Постановка реакции райта при бруцеллезе схема

Постановка реакции агглютинации (реакция Райта) на бруцеллез

1. Для постановки реакции агглютинации на бруцеллез применяются свежие сыворотки, не имеющие гнилостного запаха, значительной коагуляции белка и гемолиза. Допускается исследование сывороток, консервированных фенолом до 0,5%, со сроком их давности не свыше 15 дней.

2. Реакция ставится на физиологическом растворе (0,85%) поваренной соли в 4 разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 : 25; 1 : 50; 1 : 100; 1 : 200, для крупного рогатого скота лошадей и верблюдов 1 : 50; 1 : 100; 1 : 200; 1 : 400 в количестве 1 мл каждого разведения в пробирках с ровным выпуклым дном.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в двух первых разведениях: для свиней, овец, коз и собак 1 : 25 и 1 : 50, для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов 1 : 50 и 1 : 100.

Для предохранения от прорастания посторонней микрофлорой рекомендуется постановка реакции на фенолизированном 0,5% физрастворе.

3. Контроль реакции ставится:
а) с отрицательной — негативной сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые сыворотки;
б) с положительной — позитивной сывороткой до предельного титра;
в) антиген с 1 мл физраствора.

4. Во все пробирки, в том числе и контроль, при постановке прибавляется 0,05 мл 10-миллиардного антигена, приготовленного согласно особой инструкции. Затем все пробирки тщательно встряхиваются до получения равномерной взвеси.

Допускается разлив сывороток в соответствующих дозах и микропипеткой. В этом случае антиген приливается по 1 мл, предварительно разведенный до 500 миллионов микробных тел в 1 мл. Сыворотки разливаются в дозах 0,04, 0,02, 0,01 и 0,005, что соответствует разведениям 1 : 25; 1 : 50; 1 : 100; 1 : 200.

5. При разливе сывороток обязательна тщательная промывка пипеток после каждой сыворотки не менее 6 раз в двух-трех посудах.

6. После тщательного встряхивания пробирки ставятся на 4—10 часов в термостат при температуре 37—38°С, затем пробирки выдерживаются при комнатной температуре 24—18 часов.

Учет реакции производится макроскопически.

7. Диагностически положительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации в разведении 1:50 для свиней, овец, коз и собак и 1 : 100 для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов с оценкой их не менее чем на два креста.

8. Диагностически сомнительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации только в разведении 1 : 25 для свиней, овец, коз, собак и 1 : 50 для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов с оценкой не менее чем на два креста.

9. Все сыворотки, давшие агглютинацию в каких-либо разведениях, исследуются повторно из той же пробы в 4 разведениях: для свиней, овец, коз и собак: 1 : 25; 1 : 50; 1 : 100; 1 : 200; для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов: 1 : 50; 1 : 100; 1 : 200; 1 : 400. При получении сомнительной реакции кровь от животного берется повторно через 3—4 недели.

10. При получении положительных или сомнительных реакций в ответе хозяйству указывается разведение, в котором получена реакция.

11. Сыворотки крупного рогатого скота, поступающие из хозяйств, в которых имелись или имеются аборты на почве бруцеллеза или выделяется значительное количество положительно реагирующих по реакции агглютинации (свежая инфекция), исследуются в 4 разведениях: 1 : 25; 1 : 50; 1 : 100; 1 : 200. При наличии макроскопической агглютинации в разведении 1 : 25, 1 : 50 не менее чем на два креста проба считается диагностически сомнительной. Если через 3—4 недели при повторном исследовании сывороток сомнительно реагирующих животных титр агглютинации не будет превышать 1 : 25, то проба признается диагностически отрицательной.

12. Если при исследовании сывороток свиней и лошадей будут получены только сомнительные реакции (у свиней 1 : 25, у лошадей 1 : 50) и при повторной проверке этих животных титр агглютинации не повысится, то при условии отсутствия в хозяйстве клинических признаков бруцеллеза среди этих видов животных и реагировавших в более высоких разведениях пробы признаются диагностически отрицательными.

13. Оценка реакции агглютинации в крестах:
++++ полное просветление жидкости при наличии явно выраженного зонтика (при встряхивании зонтик разбивается на хлопья, комочки и крупинки);
+++ те же явления, что отмечены для 4 крестов, но жидкость слегка опалесцирует (недостаточно полное просветление);
++ просветление жидкости выражено слабо, имеется наличие зонтика, который при встряхивании разбивается на хлопья, комочки и крупинки;
+ отсутствие или весьма незначительное просветление при наличии слабо выраженного зонтика или его следов, при встряхивании в жидкости заметны комочки и крупинки;
— отрицательная реакция агглютинации.

Отсутствие просветления и зонтика. Микробы могут оседать на дно в виде точки, при встряхивании разбиваются в равномерную муть.

источник

Для постановки реакции агглютинации на бруцеллёз применяют свежие сыворотки, взятые от исследуемых животных. Допускается исследование сыворотки, консервированной фенолом до 0,5% со сроком их давности не свыше 15 дней.

Реакцию ставят на физиологическом растворе (0,85 о/о) поваренной соли в четырёх разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 :25; 1 :50; 1 :100; 1 :200; для крупного рогатого скота, лошадей верблюдов 1 :50; 1 :100; 1 :200; 1 :400 в количестве 1 см 3 каждого разведения, в пробирках с ровным выпуклым дном. При массовых исследованиях допускается постановка реакции в двух первых разведениях: для свиней, коз, овец и собак 1 :25 и 1 :50; для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов 1 :50 и 1 :100. Для предохра-

нения от прорастания посторонней микрофлоры рекомендуется постановка реакции на фенолизированном 0,5 °/о физиологическом растворе.

Одновременно ставят следующие контроли: а) с отрицательной (негативной) сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые сыворотки, б) с положительной (позитивной) сывороткой до предельного её титра, в) антиген с 1 см 3 физиологического раствора. Во все пробирки, в том числе и контроли, при постановке реакции микронипеткой вводят по 0,05 см 3 антигена, содержащего в 1 см 3 10 млрд. микробных тел. Затем все пробирки тщательно встряхивают до получения равномерной взвеси.

Допускается разлив сывороток в соответствующих дозах микропипеткой. В этом случае приливают по 1 см 3 антигена, предварительно разведённого до 500 млн. микробных тел в 1 см 3 . Сыворотки разливают в дозах: 0,04; 0,02; 0,01 и 0,005, что соответствует разве-дениям: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200. При разливе сывороток обязательна тщательная промывка пипеток после каждой сыворотки не менее шести раз в 2—3 посудах. После тщательного встряхивания, пробирки ставят на 4—10 часов в термостат при температуре 37—38° С, после чего их выдерживают при комнатной (16—18° С) температуре 18—24 часа и затем учитывают реакцию. Учёт реакции производят макроскопически.

Диагностически положительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации в разведении 1:50 для свиней, овец, коз и собак и 1:100 для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов с оценкой их не менее, чем на два креста.

Диагностически сомнительной испытуемая проба сыворотки считается при наличии макроскопической агглютинации только в разведении I :25 для свиней, овец, коз, собак и 1 :50 для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов с оценкой не менее чем на два креста.

Все сыворотки, давшие агглютинацию в каких-либо разведениях исследуются повторно из той же пробы в четырёх разведениях: для свиней, овец, коз и собак 1:25; 1:50; 1:100; 1:200; для крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов 1 :50; 1 :100; 1 :200; 1 :400. При получении сомнительной реакции кровь от животного берут повторно через 3—4 недели. При получении положительных или сомнительных реакций в отчёте хозяйству указывают разведение, в котором получена реакция.

Сыворотки крупного рогатого скота, поступившие из хозяйств, в которых имеются аборты на почве бруцеллёза или где реакцией агглютинации выделяется значительное количество положительно реагирующих на бруцеллёз (свежая инфекция), исследуются в четырех разведениях: 1:25; 1:50; 1:100; 1:200. При наличии, макроскопической агглютинации в разведениях 1 :25 или 1 :50 не менее чем на два креста, проба считается диагностически сомнительной. Если при повторном исследовании сомнительно реагирующих животных титр агглютинации не будет превышать 1 : 25, то проба признаётся диагностически отрицательной.

Если при исследовании сывороток свиней и лошадей будут получены только сомнительные реакции (у свиней 1 :25, у лошадей 1 :50) и при повторной проверке этих животных титр агглютинации не повысится, то при условии отсутствия в хозяйстве клинических признаков бруцеллёза среди этих видов животных и реагировавших в более высоких разведениях, пробы признаются диагностически отрицательными.

В благополучных по бруцеллёзу хозяйствах реакции в указанных разведениях считаются сомнительными.

Оценка реакции агглютинации в крестах следующая: ++++ — полное просветление жидкости при наличии явно выраженного зонтика (при встряхивании зонтик разбивается на хлопья, комочки, в крупинки). +++ те же явления, которые отмечаются для четырёх крестов, но жидкость слегка опалесцирует (недостаточно полное просветление). ++ — просветление жидкости выражено слабо. Имеется наличие зонтика, который при встряхивании разбивается на хлопья, комочки и крупинки.

+ — отсутствие или весьма незначительное просветление при наличии слабо выраженного зонтика или его следов. При встряхивании жидкости заметны комочки и крупинки.

— отрицательная реакция агглютинации. Отсутствие просветления и зонтика. Микробы могут оседать в виде точки—пункта; при встряхивании разбиваются в равномерную муть.

источник

Возбудители бруцеллеза (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis и Brucella canis) высоко контагиозны и работа с ними проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. Постановку серологических реакций и аллергических проб для диагностики бруцеллеза производят соответственно в обычных микробиологических лабораториях и больничных условиях.

Главным резервуаром бруцелл являются домашние сельскохозяйственные животные, а также другие виды животных, от которых человек заражается преимущественно контактным или контактно-бытовым, реже алиментарным путем. Клинические проявления бруцеллеза многообразны, поражаются лимфатическая, сосудистая, гепато-лиенальная системы и особенно опорно-двигательный аппарат Методы микробиологической диагностики бруцеллеза представлены в схеме 7.

Схема 7. Микробиологическая диагностика бруцеллеза

Материал: кровь, костный мозг, моча, испражнения, грудное молоко у кормящих женщин

Серологический метод— постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА.

Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.

Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме последней дозы, в которую вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглютинации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) — сомнительная, во 2-й (0,04 мл) — слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) — положительная, во всех пробах — резко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта.

РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM,которыев отличие от IgG появляются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании.

Аллергический метод –постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положительной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая реакция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перенесенного бруцеллеза, а также после прививки.

Бактериологический метод— посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюкозы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных результатах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблюдается в течение 1 года и более.

Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО₂-инкубаторе) при температуре 37 0 С до 1 месяца, делая пересевы на скошенный печеночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестящих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида.

Выполняются также посевы исследуемого материала в желток свежего куриного яйца или в желточный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 37 0 С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл.

Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 — грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг-

Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии.

леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспецифическими сыворотками против антигеновА, М, R), чувствительности к специфическому бактериофагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8).

Таблица 8.Дифференциация основных видов бруцелл

Признак	Вид бруцелл
Br. melitensis	Br. abortus	Br. suis
Условия культивирования	аэробные	10% СО₂	аэробные
Рост на средах с красителями:
фуксином 1:50000	+	+	—
тионином 1:25000	+	—	+
пиронином 1:200000	+	+	—
Образование Н₂S	—	±	±
РА с монорецепторными сыворотками
А	±	±	+
М	±	±	±
Чувствительность к бруцеллезному фагу	—	+	±

. Обозначения: «-« — отрицательная; «+» — положительная; «±» — непостоянная реакции.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

В постановке диагноза бруцеллез очень важна роль лабораторных методов исследования, которые довольно часто приобретают решающее значение в диагностике бруцеллеза или в исключении его у обследуемого больного при учете клинико-эпидемиологических данных.

К основным методам лабораторной диагностики бруцеллеза относятся бактериологический, биологический, реакции агглютинации сыворотки крови или ликвора больных со специфическим антигеном, аллергическая проба Бюрне.

Бесспорным признаком бруцеллеза является выделение бруцелл из различных биосубстратов (кровь, моча, ликвор, костный мозг, мокрота, желчь, вагинальные выделения, экссудат из очагов воспаления, молоко кормящей женщины). Разумеется, отрицательные результаты посева еще не исключают наличие бруцеллеза.

Выделение гемокультуры зависит от температурной реакции, напряженности специфического иммунитета больного и, разумеется, от качества лабораторных сред и методов бактериологического исследования. Объединенный комитет экспертов ВОЗ по бруцеллезу рекомендует в качестве основных питательных сред использовать сыворочно-декстрозный агар, приготовленный на мясном экстракте, агар из картофельного настоя с сывороткой или кровью.

Очень редко Бруцелла выделяется из мочи, желчи, мокроты, ликвора, межплевральной жидкости, влагалищных выделений и грудного молока.
Реакция агглютинации с бруцеллезным антигеном в пробирках (реакция Райта)

Одним из основных серологических методов диагностики бруцеллеза до настоящего времени остается реакция агглютинации в пробирках, предложенная Райтом и Семплем в 1897 году. Она проста в постановке, чувствительна, высокоспецифична и положительна в титрах 1:200 в конце первой и на второй неделе болезни. При хроническом бруцеллезе титр снижается, и реакция становится сомнительной. Нарастание титра антител свидетельствует об обострении заболевания.

Реакция Райта проводится в пробирках в объеме 1 мл с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 и единым бруцеллезным диагностикумом. Последний представляет собой взвесь убитых нагреванием и фенолом бруцелл. Для пробирочной реакции диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физраствором. Методика разведения сыворотки обычна для пробирочной реакции агглютинации. Пробирки встряхивают, ставят в термостат при температуре 37° до следующего дня. Учет реакции проводят обычным способом или по 50% агглютинации (2+) в сравнении со стандартом мутности. Серийные титры 50% агглютинации 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,1:800 свидетельствуют о том, что в 1 мл исследуемой сыворотки содержится соответственно 50, 100, 200, 400, 800 МЕ антител. Выраженность реакции больного оценивают по следующей схеме: титр 1:50 оценивается как сомнительный, 1:100 – слабо положительный, 1:200 и 1:400 – положительный, 1:800 – резко положительный.

При остром бруцеллезе реакция Райта положительна у больных в титре 1:200-1:800, тогда как при хроническом бруцеллезе – в титре 1:50-1:100. В то же время обострение хронического бруцеллеза сопровождается повышением титра 1:200-1:400.

Перечисленные показатели относятся к больным, заражение которых происходило в период их кратковременного пребывания в сельской местности, неблагополучной по бруцеллезу, или в результате систематического употребления некипяченого «фляжного» молока в городе.

Иногда резко выраженная реакция Райта наблюдается у больных со слабо выраженными клиническими проявлениями бруцеллеза. Приводим пример истории болезни № 13.

Больная С., 44 года, домохозяйка. Поступила с жалобами на общую слабость. Других жалоб не предъявляла. Обратилась к участковому терапевту с просьбой назначить ей рентгеноскопию легких, так как болела раньше туберкулезом легких (снята с учета два года назад). Объективно: температура 37,1-37,5°(в течение восьми дней), кожные покровы бледные, повышенной влажности. Шейные лимфоузлы величиной с горошину, безболезненные. Костно-мышечная система без особенностей. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС – 88 ударов в минуту. В легких – дыхание жесткое, хрипы не выслушиваются. Печень и селезенка не пальпируются. Общее состояние удовлетворительное. Ввиду наличия в населенном пункте эпизоотии бруцеллеза среди овец и коз, находящихся в личных хозяйствах, больная была своевременно обследована на бруцеллез. Реакция Райта – резко положительная (1:1600), реакция Хеддльсона – резко положительная, проба Бюрне – отрицательная. Из крови выделена Bruccella melitensis.

Основным фактором, определяющим классическую форму острого бруцеллеза, является бактериемия, фаза гематогенного заноса, сопровождающаяся реактивной перестройкой организма и появлением специфических антител в сыворотке крови больных.

В патогенезе же хронических форм бруцеллеза решающую роль играют аллергия и парааллергия, что не может, в свою очередь, не отразиться на уменьшении титра антител в крови.
Серологическая реакция агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона)

Реакция Хеддльсона (пластинчатая – применяют на стекле) более чувствительна, но менее специфична, дает возможность выявлять агглютинины в первые дни болезни, быстро получить ответ. На большое (9х12см) хорошо обезжиренное сухое стекло на расстоянии 3-4 см друг от друга микропипеткой наносят исследуемую сыворотку в дозах 0,04, 0,02, 0,01 мл (опытные капли) и 0,02 мл (контрольная капля). К трем первым каплям сыворотки добавляют по 0,03 мл единого неразведенного диагностикумума, к последней – 0,03 мл физраствора. Максимальный срок наблюдения – 8 минут. Учет осуществляют невооруженным глазом по 4+ системе. При положительной реакции в опытных каплях появляются хлопья и жидкость становится более или менее прозрачной. Агглютинацию во всех трех дозах 4+ принимают за резко положительный результат, в первой и второй дозах – за положительный результат, только в первой дозе – сомнительный результат, отсутствие агглютинации во всех дозах – отрицательный результат.

Применяется в модификации Е. Кайтмазовой для массовых обследований.
Другие серологические методы диагностики

Используются РСК, РПГА, положительная с разведения 1:100, реакция иммунофлюоресценции и антиглобулиновая проба Кумбса. В последнее время апробирована и получила высокую оценку, особенно в диагностике хронического бруцеллеза (до 65%), реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА), позволяющая определять антигенемию бруцелл.
Аллергическая внутрикожная проба Бюрне

Одним из основных факторов, определяющих клинические проявления бруцеллеза, является гиперчувствительность замедленного типа.

Степень специфической сенсибилизации организма при различных клинических формах бруцеллеза неодинакова. Она проявляется как общей, очаговой, так и местной реакцией. Исходя из этого, в 1922 году Бюрне предложил с целью диагностики бруцеллеза внутрикожную аллергическую пробу. Известно, что эта проба основана на способности организма, зараженного бруцеллезом, отвечать местной реакцией на внутрикожное введение бруцеллезного антигена.

Местная реакция может проявляться в виде отека, болезненности, гиперемии. Внутрикожная проба Бюрне ставиться согласно общепринятой методике. Используется 0,1 мл бруцеллина, который вводится внутрикожно на внутреннюю (ладонную) поверхность предплечья. Слабооположительная реакция считается при наличии отека при1-3 см, положительная реакция – при отеке 3-6 см, резко положительная реакция – при отеке более 6 см. Проба Бюрне считается также резко положительной (независимо от размера отека), если имеется лимфангоит или лимфаденит, либо некроз в месте введения бруцеллина. Оценку реакции проводят через 24 (рис. 18) и 48 часов (рис. 19). Значение ее выше в хронической стадии заболевания. Проба может быть положительной у вакцинированных лиц.

Рис. 18. Проба Бюрне через 24 часа.

Рис. 19. Проба Бюрне через 48 часов.

Особо необходимо отметить появление у некоторых больных бруцеллезом гиперергической реакции в ответ на введение аллергена, которая выражается в значительном повышении температуры (39-40°), в усилении болевого синдрома, иногда в появлении аллергической сыпи. В этих случаях повторная постановка пробы Бюрне противопоказана.

Для каждой формы бруцеллеза характерны следующие методы диагностики:

При остросептической форме бруцеллеза, соответствующей фазе выраженной генерализации инфекции, наблюдаются высокие титры реакции Райта и резко положительная реакция Хеддльсона. РСК при остросептической форме бруцеллеза отстает по чувствительности от реакции агглютинации. Наряду с этим наблюдается нерезко выраженная сенсибилизация к бруцеллезному антигену.
Переход остросептической формы бруцеллеза в септико-метастатическую и вторично-хроническую форму характеризуется патогенетическим метастазированием возбудителя в органы и системы, сопровождается снижением гуморального иммунитета. Об этом свидетельствует существенное уменьшение числа положительных реакций агглютинации Райта и реакции Хеддльсона. Наряду с этим значительно увеличивается количество больных с положительной и резко положительной аллергической пробой Бюрне.
При первично-хронической форме бруцеллеза, начинающейся постепенно, исподволь и отличающейся меньшей выраженностью клинических симптомов, положительные реакции Райта и Хеддльсона обнаруживаются несколько реже, чем при вторично-хронической форме. Более чувствительной, чем серологические реакции, при первично-хроническом бруцеллезе является внутрикожная аллергическая проба Бюрне. Серологические реакции, как и аллергическая проба Бюрне, при первично-хроническом бруцеллезе наиболее выражены в первые два года от начала заболевания, после чего наблюдается их постепенное «угасание».

В постановке диагноза нейробруцеллеза важную роль играют такие методы диагностики, как компьютерная томография головного мозга и магнитно-резонансная томография.

АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ

Обязательные диагностические исследования:

Общий анализ крови, общий анализ мочи, RW, биохимический анализ крови (общий белок и его фракции, С-реактивный белок, сиаловые кислоты, серомукоид, билирубин, трансаминазы, тимоловая проба), сахар крови, анализ крови на ревмопробы.
Бактериологический метод при подозрении на острый бруцеллез (посевы крови, пунктата костного мозга, лимфатических узлов).
Реакция Райта.
Реакция Хеддельсона.
Проба Бюрне.

Дополнительные диагностические исследования (по показаниям и наличии возможности)

КТ и МРТ головного мозга.
Электроэнцефалография.
Компьютерная паллестезиометрия
Анализ ликвора.
Исследование глазного дна.
Анализ синовиальной жидкости и биоптата синовиальной оболочки, рентгенологическое и ультразвуковое исследование (артросонография), радинуклеидная сцинтиграфия опорно-двигательного аппарата.
Консультации ортопеда, ревматолога, невролога, окулиста, кардиолога, уролога, гинеколога, гастроэнтеролога, дерматолога, иммунолога.

ЛЕЧЕНИЕ БРУЦЕЛЛЕЗА

Большое количество разнообразных средств и методов, предложенных для лечения больных бруцеллезом, свидетельствует о клиническом полиморфизме данной инфекции и о недостаточной эффективности этих средств. Вот почему проблема лечения бруцеллеза до настоящего времени не нашла удовлетворительного разрешения, хотя, по справедливому замечанию Коровицкого Л.К., мнение о полной неизлечимости бруцеллеза следует считать ошибочным.

Показания и противопоказания

В лечении нуждаются все пациенты с наличием совокупности клинико-эпидемиологических данных и результатов специального обследования, позволяющих поставить диагноз «бруцеллез».

При выявлении положительных серологических и (или) аллергологических тестов при отсутствии клинических проявлений заболевания (группа положительно реагирующих на бруцеллез) лечение не проводится. В этом случае необходимо тщательное обследование врачом инфекционистом два раза в год с обязательным лабораторным исследованием сыворотки крови на бруцеллез и, при необходимости, специалистами по профилю выявленной патологии.

Дифференциальные подходы к терапии бруцеллеза

Эффективность лечения больного бруцеллезом зависит от многих факторов. Прежде всего, это своевременное установление диагноза и назначение адекватной специфической и патогенетической терапии. Однако и при выявлении этого условия лечение бруцеллеза представляет трудную проблему. Одной из причин является многообразие клинических форм, механизмов, лежащих в основе тех или иных проявлений; в связи с этим необходимо индивидуализировать терапию.

Так, при наличии активного инфекционного процесса (острый, острый рецидивирующий, хронический активный бруцеллез в стадии обострения), сопровождающегося свободной циркуляцией возбудителя в кровеносном русле, требуется назначение антибактериальных средств. При хроническом бруцеллезе чаще всего на первое место выступают патологические иммунологические реакции, в связи с чем место этиотропной терапии занимает патогенетическая. Кроме того, наличие многочисленных очаговых проявлений и сопутствующей патологии вносит свой вклад в неизбежность полипрагмазии и, соответственно, увеличения риска побочных реакций.

Таким образом, при составлении плана лечения больного бруцеллезом необходимо учитывать форму заболевания, стадию процесса, совокупность и характер очаговых поражений, наличие сопутствующей патологии, аллергологический анамнез, возраст пациента – то есть терапия должна быть строго дифференциальной.

Антибактериальная (этиотропная) терапия составляет основу лечения больных с острой и рецидивирующей формой бруцеллеза. При выборе антибактериального средства необходимо, прежде всего, учитывать чувствительность к нему бруцелл, а также преимущественно внутриклеточную локализацию возбудителя и механизм транспорта лекарственного препарата внутрь клетки. Имеет значение спектр побочных эффектов антибиотика и совокупность органопатологии у больного, наличие индивидуальной непереносимости медикаментов.

источник

Бруцеллёз – серьёзное заболевание, переносчиком которого являются домашние животные. Его опасность заключается в том, что симптомы бруцеллёза у человека схожи с теми, которые сигнализируют о начале простудного заболевания. Между тем бруцеллёз поражает многие органы и без должного лечения способен привести к инвалидности. Для того чтобы своевременно выявить заболевание, в подавляющем количестве случаев достаточно сдать кровь на реакции Райта и Хеддельсона. Данные методы являются быстрыми и информативными.

Возбудителями бруцеллёза являются бактерии, имеющие название бруцеллы. Они устойчивы во внешней среде и погибают исключительно под воздействием высоких температур.

Основными носителями и переносчиками инфекции являются животные (в зависимости от вероятности заражения расположены в списке по убыванию):

Существуют следующие пути заражения человека:

контактный – при уходе за животными, разделывании туш, работе с навозом;
алиментарный – при употреблении в пищу мясных и молочных продуктов, не прошедших термическую обработку;
аэрогенный – при вдыхании воздуха с пылью, содержащей бруцеллы (например, в загонах и на пастбищах).

Бруцеллы жизнеспособны: в воде они сохраняют свою активность не менее 2 месяцев, в парном мясе – 3 месяца, в засоленном – 1 месяц, в молоке – 1,5 месяца, в брынзе – 2 месяца, в шерсти животного – 4 месяца.

Важно, что заболевание не передаётся от инфицированного человека здоровому.

В большинстве случаев симптомы бруцеллёза у человека схожи с простудными, иногда вовсе отсутствуют на раннем этапе развития заболевания.

Чаще всего бруцеллёз поражает следующие системы человеческого организма:

нервную;
сердечно-сосудистую;
опорно-двигательную;
мочеполовую;
репродуктивную;
пищеварительную;
зрительную;
лимфатическую.

Когда бруцеллёз переходит в хроническую форму (спустя 3 месяца после инфицирования), в организме человека происходят необратимые изменения, чаще всего приводящие к инвалидности. Симптомы проявляются тем ярче, чем тяжелее степень заболевания.

На начальной стадии отмечаются:

слабость, общее недомогание;
повышенная утомляемость;
дискомфорт при движении конечностями;
нервозность;
головная боль;
нарушение аппетита;
бессонница.

На более позднем этапе появляются следующие симптомы:

высокая температура тела (отметка на термометре может достигать 40 градусов), которую крайне тяжело или невозможно снизить;
сильные мышечные и суставные боли;
дискомфорт при любом движении тела;
повышенное потоотделение (наблюдается как в дневные, так и в ночные часы);
психические и эмоциональные расстройства.

На осмотре врач при пальпации обнаруживает увеличение в размерах печени, селезёнки и лимфоузлов.

Во время первичного приёма терапевту необходимо дать ответы на вопросы:

какие симптомы беспокоят;
профессиональная занятость;
имеется ли контакт с домашними животными;
район проживания.

При подозрении на бруцеллёз специалист назначает пациенту один из возможных видов диагностики или сразу несколько:

анализ крови;
пункция лимфоузлов;
пункция спинномозговой жидкости.

В подавляющем большинстве случаев диагноз исключается или подтверждается после анализа взятой у пациента крови.

Одними из самых эффективных методов лабораторной диагностики бруцеллёза являются реакции Хеддельсона и Райта.

Реакция Хеддельсона и реакция Райта – серологические методы (т. е. подразумевающие выявление и исследование антител в биоматериале человека), дополняющие друг друга.

На практике широко используются реакции агглютинации в пробирках (реакция Райта) и на стекле (реакция Хеддельсона). Тест на агглютинацию предполагает выявление антител, вступающих в реакцию с антигенами бруцелл. Изучение антител реакцией Хеддельсона широко применяется при необходимости обследования большого числа людей. Это обусловлено его простотой и эффективностью.

Показаниями для анализа служат:

массовые вспышки инфекции;
частые контакты с домашними животными, в т. ч. по профессиональной необходимости;
оценка состояния иммунитета перед введением вакцины;
наблюдение за развитием уже имеющегося заболевания.

Перед тем как сдать кровь, необходимо подготовиться:

за 4 часа до забора крови запрещается принимать пищу, допускается пить только бутилированную негазированную воду;
за 1-2 дня рекомендуется снизить интенсивность физических нагрузок;
за 48 час. исключить курение и употребление алкогольных напитков.

Реакция Хеддельсона – качественный анализ, он не даёт информацию о количественном содержании антител.

Результаты анализа, их интерпретация:

«отрицательный» — в крови антитела не выявлены, бруцеллёз исключён;
«сомнительный» — необходимо сдать кровь повторно для подтверждения или исключения бруцеллёза, перед этим строго следовать правилам подготовки;
«положительный» — бруцеллёз подтверждён, нужно дополнительно сдать кровь на реакцию Райта для определения количественного содержания антител.

Показаниями для анализа служат:

диагностика бруцеллёза;
количественное определение антител в крови и окончательное подтверждение диагноза после проведённого анализа крови на реакцию Хеддельсона.

Следует отметить, что, несмотря на большое количество серологических исследований, данный метод диагностики наиболее информативен.

забор крови осуществляется в утренние часы натощак (минимум 4 часа до анализа запрещено употреблять пищу);
за 48 час. исключить курение и употребление алкогольных напитков;
за 7 дней рекомендуется значительно ограничить физические нагрузки.

Реакция Райта – количественный анализ, его результаты выдаются в виде числового значения титра:

0-40 – результат отрицательный, бруцеллёз исключён;
40-50 – результат сомнительный, требуется повторно сдать кровь на анализ, строго соблюдая правила подготовки;
50-100 – не исключается наличие бруцеллёза, возможно 2 варианта: пациент уже когда-то перенёс бруцеллёз и в его организме имеются антитела, либо болезнь на начальной стадии развития; рекомендуется дополнительное обследование с целью подтверждения или исключения заболевания;
100-200 – бруцеллёз подтверждён, высока вероятность перехода заболевания в хроническую форму;
свыше 200 – подтверждена острая форма бруцеллёза.

Реакции Райта и Хеддельсона на бруцеллёз – два уникальных метода диагностики, позволяющих выявить заболевание на любой стадии и определить количественное содержание антител, что позволяет своевременно начать лечение и подобрать максимально эффективную схему терапии.

источник

МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ,

МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЛОСТИ РТА

Учебно-методическое пособие для студентов

II курса стоматологического факультета

Составители:

доцент кафедры микробиологии КубГМУ, к.б.н. Ф.Ш. Сиюхова;

Под редакцией: Ф.Ш. Сиюховой

«Микробиология, вирусология, микробиология полости рта»: учебно-методическое пособие для студентов II курса стоматологического факультета.

Краснодар, КМИ, 2017. – 120 с.

Учебно-методическое пособие составлено в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования по специальности 31.05.03 Стоматология, с примерной программой по дисциплине «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» и с действующей учебной программой курса микробиологии, иммунологии, вирусологии КМИ по обучению студентов стоматологов.

Предназначено для студентов II курса стоматологического факультета. Сведения, изложенные в пособии, необходимы для успешного освоения дисциплины, формирования грамотного специалиста.

ПРЕДИСЛОВИЕ

Учебно-методическое пособие «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» раскрывает содержание лабораторных работ, знакомит с основными методами микробиологической диагностики, стерилизации, дезинфекции; биологией возбудителей, специфической профилактикой и лечением инфекционных поражений полости рта. Цельюявляется знакомство студентов-стоматологов, обучающихся на кафедре микробиологии с тематикой лабораторных занятий, порядком проведения микробиологической диагностики инфекций, вопросами к занятию, определяющими основной подход к теоретической подготовке студента, позволяющий успешно провести лабораторную работу, понять суть изучаемого явления, подготовиться к теоретическому экзамену и дальнейшему изучению клинических предметов. Пособие также содержит дополнительный материал по ряду разделов.

Часть II учебно-методического пособия «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» содержит методические разработки по проведению лабораторного практикума по полутора модулям, из 5 предусмотренных учебно-методическим комплексом, разработанным кафедрой микробиологии КубГМУ. В частности содержит методические рекомендации по лабораторному практикуму модуля IV: «Частной медицинской микробиологии» и второй части модуля V: «Клиническая микробиология полости рта».

Учебно-методическое пособие рекомендуется для использования при подготовке к лабораторным занятиям. Для эффективного изучения учебного материала в первую очередь необходимо ознакомиться с планом лабораторного занятия и контрольными вопросами, изложенными в пособии. Затем с помощью лекционного материала, учебной литературы и приложений к занятиям настоящего издания изучить теоретический материал. После этого с помощью данного пособия следует ознакомиться с порядком выполнения лабораторной работы, оформить протокол в рабочей тетради.

Часть II учебно-методического пособия «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» рекомендована для студентов II курса стоматологического факультета в IV семестре обучения на кафедре микробиологии.

Часть II пособия изложена на 120 страницах, состоит из введения, полутора модулей, вопросов к итоговому контролю по ним.

Микробиология, вирусология, микробиология полости рта является фундаментальной наукой, предметом, которой является изучение микроорганизмов в жизнедеятельности человека в норме и патологии. Это и раскрывает актуальность знания микробиологии каждым врачом-стоматологом.

Часть II учебно-методического пособия «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» содержит материал по подготовке к лабораторным и семинарским занятиям по 1,5 модулям и представлена: модулем IV — Частной медицинской микробиологией и частью II (частной) модуля V — Клинической микробиологией полости рта. Пособие позволяет системно, последовательно изучать теорию, осваивать методологию предмета, что необходимо для успешного усвоения дисциплины. Приведенные в пособии методические разработки по всем предусмотренным IV семестром обучения по дисциплине: «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» занятиям позволяет студенту не только познакомиться с методами микробиологической диагностики инфекций, порядком проведения экспериментов, но и сориентироваться в теории, которая будет использована на занятии. Пособие систематизирует самостоятельную работу по подготовки к занятию, делая ее целостной и направленной, что необходимо, учитывая сложность и обширность предмета.

Знания по дисциплине: «Микробиология, вирусология, микробиология полости рта» являются базой для таких предметов, как: патофизиология, иммунология, бактериальные и вирусные инфекционные болезни, туберкулез, дерматовенерология, акушерства и гинекологии, хирургии, терапии, травматологии и ортопедии, профилактики стоматологических заболеваний, пропедевтики стоматологических заболеваний, стоматологии терапевтической, стоматологии хирургической, стоматологии ортопедической.

ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ

МИКРОБИОЛОГИЯ

Тема: ОСОБО ОПАСНЫЕ ИНФЕКЦИИ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЧУМЫ, БРУЦЕЛЛЕЗА

План занятия

1. Возбудитель чумы. Морфология — демонстрация готовых препаратов-мазков.

2. Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков из убитых культур бруцелл.

3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза. Выделение гемокультуры (разбор).

4. Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Райта. Регистрация результатов реакции Райта.

5. Ускоренный метод серологической диагностики бруцеллеза – реакция Хеддлъсона и др.

6. Аллергическая диагностика бруцеллеза. Постановка пробы Бюрне (разбор).

7. Знакомство с иммунопрепаратами, применяемыми для диагностики, профилактики и лечения чумы, бруцеллеза (диагностикумы, аллергены, вакцины, сыворотки).

Методические указания

1. Возбудитель чумы. Морфология — демонстрация готовых препаратов-мазков.

Промикроскопировать готовые препараты-мазки возбудителя чумы и зарисовать в рабочую тетрадь. Обратить внимание на морфологию и тинкториальные свойства микроорганизма.

3. Приготовление, окраска и микроскопия препаратов-мазков из убитых культур бруцелл

Приготовить, окрасить по Граму и промикроскопировать препарат из убитой культуры бруцелл. Обратить внимание на размеры микроорганизмов.

Рис.1. Yersinia pestis, окраска по Граму

Рис. 2. Yersinia pestis окраска метиленовой синью

4. Серологическая диагностика бруцеллеза. Реакция Райта. Регистрация результатов реакции Райта

Поставить реакцию Райта с сывороткой больного бруцеллезом по классической схеме пробирочной реакции агглютинации. Диагностический титр реакции Райта — 1:200.

Зарегистрировать в таблице результаты реакции Райта. Сформулировать и записать вывод: указывают ли результаты реакции на наличие заболевания бруцеллезом у данного больного?

Регистрация результатов реакции Райта

Разведения сыворотки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	Контроль
Результат реакции

5. Ускоренный метод серологической диагностики бруцеллеза – реакция Хеддлъсона и др.

На стекле размечают карандашом 4 квадрата размером 3×3 см каждый. Микропипеткой наносят в квадраты капли сыворотки объемом 0,04, 0,02 и 0,01 мл, в последний квадрат одну каплю (0,03 мл) физиологического раствора (контроль). В каждую каплю другой микропипеткой добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума. Перемешивают капли стеклянной палочкой пли петлей, начиная с контрольной капли и идя от меньших количеств сыворотки к большим. Слегка подогревая и покачивая стекло, наблюдают за появлением агглютинации, которая должна наступать в течение 5 минут.

Оценка реакции: агглютинация только в первой капле – реакция сомнительная; агглютинация в первой и второй каплях – реакция положительная; агглютинация во всех трех каплях – реакция резко положительная.

Примечание:Реакция Хеддльсона имеет только скрининговое, ориентировочное значение. В случае ее положительного результата необходимо ставить более надежные серологические реакции (Райта, РПГА, ИФМ) и/или аллергическую пробу Бюрне.

Зарисовать реакцию Хеддльсона с указанием доз сыворотки в каждой капле.

источник

Райта реакция (А. Е. Wright) — серологический метод лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции.

Реакция Райта высоко специфична и становится положительной с самого начала болезни. Наиболее высокие титры реакции Райта (80% и выше) обычно наблюдаются через 1—2 мес. после начала заболевания и сохраняются на протяжении лихорадочного периода. В дальнейшем титры реакции начинают падать, и к концу первого года заболевания реакция Райта, как правило, становится отрицательной. Появление и накопление агглютининов в крови больных бруцеллезом зависят от степени антигенного раздражения. Поэтому наиболее высокие показатели титров агглютининов наблюдаются в фазе бактериемии, резко снижаясь по мере затухания инфекционного процесса.

Иногда реакция Райта сохраняется положительной до 2—3 и даже 5 лет после перенесенного заболевания. Однако в этих случаях следует иметь в виду возможность повторного заражения и рецидивов заболевания. В некоторых случаях классического бруцеллеза (см.), подтвержденного выделением гемокультуры и положительной аллергической пробой, реакция Райта может быть отрицательной; это возможно при заражении организма измененным в антигенном отношении штаммом бруцелл. Благодаря некоторой общности в антигенной структуре слабоположительные результаты реакции Райта могут быть у людей, инфицированных возбудителями туляремии, холеры, и при некоторых других инфекционных заболеваниях, а также у лиц, вакцинированных против этих инфекций. Слабоположительная реакция Райта (в разведениях 1:50 и 1:100) иногда наблюдается и у здоровых женщин в последние недели беременности. Повторная постановка реакции Райта (наблюдение за ее динамикой) позволяет дифференцировать специфическую реакцию Райта от неспецифической, так как повышение титров указывает на наличие бруцеллезной инфекции.

Существенную роль в реакции Райта играет подбор штаммов для приготовления диагностикума (диссоциированные штаммы для этой цели не пригодны), а также концентрация применяемой микробной взвеси. Кроме антигена, источником ошибок может быть и исследуемая сыворотка. Она должна быть свежей, негемолизированной, прозрачной (без эритроцитов и пр.) и без признаков прорастания посторонней микрофлорой.

При постановке реакции Райта иногда наблюдаются так называемые проагглютинационные зоны, т. е. отрицательный результат с малыми разведениями сыворотки и четко выраженный положительный результат при более высоких разведениях; возможно также выпадение агглютинации в средней части ряда разведений. Явление это чаще наблюдается при высоких титрах сывороток и делает необходимым применение длинного ряда разведений. Появление феномена зоны, по-видимому, связано с наличием в сыворотках крови неполных (блокирующих) антител. Сыворотку крови для исследования получают обычным способом.

Реакцию Райта ставят всегда с двумя контролями: а) контроль каждой из исследуемых сывороток для исключения ложной агглютинации за счет выпадения белков самой сыворотки и б) контроль антигена — одна пробирка при любом количестве исследуемых сывороток — для исключения спонтанной агглютинации антигена. Физиол. раствор, применяемый для разведения сыворотки и антигена, должен изготовляться на дистиллированной воде нейтральной реакции (рН=6,9—7,1) и во избежание прорастания содержать 0,5% карболовой кислоты. Реакцию Райта ставят не менее чем в пяти разведениях (1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и 1:800) в объеме 1 мл каждое. В качестве антигена применяют диагностикум, подтитрованный по национальной стандартной противобруцеллезной агглютинирующей сыворотке. Перед употреблением диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физиологическим раствором. В 1 мл разведенного диагностикума содержится около 6-109 микробных клеток.

Учет реакции производят через 24 часа путем сравнения степени просветления в опытных пробирках с соответствующим стандартом мутности, который готовят следующим образом. В 4 пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл разведенного диагностикума, затем в том же порядке добавляют 3, 2 и 1 мл карболизированного физиологического раствора, в последнюю пробирку ничего не добавляют. После взбалтывания содержимого берут по 0,5 мл антигена каждой концентрации и 0,5 мл карболизированного физиологического раствора. Таким образом получают 4 пробирки стандарта мутности с различной степенью просветления (75% — 3—, 50% — 2 — и 25% — 1 — и отсутствие просветления), которые вместе с опытными пробирками помещают в термостат при t° 37° на 24 часа, после чего производят учет реакции. Для единой системы учета в настоящее время рекомендуют выражение титров сывороток в международных единицах антител (ME). Диагностическим титром исследуемой сыворотки считается 50% агглютинации (2+).

Перечисление титра сыворотки на международные единицы производят следующим образом. Стандартизированный диагностикум со стандартной противобруцеллезной агглютинирующей сывороткой, содержащей 1000 ME антител в 1 мл, дает 50% агглютинации в разведении этой сыворотки 1 : 500. Следовательно, титры исследуемой сыворотки 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 и т. д. с применением стандартизированного диагностикума указывают на то, что в 1 мл исследуемой сыворотки содержится 100, 200, 400 и т. д. международных единиц антител. Таким образом, перечисление титра исследуемой сыворотки на международные единицы производят путем его удвоения. При диагностической оценке результатов реакции агглютинации рекомендуется следующая схема: титр сыворотки 1 : 50 (100 ME) — результат сомнительный, 1 : 100 (200 ME)— слабо положительный, 1 : 200 (400 ME) — положительный, 1 : 200 и выше (800 ME)— резко положительный.

источник

Агглютинация – это склеивание и выпадение в осадок микроорганизмов или других клеток(корпускулярных антигенов) под действием специфических антител в присутствии электролитов.

Развернутая РА в пробирках (объемный способ) применяется для серологической диагностики инфекционных заболеваний, то есть для определения динамики нарастания титра противомикробных антител в сыворотке крови (реакция Видаля — при брюшном тифе и паратифах, р. Вейгеля— при эпидемическом сыпном тифе, р. Райта— при бруцеллезе и др.) и для серологической идентификации микробов.

РА Видаля применяется с целью серодиагностики брюшного тифа и паратифов А и В, то есть для определения антител, и изучения динамики нарастания и сохранения антител против S.typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi B, которые обнаруживаются в крови больного со 2-ой недели заболевания.

1)исследуемая сыворотка крови в разведениях от 1:100 до 1:800;

2) три диагностикума — взвеси убитых сальмонелл: S.typhi, S. paratyphi A и S. paratyphi В;

3) изотопический раствор хлорида натрия (электролит).

Реакция ставится в три ряда пробирок по 5 пробирок в каждом ряду, из которых 4 опытных и одна контрольная (физ.раствор+диагностикум).

1) в термостате в течение 2 часов при 37°С, при этом образуются крупнохлопчатый осадок за счет жгутикового Н-антигена;

2) при комнатной температуре в течение 18-24 часов, выпадает мелкозернистый осадок за счет соматического О-АГ.

Механизм реакции. Реакция протекает в две фазы:

1) соединение АГ с АТ (специфическая фаза);

2) выпадение образовавшегося комплекса АГ-АТ (агглютината) в растворе солей (электролите) в осадок (неспецифическая фаза).

Антигены поливалентны, а антитела двух – (IgG) или более валентны (IgМ). Соединение их приводит к образованию макроконгломератов, выпадающих в осадок.

При учёте реакции сначала просматривают контрольную пробирку. В ней при лёгком встряхивании наблюдается равномерное помутнение, хлопьев не должно быть. Опытные пробирки просматривают одновременно с контрольной, держа в одной руке и встряхивая. При положительной реакции обнаруживаются хлопья из склеенных бактерий. Учитывают максимальное разведение сыворотки, при котором произошла отчетливая агглютинация (титр сыворотки). Диагностический титр равен 1:200, то есть реакция считается положительной при наличии агглютинации в разведении сыворотки 1:200 и более (рис.28).

1) реакция положительна начиная со 2-ой недели заболевания;

2) реакция положительна в 3-х случаях: у больных («инфекционная» реакция), у переболевших («анамнестическая») и у вакцинированных («прививочная»).

Для дифференциации реакций прибегают к повторной постановке ее через 5-6 дней. У больных отмечается нарастание титра антител в 4 и более раза. При «прививочной» и «анамнестической» реакциях титр антител не изменится;

3) реакция может быть группоспецифической — положительной с двумя или тремя антигенами. При групповой агглютинации учет реакции проводится по максимальному титру антител.

Реакцию Видаля можно поставить одновременно с Н- и О-антигенами бактерий брюшного тифа, что помогает дифференцировать «инфекционную» от «прививочной», так как у привитых и переболевших обнаруживаются только Н-антитела, О- агглютинин в высоком титре отмечается только в разгар болезни.

РА Вейгеляставится с диангостикумомRicketsia prowazekii (взвесь убитых риккетсий), РА Райта – с бруцеллезным диагностикумом (взвесь убитых бруцелл: B. melitensis, B. abortus и B. suis).

9.3 РПГА – реакция пассивной гемагглютинации (определение напряженности поствакцинального противодифтерийного и противоскарлатинозного антитоксических иммунитетов)

Под РПГА понимают реакцию, в которой АТ-а взаимодействуют с высокодисперсными АГ (гаптенами), предварительно адсорбированными на корпускулярных носителях — эритроцитах, которые при этом склеиваются (рис.29).

Компоненты РПГА, применяемой для определения напряженности поствакцинального противодифтерийного антитоксического иммунитета:

1) испытуемая сыворотка крови в разведениях от 1:10 до 1:20480;

2) диагностикум дифтерийный эритроцитарный – дифтерийный анатоксин, адсорбированный на поверхности эритроцитов;

3) физиологический раствор;

4) противодифтерийная контрольная сыворотка с активностью 10МЕ/мл;

5) полистероловые пластины (при их отсутствии – пробирки).

Испытуемую сыворотку разводят физ. раствором от 1:10 до 1:20480 в 12 лунках.

Вносят по 1 капле диагностикума в каждую лунку.

Ставят контроли специфичности реакции с иммунной противодифтерийной антисывороткой (положительная реакция) и нормальной сывороткой (отрицательная реакция).

Противодифтерийную контрольную сыворотку (с активностью 10МЕ/мл) разводят от 1:10 до 1:20480 и вносят также по 1 капле диагностикума.

Оставляют при комнатной температуре на 3 часа (максимум на 15-20 часов) и читают реакцию.

При положительной реакции, в результате образования комплекса (АГ-АТ) на поверхности эритроцитов, последние склеиваются и равномерно покрывают все дно пробирки или всю лунку пластинки в виде зонтика с неровными краями. При отрицательной реакции эритроциты выпадают в осадок в виде меленького диска с ровными краями («пуговки»).

Титром антитоксина в исследуемом материале считают последнее максимальное разведение, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов.

Расчет активности испытуемой сыворотки производят по формуле:

где: Х – активность испытуемой сыворотки в МЕ/мл.;

10 – титр контрольной сыворотки в МЕ/мл.;

А – максимальное разведение испытуемой сыворотки с положительным результатом;

В – максимальное разведение контрольной сыворотки с положительным результатом.

Неиммунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мл. (1:20).

РПГА с целью определения напряженности противоскарлатинозного антитоксического иммунитетаставятсанатоксином S. pyogenes, адсорбированным на поверхности эритроцитов.

Опора деревянной одностоечной и способы укрепление угловых опор: Опоры ВЛ — конструкции, предназначенные для поддерживания проводов на необходимой высоте над землей, водой.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

источник

4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических

антител в сыворотке крови животных с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции

связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК),

пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке

коров — кольцевой реакции (КР).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации в пробирках (РА).

4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при

диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, буйволов, верблюдов, оленей,

собак, пушных зверей и животных других видов.

4.2.2. Компоненты реакции агглютинации:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от

больного бруцеллезом животного. На этикетке флакона с такими сыворотками указывают титры в РА

и РСК и дату изготовления;

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная биопредприятием

или полученная в лаборатории;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Приложение N 2, п. 6);

раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей,

верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и

антигена используют фенолизированный (0,5-процентный) физиологический раствор хлорида

натрия (0,85-процентный), при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов — 5-процентный

и оленей — 10-процентный фенолизированный раствор хлорида натрия (см. Приложение N 2, п. 1).

4.2.3. Постановка реакции агглютинации.

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в четырех разведениях:

при исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов, оленей и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.

Разлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками или

групповыми дозаторами Флоринского.

Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках

первого ряда делают основное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота,

лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирки и добавляют к ней 2,4 мл

соответствующего раствора хлорида натрия, получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови

овец, коз, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего

раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок

берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5).

Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда

штатива (по 10 проб в ряду).

После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего,

четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из

пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго

и третьего рядов по 0,5 мл основного разведения сывороток (1:25, 1:12,5 или 1:5). В пробирках

третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия, по 0,5 мл этого разбавления

переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок

пятого ряда по 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные

разведения одновременно 10 сывороток.

После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными

сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего

устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разбавленного в соотношении 1:10 соответствующим

раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сывороток в каждой пробирке

удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения: 1:50,

1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, и они служат контролем качества

сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты

реакции агглютинации не учитывают.

При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей)

или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки

крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл (при исследовании сывороток

овец, коз, буйволов, оленей и собак). Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена,

разведенного соответствующим раствором хлорида натрия в соотношении 1:20. При этом разведения

сывороток будут соответствовать соотношениям 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят

с негативной сывороткой в тех же разведениях, как с испытуемыми;

с позитивной бруцеллезной сывороткой в разведениях до ее предельного титра.

После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками

осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 часов, затем выдерживают

при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учет реакции.

4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в

крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные тела

осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком

встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и

а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный

++ (2 креста) — просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен

+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик»

слабо, при встряхивании заметно небольшое

хлопьев или комочков (25% агглютинации);

— (знак минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не

наступило, на дне пробирки виден «пунктик» осевших

микробов антигена, при легком встряхивании

За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла

агглютинация не менее чем на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц

(ME) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с конечным титром РА 1:100 содержит 100 ME,

Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности,

соответствующие 0 (нулю), 25, 50 и 75% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем

в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл фенолизированного

физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания

пробирок жидкость из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по

0,5 мл фенолизированного физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50

и 25% просветления жидкости. В последней, четвертой пробирке просветление отсутствует.

Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате

одновременно с основной реакцией.

Степень просветления в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют визуально путем

сравнения со стандартами и результаты реакции выражают в крестах.

При массовых исследованиях сывороток в двух разведениях все сыворотки, давшие

агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений,

исследуют повторно в четырех разведениях.

4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации.

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного

рогатого скота, лошадей и верблюдов начиная с разведения 1:100 (100 ME — международных единиц

антител), коз, овец, буйволов, оленей и собак — с разведения 1:50 (50 ME), пушных зверей и морских

свинок — с разведения 1:10 (10 ME) с оценкой не менее чем на 2 креста.

Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с

сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и в разведении 1:25 (25 ME) с

сыворотками овец, коз, буйволов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 креста.

При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного

исследуют повторно через 3 — 4 недели.

На неблагополучных по бруцеллезу фермах животных, при исследовании которых будет

получена дважды сомнительная РА, относят к положительно реагирующим.

В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая

оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр)

сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженное в международных единицах

(например: конечный титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:100 с оценкой 2 креста или

более — «положительная 100 ME»; конечный титр сыворотки 1:50 с оценкой 2 креста или более —

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его

годности, а также предельный титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических

4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакция длительного

связывания комплемента на холоде (РДСК).

4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного

рогатого скота, овец, коз, свиней, лошадей, оленей, собак, пушных зверей и животных других видов.

Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо

РСК при исследовании на бруцеллез сывороток животных указанных видов, а также при диагностике

инфекционного эпидидимита баранов.

4.3.2. Компоненты реакций и их подготовка к работе:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

позитивная бруцеллезная или овисная сыворотка, изготовленная на биофабрике или полученная

от больного животного. На этикетках флаконов с сыворотками указывают титр в РСК (РДСК) и дату

негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных), изготовленная на биофабрике

или полученная в лаборатории.

Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной

бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов

и мулов — при 64 — 65 °С, буйволов — при 62 — 64 °С в течение 30 мин., свиней — при 60 — 62° в течение

50 мин.); для РДСК сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;

антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК или овисный для РДСК в рабочем титре,

указанном предприятием, его изготовившим (см. Приложение N 2, п. 6);

комплемент — сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4%

борной кислоты или лиофильно высушенная). При использовании в качестве комплемента свежей

или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента

проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. Приложение N

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на

этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для

проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну

пробирку, осторожно смешивают, берут 0,5 мл и разводят физиологическим раствором 1:20 для

титрования. Остальное количество комплемента хранят в холодильнике при плюс 2 — 4 °С;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) — для РСК в удвоенном титре, для РДСК — в утроенном.

Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой

новой серии (см. Приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана — 2,5-процентная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе

для РСК и 3-процентная для РДСК (см. Приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы соответствующую взвесь эритроцитов и

гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в

термостате при 37 °С в течение 15 — 20 мин. При смешивании гемолизин вливают во взвесь

физиологический раствор — 0,85-процентный раствор химически чистого хлорида натрия в

дистиллированной воде рН = 7,3 — 7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и

кальция (см. Приложение N 2, п. 2).

Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции

и проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

¦ Комплемент в разведении ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ — ¦ — ¦ —

¦ Гемолизин в рабочем титре ¦ 0,2 ¦ — ¦ 0,2 ¦ — ¦ —

¦ Антиген в рабочем титре ¦ 0,4 ¦ — ¦ — ¦ 0,4 ¦ —

¦ Эритроциты (2,5% или 3%) ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2

¦ Физиологический раствор ¦ — ¦ 0,6 ¦ 0,6 ¦ 0,2

¦ водяная баня 10 минут при 37 —

¦ Результат: гемолиз полная задержка

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и

4.3.3. Постановка реакции связывания комплемента.

Реакцию проводят в водяной бане при 37 — 38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента —

сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

Перед постановкой главного опыта проводят титрование комплемента в бактериолитической

системе на позитивной (бруцеллезной) сыворотке, негативной сыворотке крови того вида животных,

которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии.

Каждую сыворотку разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл

физиологического раствора), инактивируют, как указано в подпункте 4.3.2, и разливают по 0,2 мл в

два ряда по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (разведенный 1:20) в

возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой

пробирке) количество физиологического раствора.

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сывороткой вносят по 0,2 мл

антигена в рабочем разведении, а во второй ряд — по 0,2 мл физиологического раствора. Пробирки

ставят в водяную баню при 37 — 38 °С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл

гемолитической системы, встряхивают их и вновь ставят в водяную баню на 20 мин., после чего

Схема титрования комплемента в бактериолитической системе (на примере негативной

источник