сыворотки крови в реакции иммунодиффузии. В качестве диагностикума используют антиген, приготовленный путем механического смешивания равных частей O-поисахаридного М-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, и O-полисахаридного А-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. abortus 19. Использование предложенного способа повышает точность и достоверность диагностики бруцеллеза как мелкого рогатого скота, так и крупного рогатого скота. 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных заболеваний.

Известен способ диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота с помощью реакции иммунодиффузии (РИД) с O-полисахаридным антигеном (O-ПС), который готовится из вакцинного штамма В. abortus 19 (автор В.М.Чекишев), (1, 5, 6, 9, 10, 11, 12).

O-полисахаридный (O-ПС) антиген, изготавливавшийся из бруцелл вида abortus (RU 2035188 C1, 20.05.1995), изначально предназначался для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. При этом следует особо отметить, что его использовали в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) при диагностике бруцеллеза как дополнительный метод, позволяющий из числа положительно реагировавших в РА и РСК выявлять только животных, зараженных вирулентными бруцеллами.

Таким образом, за счет использования указанного диагностикума, решалась только проблема дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных.

Однако при бруцеллезе овец реакция иммунодиф4)узии (РИД) с O-ПС антигеном, изготовленным из бруцелл вида abortus, оказалась недостаточно чувствительной, что объясняется гетерогенностью антигена по отношению к возбудителю инфекции В. melitensis (2, 7, 8).

Разработан способ диагностики бруцеллеза овец в реакции иммунодиффузии (РИД), отличающийся тем, что в качестве диагностикума используют O-ПС М-антиген, приготовленный из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, вместо O-ПС А-антигена, изготовляемого из вакцинного штамма В. abortus 19 (3, 4).

Однако известный способ диагностики может оказаться недостаточно эффективным в случаях, когда крупный рогатый скот заражается бруцеллами не только вида abortus, но и melitensis, а мелкий рогатый скот — abortus.

В настоящее время в стране существует реальная угроза возникновения эпизоотических очагов бруцеллеза как мелкого рогатого скота, так и крупного рогатого скота за счет заноса возбудителей болезни из неблагополучных регионов и даже стран (Монголия, Казахстан и др.). При этом могут иметь место факты циркуляции в стадах крупного рогатого скота бруцелл не только вида abortus, но и melitensis, а в отарах мелкого рогатого скота, наоборот — не только вида melitensis, но и abortus.

Задачей изобретения является повышение точности и достоверности выявления эпизоотически опасных в отношении бруцеллеза животных, которая решается путем исследования сыворотки крови в реакции иммунодиффузии (РИД). При этом в качестве диагностикума используется антиген, приготовленный путем механического смешивания равных частей O-ПС М-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1, и O-ПС А-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. abortus 19.

Предлагаемый способ диагностики позволяет дополнительно выявить эпизоотически опасных животных в РИД до 40% по сравнению с известными способами, используемыми на основе O-ПС М-антигена и O-ПС А-антигена.

Пример 1. Определяли в РИД оптимальное соотношение частей антигенов при механическом смешивании: O-ПС М-антигена и O-ПС А-антигена. Для опыта использовали следующие соотношения М:А — 1:1, 1:2, 2:1. Предварительно сыворотки крови от крупного и мелкого рогатого скота с естественным течением инфекции исследовали в реакциях: РА и РСК. Из реагирующих на бруцеллез животных сформировали по две группы.

Результаты исследований, приведенные в таблице 1, показывают, что в 1 группе из 36 гол. мелкого рогатого скота в РИД всего реагировало 31 гол. (86%), во 2 группе из 48 гол. — 20 гол. (41,7%). В РИД с помощью O-ПС М-антигена в 1 группе реагировало 28 гол. (90,3%), во 2 группе — 12 гол. (60%). С помощью O-ПС А-антигена в 1 группе реагировало 20 гол.(64,5%), во 2 группе — 8 гол. (40,0%). С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 1:2 в 1 группе реагировало 18 гол. (58%), во 2 группе — 7 гол. (35%) от общего числа животных, реагирующих в РИД. С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 2:1 в 1 группе реагировало 31 гол. (100%), во 2 группе — 19 гол. (95%). С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 1:1 в 1 группе реагировало 31 гол. (100%), во 2 группе — 20 гол.(100%). В 3 группе из 9 гол. крупного рогатого скота в РИД реагировало 5 гол. (55,6), в 4 группе из 21 гол. — 15 (71,4%). В РИД с помощью O-ПС М-антигена в 3 группе реагировало 4 гол. (80%), в 4 гр. — 12 гол. (80%). В РИД с помощью 0-ПС А-антигена в 3 группе реагировало 4 гол. (80%), в 4 группе — 14 гол. (93,3%). С помощью O-ПС МА-антигена при соотношении частей М:А 1:2 в 3 группе реагировало 4 гол. (80%), в 4 группе — 14 гол.(93,3%); при соотношении частей М:А 2:1 в 3 группе — 3 гол. (60%), в 4 гр. — 13 гол. (86,7%); при соотношении частей М:А 1:1 в 3 группе — 5 гол. (100%), в 4 группе — 14 гол. (93,3%).

Таким образом, исследования показали, что оптимальное соотношение частей O-ПС М- и O-ПС А-антигенов при их механическом смешивании является 1:1, так как выявляет максимальное количество (от 90 до 100%) заболевших бруцеллезом животных.

Пример 2. Для опыта исследовали шесть отар овец с естественным течением инфекции. Из реагирующих на бруцеллез в реакциях РА (реакция агглютинации) и РСК (реакции связывания комплемента), сформировали шесть групп животных.

Из таблицы 2 видно: из шести групп животных — 315 голов, исследованных в реакциях РА и РСК, выявлено всего реагирующих в РИД 182 гол. (57,8%), в том числе с помощью O-ПС М-антигена выявлено больных животных — 158 (86,8%), O-ПС А-антигена — 114 (62,6%), O-ПС МА-антигена — 182 т.е. (100%). Проведенные исследования показывают, что O-ПС МА-антиген дополнительно выявляет в среднем до 13% животных, а по отдельным группам от 4 до 40%.

Бактериологические исследования биоматериала, взятого от трех животных, реагирующих на O-ПС МА-антиген, подтвердили носительство возбудителя бруцеллеза.

Пример 3. Для опыта исследовали 4 гурта крупного рогатого скота с естественным течением инфекции. Из реагирующих на бруцеллез в реакциях РА (реакция агглютинации) и РСК (реакция связывания комплемента) сформировали четыре группы животных.

Из таблицы 3 видно, что из четырех групп, исследованных животных в реакциях РА и РСК, выявлено 49 гол., из них реагирующих в РИД — 25 (51,0%), в том числе с помощью О-ПС М-антигена выявлено больных животных — 18 (72,0%), О-ПС А-антигена — 22 (88,0%), О-ПС МА-антигена — 23 т.е. (92,0%). Проведенные исследования показывают, что О-ПС МА-антиген дополнительно выявляет в среднем до 12,0%, а по отдельным группам от 7,0 до 25,0%. Бактериологические исследования биоматериала, взятого от двух животных, реагирующих на О-ПС МА-антиген, подтвердили носительство возбудителя бруцеллеза.

Результаты проведенных исследований доказывают, что предложенный смешанный О-ПС МА-антиген повышает точность и достоверность выявления как мелкого, так и крупного рогатого скота, инфицированного вирулентными бруцеллами, от 90,0 до 100% по сравнению с известными О-ПС А- и М-антигенами.

1. Антонов Б.И. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с О-ПС антигеном ИЭВСиДВ при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота /Б.И.Антонов, В.М.Чекишев, К.М.Шумилов и др. //Ветеринария. — 1994. — №11. — С.19-22.

2. Аракелян П.К. Дифференциация больных и вакцинированных против бруцеллеза овец. /П.К.Аракелян //Ветеринария. — 1996. — №11. — С.10-13.

3. Аракелян П.К. Способ диагностики мелкого рогатого скота. / П.К.Аракелян, И.А.Косилов, Е.Б.Барабанова, К.С.Димов, В.М.Чекишев // Патент РФ №2303458. — 2007.

4. Аракелян П.К., Косилов И.А., Димов К.С., Чекишев В.М., Бондарева О.В. РИД с O-ПС антигеном из В. melitensis для диагностики бруцеллеза у овец. //Ветеринария. — 2007. — №3. — С.23-25.

5. Димов С.К. Система противоэпизоотических мероприятий при бруцеллезе крупного рогатого скота для зон приуроченности болезней. /С.К.Димов, А.Г.Хлыстунов //Материалы науч.-практ. Российско-Монгольской конф. по проблемам развития АПК Монголии. /PACXTI. Сиб. отд-ние. — Новосибирск, 1998. — С.67-68.

6. Киселев Е.А. Дифференциация вакцинированных и больных бруцеллезом животных с помощью 0-полисахаридного антигена. /Е.А.Киселев //Автореф. дис.… канд. вет. наук. — Новосибирск, 1993. — 13 с.

7. Косилов И.А. Изучение специфичности и чувствительности РИД с О-полисахаридным антигеном при бруцеллезе овец. /И.А.Косилов, П.К.Аракелян, Г.С.Клочков //Туберкулез и бруцеллез с.-х. животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири. — Новосибирск, 1995. — С.86-87.

8. Морозова Н.А. Значение РИД с О-полисахаридным антигеном при поствакцинальной диагностике бруцеллеза овец. /Н.А.Морозова //Автореф. дис.… канд. вет. наук. — Новосибирск, 2002. — 21 с.

9. Новицкий А.А. Изучение значимости методов серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота, привитого вакциной из штамма 82 /А.А.Новицкий, Л.В.Дегтяренко, Т.Г.Попова и др. //Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. — Омск, 2001. — С.44-50.

10. Стеблева Г.М. Усовершенствование дифференциальной диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота. /Г.М.Стеблева / Автореф. дис.… канд. вет. наук. — Новосибирск, 1998. — 23 с.

11. Филиппенко М.Л. Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. /М.Л.Филипенко, Е.А.Киселев, В.М.Чекишев., Ш.Р.Файзрахманов //Патент РФ №2035188. — 1995.

12. Чекишев В.М. Тест-система для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных. /В.М.Чекишев //Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы: Материалы Междунар. науч.-практ. конф. — (Гродно, 23-24 октября). — Минск, 1997. — С.107-108.

Способ серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота с целью выявления эпизоотически опасных животных, включающий исследование сыворотки крови в реакции иммунодиффузии, отличающийся тем, что в качестве диагностикума используют антиген, приготовленный путем механического смешивания равных частей O-полисахаридного М-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. melitensis Rev-1 и O-полисахаридного А-антигена, приготовленного из вакцинного штамма В. abortus 19.

источник

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Разработка РИД-тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B. canis

Зинова Анастасия Александровна

РАЗРАБОТКА РИД-ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО В. CANIS

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных ФГУ «ВГНКИ», в лаборатории бруцеллеза ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, в городских ветеринарных лабораториях Москвы и Санкт-Петербурга, а также в Ленинградской и Волгоградской областных ветеринарных лабораториях в период с 2005 по 2009 год.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

доктор ветеринарных наук, Зенов Н.И.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных» (ГНУ«ВНИИБТЖ» СО РАСХН), г. Омск

Защита состоится «¿w » j-ЮЯёрЯ 2009 г. в Гчасов на заседании диссертационного совета Д.220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, тел/факс 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан « H€J? /l 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач РФ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бруцеллез собак, вызываемый В. canis, на сегодняшний день известен во всех странах мира. В России это заболевание относится к малоизученным. Наряду с эпизоотической и эпидемической опасностью оно препятствует успешному ведению собаководства и наносит значительный экономический ущерб отрасли, который складывается из утраты воспроизводительной функции кобелей, абортов, рождения нежизнеспособного приплода у сук, выбраковки высокопородных и ценных в племенном отношении животных.

Установлены случаи заражения людей В. canis как за рубежом, так и в России (Nidia Е., Lucero et al, 2005; Ying и et al, 1999; Михайлова Ю.П., 2000).

Сообщения о выделении культур бруцелл от собак с отличными от В. abortus, В. melitensis и В. suis свойствами были опубликованы в 60-70 годы прошлого века (Burner D.W. et al., 1968; Carmichael L.E. et al., 1966, 1968, 1981). Впервые возбудитель, ответственный за эпизоотические аборты у сук, был выделен Carmichael L.E. и предложен им совместно с Burner D.W в 1968 г. в качестве нового вида В.canis и принят под таким названием в 1974г.

В Российской Федерации бруцеллез собак, вызванный В.canis, впервые зарегистрирован в 1994г. в Волгоградской области (Шумилов К.В. и др., 1996), а впоследствии это заболевание наблюдали и в других регионах (Алиев A.A. и др., 1999; Дегтяренко JLB. и др., 1999; Малышева J1.A., 2000).

Окончательный диагноз этого заболевания устанавливают по результатам лабораторных исследований и, в первую очередь — бактериологического тестирования. Диагностическая ценность метода существенно снижена из-за ограниченного перечня тестируемых образцов, так как прижизненное бактериологическое исследование сводится преимущественно к исследованию проб крови. Гораздо более широкими представляются возможности серологического исследования, однако до выполнения настоящей работы средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, в РФ зарегистрировано не

было. Попытки разработать такие средства, одними из первых в стране, предприняли Калмыков В.В., Михайлова Ю.П., Климанов А.И., Шумилов К.В., Желудков М.М., Толмачева Т.А. в 1999-2001 гг. В ходе выполненных серологических (РА и РСК), с использованием собственных разработок, и бактериологического исследования ими были выявлены больные животные. Причем, было установлено, что пробы сыворотки крови примерно от 25 % исследованных собак проявляли антикомплементарные свойства, что ограничивает применение этой реакции (Михайлова Ю.П., 2000). Между тем известно, что в реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с О-ПС-антигеном, также как и в РСК, выявляются иммуноглобулины класса G, но она позволяет исследовать сыворотки, несмотря на их антикомплементарность.

За рубежом для диагностики заболевания применяют ряд серологических тестов: пластинчатую реакцию агглютинации (RSAT), пробирочную реакцию агглютинации (TAT) и реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (AGID) с использованием антигенов, изготовленных разными способами, и полученные при этом результаты часто варьируют (Carmichael L.E. et al, 2006; Hollet R.B., 2006).

С учетом вышеизложенного, разработку чувствительных и специфичных средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сап к, следует считать актуальной.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка тест-системы на основе реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

Для достижения этой цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

— разработать технологию получения активных и специфичных бруцеллезных R-антигена и R-сыворотки для диагностики бруцеллеза собак в РИД;

— изготовить экспериментальные серии бруцеллезных R-антигенов для диагностики бруцеллеза собак в РИД и РА;

— изготовить экспериментальные серии бруцеллезной кроличьей II-сыворотки;

— изучить специфичность и чувствительность РИД с использованием разработанных диагностикумов в сравнении с РА, РСК и бактериологическими методами исследований при диагностике бруцеллеза собак, вызываемого В. сашБ;

— разработать тест-систему для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сашз, основанную на использовании РИД, с полученными бруцеллезными К-антигенами и гомологичной им сывороткой. Изучить активность и специфичность тест-системы в ветеринарных лабораториях РФ.

Научная новизна. Впервые в стране разработана технология изготовления активного и специфичного бруцеллезного 11-антигена и оптимальная схема получения бруцеллезной И-сыворотки для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В.сашБ.

Установлена возможность получения эффективных бруцеллезных II-антигенов и К-сыворотки с использованием живой культуры штамма В.аЬог1ш КВ 17/100.

В процессе исследований с использованием набора компонентов для диагностики в РИД и РА бруцеллеза собак, вызываемого В. саше, и репрезентативной выборки проб сыворотки крови от собак получены эпизоотологические данные по этому заболеванию в Москве, Санкт-Петербурге, Московской и Ленинградской областях.

Практическая и теоретическая значимость работы. Выявление больных бруцеллезом собак с помощью разработанной тест-системы имеет важное эпизоотическое и эпидемическое значение. Обоснованные теоретически на основании анализа данных литературы и подтвержденные результатами диагностических исследований технологические подходы к разработке активных и специфичных средств для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. сагт, могут быть учтены или использованы в дальнейшем при совершенствовании диагностики данного заболевания.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссерта-

ции доложены на конференции молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2007г.) и заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006, 2007, 2008гг.).

Положения, выносимые па защиту:

— результаты разработки средств диагностики в РИД и РА бруцеллеза собак, вызываемого В. canis;

— результаты определения оптимальных параметров изготовления R-антигена и R-сыворотки для диагностики бруцеллеза собак в реакции имму-нодиффузии;

— результаты сравнительного серологического тестирования собак на бруцеллез;

— результаты лабораторных и производственных испытаний разработанных средств диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis;

— результаты идентификации и дифференциации культур бруцелл, выделенных от собак.

Публикация результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 3 научные статьи, в том числе 2 — в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 2 схемами. Список литературы содержит 185 источника, в том числе 152 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В работе были использованы: 1) культуры и штаммы бруцелл: референтные штаммы — В. canis RM 6/66, В. melitensis 16М, В. suis 1330 (из коллекции НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), производственные штаммы В. ovis 424/2,

В. abortus KB 17/100 (из Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, при ФГУ «ВГНКИ»), а также полевые культуры бруцелл; 2) сыворотки: национальная стандартная сыворотка Anti-brucella abortus (ФГУ «ВГНКИ»), негативная сыворотка крупного рогатого скота (ФГУП «Курская биофабрика»), А- и М-монорецепторные сыворотки (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), гипериммунные сыворотки крови кроликов, полученные на штаммы В. canis RM 6/66 и В. abortus KB 17/100; 3) животные: кролики массой 2,5-3,0 кг — 68 голов; 4) питательные среды: агар Альбими, мясопептонный печеночный глюкозоглице-риновый агар (МППГГА) и мясопептонный печеночный глюкозоглицерино-вый бульон (МППГТБ), мясопептонный агар (МПА), мясопеченочный бульон (МПБ), среда Сабуро — агар, среда Китт .-Тароцци под вазелиновым маслом, основной агар для бруцелл (Ml69 Hi-media), основной агар для кампилобак-теров (М994 Hi-media), поддерживающая среда для кампилобактеров (М917 Hi-media); 5) буферные растворы: фосфатный буферный раствор — ФБР (рН = 6,0; 7,0; 8,2), 0,5% фенолизированный фосфатный буферный раствор (ФБР + 0,5% фенола), карбонатно-бикарбонатный буфер (рН=9,8), М-буфер (рН = 9,1).

Постановку РИД осуществляли в агаровом геле в чашках Петри. Компоненты диагностического набора вносили в лунки, пробитые с помощью штампа. В одну центральную лунку геля агара вносили 20 мм3 антигена, а в шесть периферических — 40 мм3 исследуемых сывороток крови. В каждой чашке ставили контроль антигена с негативной и R-бруцеллезной сывороткой.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывали фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру ее диаметра, которую увлажняли 0,5%-ным феноли-зированным физиологическим раствором. Чашку плотно прикрывали крышкой и оставляли при 18-24 °С.

Учет результатов реакции проводили визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после постановки реакции.

При формировании линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой через 24 или 48 ч реакцию оценивали, как положительную.

Сыворотки крови в РА с S- и R- антигенами исследовали в соответствии с Наставлением по диагностике бруцеллеза животных, утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 29 сентября 2003 года. Бруцеллезный R-антиген для РА готовили по технологии, предложенной Калмыковым В.В. и Михайловой Ю.П., в нашей модификации. В частности, вместо B.canis при изготовлении предлагаемого ими антигена, нами была использована культура В.abortus, а также внесены другие изменения, позволившие повысить его специфичность и в четыре раза увеличить срок годности.

Бактериологическое исследование крови от собак с идентификацией и типированием выделенных культур проводили на базе лаборатории бруцеллеза ГУ «НИИЭМ» им. Н.Ф. Гамалеи. Для идентификации использовали двухсуточные агаровые культуры бруцелл, выращенные на МППГГА, МППГГБ, триптозном агаре и среде Альбими. Тинкториальные, морфологические, куль-туральные и ферментативные свойства штаммов В. canis, выделенных от больных собак, изучали в сравнении с культурами референтных штаммов бруцелл В. canis RM 6/66, В. suis 1330 и культурой полевого штамма В. canis К-01.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Подбор оптимальной схемы получения диагностической бруцеллезной R-сыворотки для РА и РИД

Согласно результатам предварительного опыта по получению диагностической бруцеллезной R-сыворотки, четырехкратное внутривенное с интервалом 7 дней введение кроликам живой культуры штамма В. canis RM 6/66 в дозах lxlO9, 2,5х109, 5×109 и 1×10 м.к./мл не обеспечивало выраженного синтеза агглютининов в организме животных. Максимальный титр сыворотки в РА с бруцеллезным R-антигеном составлял 1:200.

Это послужило основанием для выполнения исследований с использованием разных схем и способов получения требуемой сыворотки с последующим

сравнительным изучением ее активности и специфичности (табл. 1). Изготовленные сыворотки взаимодействовали с экспериментальным бруцеллезным R-антигеном в РИД по-разному. В частности, сыворотка, полученная по первой схеме иммунизации, формировала с антигеном тройные диффузные линии преципитации; по второй — двойные диффузные линии преципитации. Кроме того, при такой схеме гипериммунизации в группе из 5 кроликов погибли два; по третьей схеме, заключающейся в четырехкратном внутривенном введении кроликам живой культуры В. abortus KB 17/100 в дозах 5×109, lxlO10, 2хЮ10 и 4×10ю м.к./мл, что обеспечивало синтез агглютининов со средним титром 1:400, при максимальном его показателе у отдельных животных 1:800 — четкую одинарную линию преципитата; по четвертой — хорошо выраженные двойные линии преципитата.

С целью определения влияния дозы и кратности введения культуры на активность бруцеллезной R-сыворотки было выполнено следующее исследование. Кроликов гипериммунизировали живой культурой В. abortus KB 17/100 в дозах 2,5х109, 5 хЮ9, 1 xl 0’° и 2х10ш четырехкратно (табл. 2). Согласно табличным данным, пик активности бруцеллезной R-сыворотки в РА был зарегистрирован на 21-ый день с начала иммунизации. В РИД с гомологичным антигеном сыворотка формировала четкую одинарную линию преципитации. По истечении следующей недели титр агглютининов у части животных снизился.

2.2.2. Разработка способа получения бруцеллезного R-антигсна для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого B.canis

R-антиген для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, получали двумя способами: экстракцией антигена «солевым методом» и путем разрушения бактерийных клеток ультразвуковыми волнами. Для получения антигена были использованы производственные, аттенуированые с известными дифференциально-диагностическими свойствами штаммы В. ovis 424/2 и В. abortus KB 17/100. При тестировании антигенов, полученных «солевым методом», была исключена возможность их практического применения по причине низкой активности. В частности, гипериммунные R-сыворотки крови

Схемы гипериммунизации кроликов с целью получения бруцеллезных И-сывороток

№ Метод Штамм 1-е введение Сроки (су т)

крал. введения 7 14 21 28 40 80

Адъюв. вакцина 111 шт. КВ Доза, млрд. АД Доза Тшр АД Доза Титр АД Доза Титр АД Доза Титр АД До>а Титр АД Доза Титр

1 в/в КВ 17/100 живая 5 10 1/100 — 20 1/200 40 1/200 — — 1/400 — — 1/400 — — 1/200

г в/в — «- 5 | 10 1/100 — 20 1/200 1/200 ^ — 40 1/400 — — 1/800 — — 1/400 — — 1/200

3 в/в — «- 5 — 10 1/100 — 20 40 1/400 — — 1/800 » Г ■ 1/200 — — 1/200

4 в/в — «- — 5 | 10 1/100 — 2(1 1/200 ! — 40 1/200 — — 1/800 — — 1/400 — — 1/400

1 в/в, и/к КВ 17/100 жива« + — — — — 5 1/25 — 10 1/200 — 20 1/800 40 1/200 — — 1/400

2 в/в, 11/К — «- + — — — — 5 1/200 — 10 1/200 — 20 1/800 — 40 1/400 — — 1/400

3 в/в, п/к — «- + — — — — 5 1/50 — 10 1/400 — 20 1/800 — ; 40 1 . 1/400 — — 1/400

1 в/в, П/к’ КВ 17/100 живая + » | ■ — — + 5 1/100

2 в/в, П К» — «- ■ — — + 5 1/25 и 1/200 — | 20 1/400 40 1/400 ! — | 1/400 1

4 в/в, п/к — «- + — — — — + 5 1/100 — 10 1/100 — 20 1/800 — | 40 1/200 — — 1/100

1 в/в, п/к КВ 17/100 живая 4- 1 — — — Б 1/50 — 10 1/100 — 20 1/200 — 1 40 ! 1/400 — — 1/800

2 в/в, п/к — «- + — — — — — 5 — 10 1/400 — 20 1/400 — • 40 1/400 — — 1/800

3 в/в, п/к — «- + 1 — — — 5 1/50 10 1/400 20 1/400 40 1/800 — — 1/800

4 в/и, г|/к — «- + » 1 » — — 5 _____ 1/50 10 1/400 — 20 1/400 — 40 1/400 — —

Динамика накопления агглютининов и преципитипов

№ к ролика День с начала иммуннзацип

РА РИД РЛ РИД (характеристика линии прецппитапни) | РИД РА ! (характеристика линии преципитации) РА РИД (характеристика лнннн преципитации)

1 1/50 следы 1/200 Выраженная 1/400 Выраженная 1/400 Выраженная

2 1/50 — 1/100 Выраженная 1/200 Выраженная 1/200 Выраженная

3 — — 1/100 Выраженная 1/400 Выраженная 1/400 Выраженная

4 — — 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 Выраженная 1/200 Выраженная

5 1/50 — 1/100 Выраженная 1/400 Выраженная 1/200 Выраженная, двойная

6 1/50 — 1/100 Выраженная 1/100 Выраженная 1/200 Выраженная

7 — — 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 Выраженная 1/200 Выраженная, диффузная

8 — — 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 1/400 Выраженная 1/200 Выраженная

9 — — 1/50 Умеренно выраженная, диффузная Выраженная, диффузная 1/400 Выраженная, диффузная

10 | — 1/50 Умеренно выраженная, диффузная 1/200 | Выраженная, диффузная 1/100 Выраженная, диффузная

собак и кроликов, полученные к культурам штаммов В. canis RM 6/66 и В. abortus KB 17/100, а также сыворотки крови от собак с диагнозом, подтвержденным выделением гемокультуры В. canis, в РИД с этими антигенами реагировали отрицательно.

В связи с этим следующий этап работы был посвящен получению антигена путем ультразвуковой обработки живой и убитой культуры бруцелл вида В. abortus KB 17/100 с подбором оптимального разбавителя для суспендирова-ния культуры и определением зависимости активности антигенов от показателя концентрации микробных клеток, водородных ионов в суспензии и режима дезинтеграции.

Согласно результатам исследования, наиболее активный и специфичный антиген был получен путем обработки ультразвуком живой культуры В. abortus KB 17/100, суспендированной в ФБР (рН = 7,0).

При сравнительном изучении активности антигенов было установлено, что оптимальной для их разведения в сравнении с другими растворами и в том числе ФБР с (рН = 6,1; 7,1 и 8,3) является 0,3 %-ая формалинизированная дистиллированная вода. При этом было также установлено, что активность антигенов, полученных путем ультразвуковой дезинтеграции бруцелл, уменьшается прямо пропорционально снижению концентрации озвучиваемых суспензий. Таким образом, использовать для получения антигенов суспензии бруцелл с концентрацией менее 100 млрд микробных клеток/мл нецелесообразно.

Выбранный в качестве основного для дальнейших исследований антиген, полученный из живой культуры штамма В. abortus KB 17/100, суспендированной в фосфатном буфере с рН=7,0 путем ультразвукового дезинтегрирования в течение 60 минут, тестировали в РИД с использованием агаровых гелей с содержанием 0,85 %, 5,0 % и 10,0 % NaCl. Наибольшую активность антиген проявлял в случае использования агара, содержащего 0,85 % NaCl. Увеличение концентрации соли приводило к снижению активности антигена.

Стандартизацию активности антигена в РИД проводили с бруцеллезной R- антисывороткой крови кроликов к культуре штамма В. abortus KB 17/100 с

титром агглютининов 1:400, которую приняли в качестве стандартной. Согласно полученным результатам, рабочее разведение антигена составило 1:5. Именно в таком разведении бруцеллезный Я-антиген при взаимодействии со стандартной сывороткой в РИД формировал четкую одинарную линию преципитата.

2.2.3. Специфичность антигена для РИД

Проверка специфичности антигена в РИД с использованием набора гипериммунных и нолевых сывороток к бактериям разных родов показала, что полученный препарат специфичен (табл. 3).

Изучение специфичности бруцеллезного R-антнгсна в РИД

№ п/п Гипериммунная специфическая сыворотка РИД

1 Кампилобактсрио’шыс моноспецнфнческпе агглютинирующие сыворотки подвидов вснериалис и бубулюс Отр.

2 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая (серотип О 147) Отр.

3 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая (серотип О 149) Отр.

4 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая (серотипы О 157)

5 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая поливалентная (группа 1) Отр.

6 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая поливалентная (группа 2) Отр.

7 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая поливалентная (группа 3) Отр.

8 Сыворотка «О» — коли агглютинирующая поливалентная (группа 4) Отр.

9 Сыворотка О — агглютинирующая монореценторная сальмонелезная (рецептор 8) Отр.

10 Сыворотка О — агглютинирующая монорснепториая сальмонелезная (рецептор 7) Отр.

11 Сыворотка против рожи свиней Отр. » Отр.

12 Сыворотка гипериммунная против лептоспнроза собак

13 Сыворотка гипериммунная к Yersinia enleroeolitica серовар 0:9 (S) Отр.

14 Сыворотка гннериммуннан к Yersinia enterocolitica серовар 0:9 (R) Отр.

15 Сыворотка гипериммуииая к Yersinia enterocolitica серовар 0:3 Отр.

16 Бруцеллезная S -сыворотка из «Набора для серологической дифференциации бруцелл» (НПФ «Биоцентр») Отр.

17 Национальная стандартная сыворотка Anti-brueella abortus с.5 Отр.

18 Негативная сыворотка крови кролика Отр.

19 Негативная сыворотка крови крупного рогатого скота Огр. Отр.

20 Негативная сыворотка крови собак

21 Сыворотка крови собаки, больной лептоспирозом Огр.

22 Сыворотка крови собаки, больной вирусным гепатитом Отр.

23 Сыворотка крови собаки, больной болезнью Лайма Отр.

24 Бруцеллезная R-сыворотка №1 (В. canis RM 6/66) Пол.

25 Бруцеллезная R-сыворотка №2 (В. canis 1Ш 6/66) Пол.

26 Бруцеллезная R-сыворотка (В. abortus KB 17/100) Пол.

Отрицательные результаты были получены с сыворотками крови собак, больных лептоспирозом, вирусным гепатитом, болезнью Лайма, а также с негативными сыворотками крови собак и крупного рогатого скота.

В контроле наблюдали положительную реакцию антигена с бруцеллезными R-сыворотками крови кроликов и собак, иммунизированных культурой В. canis RM 6/66.

2.2.4. Результаты лабораторных испытаний антигена для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого B.canis

Часть клинических испытаний разработанных бруцеллезных R-антигенов была выполнена с участием сотрудников «Центра биотехнологии» ФГУ «ВГНКИ», которые проводили молекулярно-гсистические исследования проб крови и сыворотки крови собак.

Всего при исследовании 120 собак было выявлено 19 животных, сыворотки крови которых положительно реагировали в РА и РИД с бруцеллезными R-антигенами (табл. 4).

Результаты лабораторного испытания бруцеллезного R-антнгена в РИД

№ №№ R-антнген Бакнсследованне S — антиген

1 Трезн 1/100 ++ пол. + отр отр

2 Taiíiucpa 1/100 -ы- пол. + отр отр

3 Дехира 1/100++ кол. + отр отр

4 Макс 1/50++ отр отр отр огр

а Злолсй 1/200 ++ пол + отр отр

6 Саура 1/100+++ пол + отр _9ТР

7 № 10 1/200++ пол отр огр отр

9 № 12 1/100 +++ отр отр отр отр

12 № 15 1/400 ++ пол. — огр отр

14 JV» 17 1/50+++ отр — отр отр

19 №22 1/100++ отр отр отр огр

Как видно из материалов таблицы, из 19 проб сыворотки крови, реагирующих в РА, 4 пробы реагировали в титре 1:50, 7 проб — 1:100, 4 пробы -1:200, 3 пробы — 1:400 и 1 проба — 1:800.

Всего в РИД с положительным результатом были исследованы пробы сыворотки крови от 12 собак. При бактериологическом исследовании 9 проб крови от этих животных было выделено 5 культур бруцелл, идентифицированных как В. canis, что совпадало с результатами исследования этих проб в ПЦР.

2.2.5. Производственные испытания антигенов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis

На основании результатов клинического испытания бруцеллезных R-антигенов для диагностики бруцеллеза собак в РИД были изготовлены экспериментальные серии «Тест-системы для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого Brucella canis, в реакции нммунодиффузии в агаровом геле (РИД)».

Производственные испытания тест-системы были выполнены с нашим участием в городских ветеринарных лабораториях Москвы и Санкт-Петербурга и ветеринарных лабораториях Ленинградской и Волгоградской областей в период с октября 2006 г. по декабрь 2008 г.

Всего в РА и РИД с разработанными диагностикумами были исследованы 1370 проб сыворотки крови собак, из них в Москве 162 пробы, в Санкт-Петербурге — 892 пробы, в Ленинградской области — 120 проб, в Волгоградской области — 196 проб (табл. 5).

В городской ветеринарной лаборатории Санкт-Петербурга и Ленинградской областной ветеринарной лаборатории при исследовании сыворотки крови с бруцеллезными R-антигенами было выявлено 87 собак, признанных больными. При этом в РА с бруцеллезным R-антигеном 24 пробы сыворотки крови собак реагировали в титре 1:100, 30 проб — 1:200, 32 пробы — 1:400 и 1 проба-1:800.

В РИД с положительным результатом были исследованы 23 пробы сыворотки крови собак. При бактериологическом исследовании проб крови от 11 животных с положительными результатами исследования в РИД от 9 была выделена культура, идентифицированная как В. сашБ. Результаты бактериологического и молекулярно-генетического исследований совпали.

Результаты производственных испытаний Тест-системы для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В.слш

Регионы Кол-во Положительно Положительно Выяв- Бакнесле-

РФ ИСС.1СД. реагировали с реагировали с лено дование

проб К- бруцеллезны- в-руцеллезным боль- (кол-во ис-

ми антигенам« антигеном пых след./выде-

РА РИД Г РА РСК (гол.) лено куль-

892 28-1:200 22-1:100 2-1:50 23 0 0 80 11/9

ская область 120 2-1:200 2-1:100 11-1:50 0 0 0 7 0

Волгоград- 196 0 0 4-1:25 1-1:20 0 0

Всего 1370 100 23 [_4-1:25 1-1:20 87 11/9

Всего в ходе диагностических исследований по теме диссертационной работы было выявлено 106 собак больных бруцеллезом, вызванным В. сашя. Специфичность К-антигена для РИД подтверждена отрицательными результатами исследования 358 проб сывороток крови собак в г ородской ветеринарной лаборатории Москвы и Волгоградской областной ветеринарной лаборатории. Отрицательные результаты были получены при исследовании сывороток крови собак, больных лептоспирозом, вирусным гепатитом,бореллиозом, стафилококкозом, микоплазмозом и «классическим» бруцеллезом.

Следует отметить установленный факт снижения титра Л-агппотининов при повторном исследовании через 15 и 30 дней проб сыворот-

ки крови собак, которые при первичном тестировании с этим же антигеном реагировали в титре 1:25 — 1:50, при отрицательных результатах исследования в РИД. Это явилось основанием для исключения инфицирования данных животных бруцеллами (табл. 6).

Данные тестирования в РИД проб сыворотки крови собак, исследованных в РА с сомнительным и положительным результатами

№ н/п Сыворотки Результаты серологического исследования с Я-аитигепами

1-е исслед. Через 15 дн. Через 30 дн. 1-е исслед. Через 15 дн. Через 30 дн.

10 № 42539 1/50 ++++ 1/100 ++ 1/100 +++ + + +

Кроме того, нами были также зарегистрированы результаты исследования проб сыворотки крови от собак, титр 11-агглютининов в которых не превышал 1/50, но они были исследованы с положительным результатом в РИД с II-антигеном. При повторном исследовании этих животных через 15 и 30 дней наблюдали увеличение титра агглютининов при положительных результатах в РИД и выделении культуры В.сашБ.

С учетом этих данных мы считаем целесообразным проведение комплексной серологической диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis, предусматривающей одновременное тестирование в РА и РИД с R-антигенами и предлагаем для практического применения «Набор компонентов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого В. canis в РА и РИД».

При бактериологическом исследовании крови собак, положительно реагирующих при серологическом исследовании с R-бруцеллезными антигенами, было выделено четырнадцать культур бруцелл, которые идентифицировали на базе лаборатории бруцеллеза НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Типирование выделенных культур проводили в сравнении с культурами референтных штаммов В. canis RM 6/66, В. suis 1330 и В. canis К-01, выделенной из абортированного плода стаффордширского терьера в 1994 году в г. Волгограде (табл.7).

Согласно полученным результатам, типируемые культуры были представлены грамотрицательными овоидной или в виде коротких палочек бактериями, расположенными одиночно, попарно и в виде скоплений и не требующих для роста повышенного содержания СО2 при инкубировании.

По Уайту-Вилсону колонии бруцелл, выросшие на плотной питательной среде в чашках Петри после посева суспензий выделенных культур и последующего инкубирования при 37 °С в течение 4 суток, окрашивались в синий цвет с тонкими радиальными искривленными трещинами желтого цвета у части из них.

В пластинчатой РА двухсуточные агаровые культуры агглютинировались кроличьей R-сывороткой к В. canis с оценкой на 4 креста и не взаимодействовали с бруцеллезной S-сывороткой.

В пробирочной РА живые культуры в виде 2-х миллиардной взвеси в физиологическом растворе агглютинировались бруцеллезной R-сывороткой в титре 1:800 и не агглютинировались бруцеллезной S-сывороткой.

Все выделенные культуры давали положительный результат с оценкой на 4 креста в пробе с акрифлавином и отрицательный — в пробирочной РА с А-

№№ п/п Наименование штамма Форма колоний Рост на средах с добавлением Продукция Фаг «ТЬ» Агглютинация сыворотками

Фуксин 1:50000 Хиопии 1:100000 Пенициллин в И* А М

1 №77 И 3+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+14+ — — + 4+ + (нити) —

2 №839 И 3+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+14+ — — +/- 4+ — (пити) —

3 №837 Я 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ — — +/- 4+ — —

4 №838 И 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ — — +/- 4+ — —

5 № 881 И 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ — — — 4+ — —

6 № 885 И 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ — — — 4+ — —

7 № 886 я 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+14+ — — — 4+ — —

8 № 1- ПЛ ы 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ — — — 4+ — —

9 № 2- ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ — — — 4+ — —

10 № 3-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+/4+ 4+/4+ — — — 4+ — —

И № 4-ПЛ я 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+/4+ — — — 4+ — —

12 № 5-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+/4+ — — — 4+ — —

13 № 6-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ — — — 4+ — —

14 № 7-ПЛ и 4+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ — + — 4+ — —

15 В. сашз К-01 и 3+ 4+ 4+/4+ 4+14+ 4+14+ — (следы) — 4+ — —

16 В. саше 6/66 и — 4+ +/+ 4+14+ — (следы) +/- 4+ — —

17 В. зшв 1330 в — 4+ -/- -/- 4+14+ 6 мм 4+ — 3+ —

Примечание: (-) — отрицательный результат, (+, 3+, 4+) — положительный результат (оценка интенсивности реакции в крестах); * кроличья сыворотка В. сашэ (Е1-форма)

и М-монорецепторными сыворотками

Все культуры не продуцировали H2S и, в отличие от культур референтных штаммов В. canis 6/66 и В. suis 1330, оказались нечувствительными к фуксину в концентрации 1:50000. Однако все они, в том числе и референтные штаммы В. canis 6/66 и В. suis 1330 и штамм В. canis К-01, были чувствительны к тионину в разведении 1:50000 и росли на питательной среде, содержащей краситель в концентрации 1:100000.

Все выделенные культуры бруцелл росли на питательной среде с содержанием натриевой соли бензилпенициллина в концентрации 0,5, 2,5 и 5 ЕД/мл и не отличались по этому свойству от штамма В. canis К-01, тогда как культуры референтных штаммов В. canis RM 6/66 и В. suis 1330 росли только на среде, содержащей антибиотик в количестве, не превышающем 0,5 ЕД/мл.

Таким образом, согласно результатам дифференциации, все культуры бруцелл, выделенные от собак в ходе выполнения настоящей работы, были идентифицированы, как В. canis и отнесены ко «второму биовару» данного вида, как и штамм В. canis К-01.

1. Культура штамма В. abortus KB 17/100 может быть использована для получения высокоактивных и специфичных R-антигенов для диагностики в РА и РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

2. Продолжительность ультразвуковой дезинтеграции, концентрация бруцелл и водородных ионов в обрабатываемой взвеси являются факторами, определяющими активность и специфичность бруцеллезного R-антигена для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. canis.

3. Супернатант, полученный в результате ультразвуковой в течение 60 мин дезинтеграции живой культуры штамма B.abortus KB 17/100, суспендированной в фосфатном буфере с рН=7,0 с последующим центрифугированием при 15000 об/мин в течение 60 мин, является активным и специфичным антигеном, для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого B.canis, с содержанием в агаровом геле 0,85 % NaCl.

4. Критерием оценки бруцеллезной Л-сыворотки для РИД, применяемой в качестве положительного контроля антигена, служит положительный результат, проявляющийся формированием четкой одинарной линии преципитации, а не высокий уровень титра гомологичных агглютининов.

5. Собак считают больными бруцеллезом, вызываемым В. сатэ, при титре К-антител в РА не ниже 1:100 с оценкой 2 креста и выше и (или) при положительной реакции иммунодиффузии в агаровом геле с Я-антигеном и (или) при положительном результате бактериологического исследования.

При положительной РА в титре 1:50 собак считают сомнительно реагирующими на бруцеллез и исследуют повторно через 2-4 недели в РА и РИД с бруцеллезными К-антигенами и бактериологически.

В случае получения двух подряд сомнительных результатов при исследовании в РА с интервалом не менее 4 недель при отрицательных результатах тестирования в РИД и бактериологического исследования, заболевание животных исключают.

6. Положительный результат исследования сыворотки крови собак в РИД с К-антигеном свидетельствует о бактериемии у животных В. саше.

7. Выявление в Москве и Санкт-Петербурге собак, положительно реагирующих при серологическом исследовании с бруцеллезными Я-ангигенами и бактериологическом — с выделением культуры идентифицированной, как В.сашэ, с использованием репрезентативной выборки животных, свидетельствует о достаточно широком распространении данного заболевания в РФ и подтверждает актуальность внедрения в ветеринарную лабораторную практику средств его диагностики.

4. Практические предложения

— технология изготовления активного и специфичного бруцеллезного 11-антигена и оптимальная схема получения гомологичной ему сыворотки для диагностики в РИД бруцеллеза собак, вызываемого В. сатэ;

— «Набор компонентов для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого

В. сашэ, в реакции агглютинации и реакции иммунодиффузии в агаровом геле и нормативные документы на него. Регламент изготовления и контроля набора утвержден директором ФГУ «ВГНКИ», академиком РАСХН А.Н. Паниным 8 октября 2009г., Стандарт организации на набор (СТО 00494189-0039-2009) и инструкция по его применению (представлены для утверждения в соответствии с Правилами государственной регистрации лекарственных средств);

— «Методические рекомендации по диагностике бруцеллеза собак, вызываемого В. сашБ», утверждены директором ФГУ «ВГНКИ», академиком РАСХН А.Н. Паниным 8 октября 2009г.

1. Зинова A.A. Диагностика бруцеллеза собак, вызываемого В. canis. // Ветеринарная патология. — Москва, 2006, № 3 (18) — С. 11-14.

2. Скляров О.Д., Климанов А.И., Шумилов К.В., Желудков М.М, Толмачева Т.А., Зинова A.A., Ульянова М.В. Выделение и идентификация культур В. canis. // Сборник научных трудов ФГУ «ВГНКИ»,- М., 2007-Т.68.-С. 125126.

3. Яшин A.B., Кузина Т.Б., Климанов А.И., Шумилов К.В., Скляров О.Д., Зинова A.A. Бруцеллез собак, вызываемый В. canis — ретроспективный анализ встречаемости по С.-Петербургу за 2006-2007г. // Ветеринарная практика. -Санкт-Петербург, 2007, № 4 — С. 23-26

5. Список работ, опубликованных но теме диссертации

ГНУ ВНИИВСГЭ, 123022, Москва, Звенигородское ш., 5 Заказ 332/2 Тираж 100 экз.

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник