Меню Рубрики

Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллеза

В 1886 г. Д. Брюс в селезенке больного, погибшего от мальтийской лихорадки, обнаружил маленькую коккобактерию, которую выделил в чистой культуре и назвал Micrococcus.

В 1896 г. Б. Банг из околоплодной жидкости при аборте коров также выделил коккобактерии. В 1914 г. Ж. Траум выделил подобную палочку от больных свиней. А в 1916 г. Ивенс, изучив все выделенные микроорганизмы, определила их схожесть и в честь Брюса они были названы бруцеллами. В дальнейшем (1953, 1957, 1966) были открыты и другие виды бруцелл. Все они объединены в род Brucella.

В настоящее время бруцеллы подразделяют на виды по признаку их основного хозяина: В. melitensis — болеет мелкий рогатый скот (овцы, козы); В. abortus — болеет крупный рогатый скот; В. suis — болеют свиньи и т. д.

Каждый вид бруцелл подразделяют на биовары: В. melitensis включает 3 биовара; В. abortus — 9 биоваров; В. suis — 5 биоваров. Наиболее патогенным для человека является В. melitensis. B. abortus редко вызывают клиническое проявление заболевания у человека.

Морфология. Возбудители бруцеллеза мелкие 0,6-0,8 × 0,3-0,5 мкм бактерии палочковидной или овоидной формы. Неподвижны. Спор не имеют. Образуют нежную капсулу. Грамотрицательны. В мазке располагаются беспорядочно.

Культивирование. Бруцеллы — аэробы. Прихотливы к питательным средам. Характеризуются замедленным ростом (2-3 нед). Выращивают их на специальных питательных средах: сывороточно-декстрозном агаре, на агаре из картофельного настоя с сывороткой и кровяным агаром (5% овечьей крови), среде «Д», печеночном агаре МПА и МПБ. Растут они при температуре 37° С и рН 6,8-7,2. Некоторые штаммы требуют для роста 5-10% СО2, особенно при первоначальном выделении. На плотных питательных средах вырастают нежные, мелкие, бесцветные, выпуклые с перламутровым блеском колонии в S-форме. Под влиянием некоторых факторов они могут диссоциировать в R-форму. Под действием антибиотиков у них возникают L-формы. В жидких питательных средах бруцеллы дают равномерную муть. Бруцеллы можно культивировать в желточном мешке куриного эмбриона.

Дифференцируют виды бруцелл на основании их способности образовывать сероводород и расти на средах с красителями — основным фуксином и тионином (табл. 44).


Таблица 44. Биологические свойства бруцелл

Ферментативные свойства. Бруцеллы расщепляют D-рибозу, D-галактозу, аланин, аспарагин. Некоторые штаммы гидролизуют аминокислоты с образованием аммиака.

Бруцеллы образуют гиалуронидазу, каталазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и др. Бруцеллы обладают выраженными инвазивными и агрессивными свойствами.

Токсинообразование. Патогенное действие бруцелл определяется, по-видимому, наличием эндотоксина. Кроме того, они обладают аллергенными свойствами.

Антигенная структура. Бруцеллы содержат два соматических антигена А и М. Эти антигены являются видоспецифичными. Они всегда входят в состав микробной клетки, но в разных соотношениях. У В. melitensis преобладает антиген М, у В. abortus и В. suis — антиген А. Кроме того, у них выявлен термолабильный Vi-антиген.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При 100° С бруцеллы погибают мгновенно. При температуре 80-85° С — через 5 мин, при 60° С — через 30 мин. К низким температурам они очень устойчивы. Прямые солнечные лучи действуют на них губительно. Во влажной среде бруцеллы сохраняются длительно — 3-4 мес. В молочных продуктах — до 40-45 дней, замороженном мясе — до 5 мес, почве и воде — до 3-5 мес.

Восприимчивость животных. Бруцеллезом болеют в основном сельскохозяйственные животные: мелкий и крупный рогатый скот, свиньи, олени и др. Каждый вид бруцелл поражает определенный вид животного. Но бруцеллы могут мигрировать, т. е. переходить от одного вида животного другому. Например, В. abortus могут поражать мелкий рогатый скот.

Основными признаками заболевания являются: у самок — аборты, у самцов — орхиты. Кроме того, у них бывает поражение суставов, похудание, выпадение шерсти и т. д. Но бруцеллез у животных может протекать в скрытой форме, что способствует распространению инфекции.

Из экспериментальных животных к бруцеллам чувствительны белые мыши и морские свинки. После заражения они абортируют, резко худеют, у них выпадает шерсть. У мышей иногда развивается септицемия.

Источники инфекции. Основным источником заболевания бруцеллезом людей являются мелкий и крупный рогатый скот. Роль человека в передаче бруцеллезной инфекции эпидемиологического значения не имеет.

Пути передачи. Пищевой, контактно-бытовой, воздушно-капельный.

Контактный путь — при работе с животными: в процессе ухода за животными, на предприятиях, перерабатывающих сырье и продукты животного происхождения; при соприкосновении с выделениями больных животных, плодом, в процессе убоя, разделки туши и т. д.

Аэрогенным путем бруцеллы проникают в кожу и неповрежденные слизистые оболочки.

Пищевой путь — употребление зараженных пищевых продуктов. Наиболее опасны молочные продукты — молоко, брынза и т. д.

Патогенез. Попав в организм, бруцеллы по лимфатическим путям проникают в лимфатические узлы, кровь, костный мозг, паренхиматозные органы и локализуются внутри клеток. При обострении процесса бруцеллы из клеток вновь попадают в кровь и возникает рецидив. Заболевание характеризуется воспалением суставов, невралгией и естественными абортами.

Иммунитет — обусловливается клеточными (фагоцитоз) и гуморальными факторами — агглютининами, комплементсвязывающими антителами и др. Иммунитет сочетается с состоянием аллергии. В опытах на морских свинках было показано, что устойчивость к повторному заражению у них сочеталась с положительной реакцией к бруцеллину.

Профилактика. Плановые обследования в животноводческих хозяйствах, на пастбищах, в убойных пунктах, на мясных и молочных комбинатах.

Специфическая профилактика. Вакцинация живой вакциной В. abortus (штамм 19-ВА). Прививки проводят накожным методом однократно, ревакцинируют через 8-12 мес.

Лечение. Антибиотики: левомицетин, эритромицин. Для предупреждения рецидивов используют также бруцеллезный иммуноглобулин.

1. Какие Вы знаете виды бруцелл и какой из них патогенен для человека?

2. На каких средах культивируют бруцеллы и чем характеризуется их рост на средах?

3. С чем связано патогенное действие бруцелл?

Цель исследования: выявление возбудителя бруцеллеза.

Работу с бруцеллами проводят в строго режимных условиях.

2. Спинномозговая жидкость.


Способы сбора материала


Ход исследования


Ход исследования

1. В каких условиях проводят работу с материалом, полученным от больного бруцеллезом?

2. Какой материал служит для диагностического исследования?

3. Перечислите основные методы исследования.

4. На каких животных ставят биологическую пробу?

Сывороточно-декстрозный агар. Основой этой среды является питательный агар, который готовят следующим образом: к 835 мл дистиллированной воды добавляют 15 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г х. ч. хлорида натрия и 165 мл мясной воды. Все ингредиенты вводят в сосуд и подвергают обработке текучим паром в течение часа. Устанавливают рН 7,8. Затем сосуд ставят в автоклав, при 2 атм, температуре 120° С выпадают фосфаты. Среду фильтрют через бумажные фильтры, устанавливают рН 7,4, разливают в мерную посуду и стерилизуют при температуре 116° С в течение 15 мин. Заготовленный таким образом агар по мере надобности расплавляют на водяной бане и охлаждают до 50° С. Затем к нему добавляют нормальную инактивированную (при 56° С 30 мин) лошадиную или бычью сыворотку и раствор декстрозы, простерилизованный путем фильтрации через фильтр Зейтца. Окончательная концентрация сыворотки должна быть 5% и декстразы — 1%.

Среда «Д»: а) бульон «Д» — к 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 2,5 г порошка стандартного бульона «Д», прогревают и тщательно размешивают до полного его растворения; затем бульон фильтруют, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 120° С в течение 20 мин (рН среды 7,1-7,2); б) агар «Д» — к 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 20 г порошка стандартного агара «Д», прогревают при помешивании до полного растворения порошка, не допуская его подгорания, затем фильтруют, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 120° С в течение 20 мин (рН среды 7,2). Среды готовит Институт эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалея АМН СССР.

источник

Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллеза, сухой. Набор реагентов для бактериологических исследований.

ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой» Бруцеллагар Оболенск

Набор реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой (Бруцеллагар)» предназначен для культивирования бруцелл и выделения их из клинического материала при бактериологическом исследовании.

Набор реагентов состоит из одной банки с Бруцеллагаром и 12 флаконов с селективными добавками (СД 1 и СД 2).

Бруцеллагар представляет собой смесь сухих компонентов в виде мелкодисперсного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета.

СД 1: 6 флаконов с полимиксином В сульфат – мелкодисперсный порошок белого цвета.

СД 2: 6 флаконов с афотерицином В – пористая масса желтого цвета.

Бруцеллагар выпускается в полиэтиленовых банках по 250 г, СД 1 и СД 2 во флаконах по 0,005 г и 0,01 г соответственно.

Совокупность компонентов, входящих в состав среды, обеспечивает питательные потребности для роста бруцелл и др. высокотребовательных микроорганизмов.

Бруцеллагар представляет собой смесь сухих компонентов из расчета, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ) …………………… 7,5
Пептон мясной ……………………………………………………………. 7,5
Панкреатический гидролизат казеина (ПГК) …………………………….. 10,0
Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов ……………………… 5,0
Дрожжевой экстракт ………………………………………………………. 3,0
Д-глюкоза …………………………………….……………………………. 2,0
Натрий хлористый …………………………………………………………. 3,5
Тиамина хлорид ….……………………………………………..………… 0,005
meso-Erythritol ……………………………………………………………. 0,01
Натрий пиросернистокислый (натрия метабисульфит) …………..…….. 0,1
Агар микробиологический …………………………………….…………… 10,0±3,0
СД 1, г/л:
Полимиксина В сульфат …………………………………………………. 0,005
СД 2, г/л:
Амфотерицин В …………………………………………………………… 0,01

Бруцеллагар Оболенск обеспечивает рост бруцелл не позднее 72 ч инкубации при температуре (37±1)°С и подавляет рост эшерихий и грибов.

При анализе исследуемого материала – соблюдение СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».

Объекты исследований в клинической микробиологии.

7.1 Приготовление Бруцеллагара для культивирования бруцелл.

Препарат в количестве, указанном на этикетке, тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 3 мин до полного расплавления агара и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

7.2 Приготовление Бруцеллагара с селективными добавками для выделения бруцелл.

Для приготовления 1 л среды с селективными добавками во флаконы с СД 1 и СД 2 наливают по 5 мл дистиллированной воды, вносят в стерильный, охлажденный до температуры 50-55 °С Бруцеллагар (п. 7.1), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Готовая питательная среда непрозрачная коричневого цвета с темно-коричневыми вкраплениями.

Готовую среду можно использовать в течение 7 сут после её приготовления при условии хранения при температуре 2-8 °С.

7.3. Взятие, посев исследуемого материала проводят в соответствии с
МУК 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», МУ 3.1.7.1189-03 «Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей» и других нормативных документов.

7.4. Исследуемый материал вносят соответственно на две чашки Петри с Бруцеллагаром с СД и равномерно распределяют микробную взвесь покачиванием чашек по всей поверхности. Инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 72 ч.

Учет результатов проводят не позднее 72 ч инкубации визуально учитывая наличие и характер роста бруцелл — выпуклые, гладкие, бесцветные, мутноватые, круглые колонии диаметром 1,0-1,5 мм.

Отмечают отсутствие роста тест-штаммов E.coli и C. albicans на чашках Петри со средой Бруцеллагар и наличие роста на контрольных средах.

Для получения достоверных результатов посевы образцов производить не менее чем в трех повторностях.

Набор реагентов необходимо хранить в герметично закрытой упаковке при температуре от 2 до 30 С. СД хранят при температуре 2-8 °С.

Срок годности набора реагентов: Бруцеллагара – 2 года, СД 1 и СД 2 – не менее срока годности среды. Среда с истекшим сроком годности использованию не подлежит. После вскрытия банки с Бруцеллагаром гарантируется соответствие требуемым параметрам при соблюдении условий хранения (влажность, температура, герметичность) до окончания срока годности.

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей инструкции по применению.

По вопросам, касающимся качества набора реагентов «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллёза сухой (бруцеллагар)» в течение срока годности следует обращаться в адрес предприятия-изготовителя: 142279 Оболенск, Московская обл., Серпуховский р-н, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», тел./факс (4967) 36-01-16.

источник

Для выделения и поддержания культур бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон, печеночно-глюкозо-глицериновый бульон, картофельный агар, мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар, печеночно-глюкозо-глицериновый агар, сывороточно-декстрозный агар, эритрит-агар, агар Альбими и другие среды. При выделе­нии бруцелл из загрязненного материала в среды добавляют генцианвиолет 1:100-250 тыс., малахитовый зеленый — 1:500 тыс., кристаллвиолет — 1:100 тыс.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ). К 610 мл мясной воды добавляют 305 мл печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида. Кипятят 60 минут, водой доводят объем до первоначального. Фильтруют, разливают в пробирки (колбы), стерилизуют при 110°С 30 минут.

Печеночно-глюкозо-глицериновый агар. К 900 мл печеночного настоя добавляют 9 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара. Ва­рят в автоклаве 60 минут при 100-110°С. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 20 г глюкозы и 25 мл глицерина. Разливают в пробирки, стерилизуют при 110°С 30 минут.

Печеночно-глюкозо-глицериновый бульон готовят так же, как и предыдущую среду, но агар не добавляют.

Печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар. К 1 л печеночного настоя добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 20 г агар-агара, 17 мл 10%-ного раствора натрия двууглекислого. Автоклавируют при 115°С 20 минут. Фильтруют, устанавливают рН 7-7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Разливают по сосудам, стерилизуют при 110°С 20 минут. Перед использованием в расплавлен­ную и охлажденную до 45°С среду вносят 10-20% стерильной сыво­ротки крови крупного рогатого скота или 10-15% аминопептида Среду разливают в пробирки или бактериологические чашки.

Полужидкий печеночно-сывороточный и печеночно-амино­пептид­ный агар. К 500 мл мясной воды добавляют 500 мл печеночного настоя, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида и 2 г агар-агара. Кипятят до расплавления агара. Устанавливают рН 7-7,2. Разливают по сосудам и стери­лизуют при 115°С 30 минут. Перед использованием в подогретый до 45°С агар добавляют 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или барана или аминопептида.

Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 165 мл мясной воды. Кипятят до расплавления агара. Фильтруют, устанавли­вают рН 7,4. Разливают в колбы и стерилизуют 15 минут при 115°С. Перед использованием в расплавленный и охлажденный до 45°С агар вносят 10% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади, 1% декстрозы.

Картофельный агар. В 1 л дистиллированной воды 15 минут варят 500 г очищенного и мелко нарезанного картофеля. Отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят объем водой до 1 л. Добавляют 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара, кипятят до расплав­ления агара. Устанавливают рН 7,2. Агар оставляют для застывания; прозрачную верхнюю часть отрезают, расплавляют, фильтруют через ватный фильтр. Корректируют рН до 7,2. Добавляют 10 г глюкозы и 30 мл глицерина. Разливают по колбам или пробиркам. Стерили­зуют при 115°С 20 минут. Готовая смесь должна иметь рН 6,8.

Среда Альбими. В 1 л дистиллированной воды растворяют 2 г пепто­на, 1 г декстрозы, 5 г натрия хлорида, 0,1 г натрия бисульфата. Добав­ляют 2 мл дрожжевого аутолизата. При изготовлении плотной среды добавляют 2-2,5% промытого агар-агара. Стерилизуют при 115°С 30 минут.

Заменитель среды Альбими. К 1 л дистиллированной воды добавля­ют 20 г пептона Дифко, 20 мл дрожжевой воды, 5 г натрия хлорида, 20 г промытого агар-агара или агара Дифко. Устанавливают рН 7,3, Нагре­вают до расплавления агара, фильтруют через ватный фильтр. В горя­чую среду добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г натрия бисульфата. Корректи­руют рН до 7,2—7,3. Разливают в колбы или пробирки, стерилизуют 20 минут при 110°С.

Читайте также:  Памятка по бруцеллезу животных

Для приготовления дрожжевой воды в 1 л дистиллированной воды суспендируют 1 кг пекарских (хлебных) дрожжей, кипятят 5-10 минут, фильтруют через плотный фильтр. Хранят в темном месте под хлоро­формом не более 2 недель.

Селективные среды для выделения бруцелл из молока и других материалов (рецепты фирмы Oxoid). К расплавленным и охлажденным до 55-60°С агаровым средам (сывороточно-декстрозный или кровя­ной агары с 5% лошадиной сыворотки и 1% декстрозы) добавляют следующие антибиотики (из расчета на 1 л среды): полимиксин В — 500 ИЕ, бацитрацин – 25 000 ИЕ, циклогексимид — 100 мг, налидиксовая кислота — 5 мг, нистатин — 100 000 ИЕ и ванкомицин — 20 мг. Антибиотики суспендируют в 10 мл метанола. Вносят суспензию в среду и тщательно перемешивают.

Среда с красителями для дифференциации видов бруцелл. В пред­варительном опыте с использованием эталонных культур бруцелл разных видов определяют необходимую концентрацию красителей в среде, позволяющую дифференцировать виды.

В 20 мл этанола растирают 0,1 г тионина и отдельно — основного фуксина. Доводят объем красок до 100 мл дистиллированной водой. Полученные разведения красителей 1:10 000 добавляют в расплавлен­ный и охлажденный до 45-60°С сывороточно-декстрозный агар, пере­мешивают и разливают в чашки Петри. Готовят суспензию из 48-часовой агаровой культуры исследуемо­го штамма бруцелл на 0,8%-ном растворе натрия хлорида концентра­цией 10 10 бактериальных клеток в 1 мл. Одну каплю суспензии засе­вают штрихом на агар с красителем (отдельно с тионином и фукси­ном). Одновременно эту суспензию засевают на агар без красителя. Инкубируют до появления роста культуры на агаре без красителей. Учитывают результат по наличию роста на агаре с красителями.

Дифференциация S- и R-колоний бруцелл по Уайту-Вильсону. На подсушенный в течение 24 ч агар Альбими в чашке Петри засевают исследуемую культуру бруцелл и инкубируют при 37°С до появле­ния колоний. Затем на колонии наливают водный раствор кристаллвиолета и выдерживают 15 с. Раствор краски сливают в чашку с дезин­фицирующим раствором, а колонии рассматривают под лупой (или при малом увеличении микроскопа). Колонии S-формы светлого, а R-формы — фиолетового цвета.

Печеночный настой. К 1л водопроводной воды добавля­ют 500 г фарша из свежей печени крупного рогатого скота. Настаива­ют 3 ч при 25-30°С или 6-10 ч при 4°С. Кипятят, помешивая, 1-2 ч, доливают водой до первоначального объема. Осевший фарш удаля­ют. Настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в кол­бы и стерилизуют при 115°С 20 минут.

Мясная вода. К 1л водопроводной воды добавляют 500 г фарша из свежего мяса крупного рогатого скота. Настаивают при 4°С 15-18 ч. Фарш удаляют. Настой кипятят 30-40 минут, доливают водой до первоначального объема. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в колбы. Стерилизуют при 120°С 20 минут.

источник

Владельцы патента RU 2688335:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Плотная питательная среда для культивирования возбудителя бруцеллеза содержит мясную воду двойной концентрации, пептон сухой ферментативный, сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, натрия метабисульфит и агар микробиологический при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки. 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования возбудителя бруцеллеза.

Известна питательная среда мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является г/л: мясная вода 1000,0 мл, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого натрия хлористого и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л). В дальнейшем среду автоклавируют при 115°С в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой и вновь устанавливают рН 7,1-7,2. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 минут (Профилактика инфекционных болезней инфекции, общие для человека и животных. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. С. 53).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, ввиду позднего роста возбудителя.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования бруцелл содержащая г/л: к 500,0 мл пептона Мартена, добавляют 500,0 мл мясной воды, и 5 г химически чистого хлористого натрия, 5,0 г натрия уксуснокислого и агар-агар 15,0-20,0. Смесь кипятят, устанавливают рН — 7,3±0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют 20 мин при 120°С (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. — 2008. — С. 65-66).

Недостатком данной среды является низкая питательная ценность для бруцеллезного микроба.

Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза, обеспечивающей достаточное количество колоний максимально в ранние сроки через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется мясная вода, пептон ферментативный и сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала натрий хлористый, в качестве стимулирующих добавок — глюкоза, глицерин, натрия метабисульфит, а также агар микробиологический, при следующем соотношении ингредиентов г/л:

Мясная вода 0,800-1200,0
Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0
Сыворотка крови лошади нормальная
для культивирования микоплазм на
Натрий хлористый 4,0-6,0
Глюкоза 5,0-15,0
Глицерин 15,0-25,0
Натрий метабисульфит 0, 1-0,5
Агар микробиологический 14,0-22,0

В качестве исходного сырья используют мясную воду, являющуюся основой для многих питательных сред, обычно для приготовления мясной воды служит говядина или конина. Конина отличается большим содержанием углеводов (гликоген). Из мяса молодых хорошо упитанных животных (телят) обычно получают мясную воду лучшего качества (питательные свойства, прозрачность). Азотистые вещества от 12,7 до 21,71%, жиры от 1,4 до 15,5%. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа, общее количество их достигает 1%. Мясо свежее содержит также витамины, экстрактивные вещества в большем количестве чем в замороженном (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз — 1950 г. С. 46-48).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей — ГОСТ 13805-76. Производитель «НПО Порт-Петровск».

Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая. Дата выпуска 27.05.2016. Серия Л-16-04. Срок годности 2 года. Производитель ООО БиолоТ. С-Петербург.

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24. Производитель г. Барнаул. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Глюкоза кристаллическая, чда, партия 20140327 0 00«МСД Торговая компания». Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глюкозы в концентрации 1% — улучшается ее ростовые свойства.

Глицерин ГОСТ 6259-75, партия 21/2015. Дата выпуска 04.2015. Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% — улучшается ее ростовые свойства. Производитель Польша.

Натрия метабисульфит ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO2), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Агар микробиологический — агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0.85% не ниже 80°С, температура застудневания — 30-37°С, прочность студня не менее — 350±40 г. Главная особенность агара — его желирующая способность.

Приготовление мясной воды двойной концентрации

Способ приготовления питательной основы для культивирования возбудителя бруцеллеза: 1 кг мясного фарша заливают 1 л дистиллированной воды и ставят на один сутки при температуре 6-8°С. Через сутки смесь фарша с водой кипятят в течение часа. Небольшие количества — до 5 литров можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. После кипячения мясную воду отжимают от фарша, доливают до первоначального объема дистиллированную воду, фильтруют и стерилизуют 30 минут при температуре 120°С. Хранят мясную воду двойной концентрации в стерильном виде.

Приготовление питательной среды плотной

Питательную среду на основе мясной воды двойной концентрации для культивирования возбудителя бруцеллеза готовят следующим способом: соединяют мясную воду — 1000,0; пептон ферментативный — 10,0; натрий хлористый — 5,0; агар микробиологический — 18,0. Среду кипятят до полого растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси добавляют глюкозу — 10,0; глицерина — 20,0; натрий метабисульфит — 0, 3; тщательно перемешивают разливают по 330 мл питательной среды в градуированные флаконы объемом 450 мл, перекрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт, фиксируют резиновым кольцом, стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°С, стерильно над факелом добавляют в каждый флакон по 40,0 мл сыворотки крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкой (т.е 120,0 мл на 880,0 мл среды), затем разливают на чашки Петри по 35-40 мл приготовленной питательной среды. Подсушенные чашки помещают в термостат на 48 ч при 37°С, проверяют на стерильность.

Сочетанное применение выше описанных ингредиентов, обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивирования возбудителя бруцеллезного микроба в значительно ранние сроки на 2-3 сутки на пластинках питательного агара. Готовую питательную среду плотную используют для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.

Эффективность полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-06) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием вирулентных культур: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.

Испытуемые культуры выращивают в бактериологических пробирках на поверхности скошенного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10 9 бруцелл 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводят сначала до концентрации 1×10 -9 м.к./мл затем серийными десятикратными разведениями до 1×10 6 и 1×10 7 м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M из разведений 10 -6 (100 м.к.) и 10 -7 (10 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемыми средами и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С.

Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M проводят путем подсчета количества выросших колоний бруцелл посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой через каждые 24-48-72-120 ч. В качестве контроля использовали бруцеллагар.

Пример 1. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду — 800,0 мл; пептон сухой ферментативный — 8,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую — 90,0; натрий хлористый — 4,0; глюкозу — 5,0; глицерин — 15,0; натрия метабисульфит — 0, 1; агар микробиологический — 14,0.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 52 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 разведения вырастает 132; 36; 51; 99 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10 -7 разведения вырастает 12; 8; 3; 11 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 и 10 -7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар — питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 2. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду — 1000,0; пептон сухой ферментативный — 10,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую — 120,0; натрий хлористый — 5,0; глюкозу — 10,0; глицерин — 20,0; натрия метабисульфит — 0, 3; агар микробиологический — 18,0.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 48 ч отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 разведения вырастает 184; 50; 86; 134 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10 -7 разведения вырастает 22; 12; 4; 18 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 и 10 -7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар — питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 3. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду — 1200,0; пептон сухой ферментативный — 12,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую — 150,0; натрий хлористый — 6,0; глюкозу —

При таком соотношении ингредиентов колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M на испытуемой среде начинали формироваться через 67 ч, через 76 ч (на 3 сутки — 4 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве 0,1 мл из разведения 10 -6 вырастало 102; 25; 39; 72 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Из разведения 10 -7 вырастало 8; 7; 4; 8 типичных по морфологии колоний вышеуказанных штаммов, соответственно, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, через 72 ч (на 3 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве по 0,1 мл из разведений 10 -6 и 10 -7 вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар — питательная среда темно-коричневого цвета, морфология колоний в микроскоп не просматривается.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования возбудителя бруцеллеза (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки -через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний до 1,5 мм в диаметре.

Читайте также:  Что такое хронический бруцеллез

Питательная среда плотная для культивирования возбудителя бруцеллеза, при следующем соотношении ингредиентов:

источник

Окраска бруцелл по Шуляку-Шин. Мазок фиксируют на пламени, окрашивают 2 минуты карболовым фук­сином Циля, разведенным водой 1:5, промывают водой, окрашивают 5 минут 2%-ным водным раствором метиленового синего, промывают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы — красные, другие бактерии име­ют синий цвет.

Окраска бруцелл по Кюстеру. Препарат фиксируют на пламени, окрашивают 60 секунд щелочным ра­створом сафранина, промывают водой, обрабатывают 15 секунд 0,05%-ным раствором серной кислоты, тщательно промывают водой, окрашивают 15-20 секунд 3%-ным водным раствором метиленового синего. Микроскопичес­кая картина: бруцеллы — красные, другие бактерии синего цвета.

Микроскопическое исследование исходного материала

Из поступившего материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и одним из специальных методов (по Козловскому, Стампу и т.д.), а также бруцеллезными люминесцирующими сыворотками.

В препаратах, окрашенных по методу Грама, бруцеллы имеют форму мел­ких, коротких, коккоподобных или палочковидных грамотрицательных бак­терий, размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм, истинной капсулы не образуют, рас­положены одиночно, реже — парами, короткими цепочками или небольши­ми группами.

Для бруцелл характерно более медленное окрашивание и отдача краси­теля при промывании водой или обработке слабыми растворами кислот по сравнению с другими видами бактерий, что позволило ряду авторов предло­жить дифференциальные методы окраски клеток возбудителя.

Окраска бруцелл по Е.В. Козловскому. Мазок фиксируют на пламени, окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина 2 минуты с подогреванием до появления пузырьков, затем про­мывают водой и докрашивают 0,75-1%-ным водным раствором брилли­антовой или малахитовой зелени (или метиленового синего) в течение 1-2 минут, споласкивают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы — ярко-красные, другие бактерии — зеленого или синего цвета.

Окраска бруцелл по Стампу (модифицированный метод Циля- Нильсена). Мазок фиксируют на пламени, окрашивают фуксином Пфейффера в те­чение 10 минут, промывают водой, обрабатывают
30 секунд 0,5%-ным вод­ным раствором уксусной кислоты, промывают водой, окрашивают 20-30 секунд 1%-ным водным раствором метиленового синего, промывают во­дой. Микроскопическая картина: бруцеллы — красные, прочие бактерии имеют синий цвет.

Приготовление щелочного раствора сафранина (ex tempore). Смешивают 5 капель 3%-ного водного раствора сафранина и 1,5 мл нормального раствора КОН (5,6 г на 100 мл воды).

Иммунолюминесцентное выявление бруцелл проводят прямым или не­прямым способом.

Культивирование.Обычно исследуемый материал засевают в пробирку с жидкой и в не­сколько пробирок (5-10) — с агаровой питательной средой (мясо-пептонный печеночный бульон, мясо-пептонный-печеночно-глюкозный-глицериновый бульон, альбими-бульон, аналогичные агаровые среды, сывороточнокартофельный агар, сывороточно-декстрозный агар). Бруцеллы хоро­шо растут на кровяном агаре (5-10%). Загрязненный материал высевают на сывороточно-декстрозный агар с ингибиторами (рекомендация Объеди­ненного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу): генцианвиолет 1:200 тыс. или кристаллический фиолетовый 1:100 тыс., уксуснокислый натрий (0,25 мг/мл) или паранитрофенилглицерин (0,005-0,007%).

Бруцеллы — аэробы или микроаэрофилы. Температурный оптимум 37°С, диапазон — 20-40°С, оптимум рН 6,6-7,4. Микроаэрофильные свойства проявляют В. abortus и В. ovis. Поскольку не известно, какой вид бруцелл присут­ствует в исследуемом материале от крупного рогатого скота, то половину пробирок с посевами инкубируют в условиях обычной атмосферы, вторую — в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (10-12%). Посевы при исследовании на наличие В. ovis инкубируют только в атмос­фере СО2. В первой генерации бруцеллы обладают замедленным ростом, по­этому посевы культивируют, периодически просматривая, до 30 дней. Подготовка и исследование различных материалов имеют некоторые особенности.

При исследовании абортированного плода производят посев тканевого гомогената или пастеровскими пипетками непосредственно из органов. Посевы делают из экссудата грудной и брюшной полостей, содержимого желудка, крови сердца, печени, селезенки, легких. При посеве из паренхи­матозных органов выбирают участки с фокусами некрозов, кровоизлияни­ями.

Для изготовления тканевого гомогената кусочки паренхиматозных ор­ганов обжигают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком и физиологическим раствором (1:10), гомогенат высевают на среды. Анало­гичным образом подготавливают для посева материал, взятый при диагно­стическом убое животных.

При осмотре плаценты отбирают участки с утолщенными ворсинками и стенками, с наличием гнойного экссудата. Поверхность плаценты обраба­тывают тампонами с дезинфектантами, просушивают стерильными тампо­нами, прижигают выбранный участок, вырезают необходимые фрагменты, измельчают, как было описано выше, и высевают на среды с ингибитора­ми.

Порции молока из каждой четверти вымени центрифугируют при 1000-3000 об/мин в течение 10-20 минут. Посев производят из осадка и слоя сливок на селективные среды. Рекомендуется исследовать пробы молока, взятые от животного несколько раз с интервалом 5-10 суток.

Мочу (75-100 мл) перед посевом на питательные среды центрифугиру­ют при 3000 об/мин в течение 10 минут и осадок высевают на селективные среды. Возможна концентрация бруцелл путем добавления к моче бруцеллез­ной агглютинирующей сыворотки (1-2%) с титром не менее 1:800. После непродолжительного инкубирования мочу центрифугируют и осадок высе­вают на питательные среды.

Эффективен посев в жировые куриные яйца при исследовании крови, мочи и других материалов, содержащих малое количество возбудителя. Исполь­зуют свежие куриные яйца (3-5 дней). На каждый материал берут 3-5 яиц. Исследуемый материал в количестве 0,2 мл вводят в желточный мешок, ин­кубируют при 37° С в течение пяти суток, вскрывают, набирают пастеровс­кими пипетками белок и желток и высевают на плотные и жидкие питатель­ные среды (методика Одесского ИМ имени И.И. Мечникова).

Кровь высевают сразу после взятия в жидкие питательные среды с антикоагулянтом (2%-ный цитрат натрия). В 100 мл среды засевают около 20 мл крови. В качестве питательной среды используют бульон Альбими, триптозный бульон, среду Первушина, МПБ с 1% глюкозы и 2-3% глицерина. Хо­рошие результаты получаются при посеве на комбинированные среды (ме­тод Кастанеда). Например, в колбе (пробирке) скашивают агар (ППГГА), добавляют какую-либо жидкую питательную среду, чтобы она покрывала половину поверхности агара, и в нее засевают кровь (П.А. Триленко 1976). Через 4-6 дней культивирования поверхность агара увлажняют жидкой средой и в последующем периодически просматривают с целью обнаружения колоний бруцелл.

Характер роста бруцелл на питательных средах.Колонии бруцелл появляются на поверхности плотных питательных сред на 5-10-е, реже — на 20-25-е сутки. В первичных посевах формируются, как правило, колонии S-формы: бесцветные, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкой маслянистой поверхностью, полупрозрачные, диаметр коло­ний в зависимости от типа питательной среды от 0,1-0,7 до 2,0-2,5 мм и более. По мере старения колонии теряют прозрачность, мутнеют и темнеют за с 1ст появления пигмента. На ППГГА в проходящем свете колонии имеют ян-гарный оттенок.

При изучении колоний в косопроходящем пучке света они имеют зеленовато-серо-голубой цвет с неболь­шим красновато-желтым центром.

При исследовании материала от животных с хроническим течением бру­целлеза могут быть выделены бруцеллы в R-форме, отличающиеся не толь­ко по форме, но особенно по характеру свечения колоний.

В жидких питательных средах бруцеллы растут с равномерным помут­нением среды, медленным появлением небольшого, голубоватого в прохо­дящем свете пристеночного кольца или кольца и поверхностной пленки. На дне пробирки постепенно образуется рыхлый осадок.

Морфология и тинкториальные свойства клеток бруцелл в культуре.Из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, Коз­ловскому. Клетки бруцелл в культуре не отличаются по морфологии от кле­ток возбудителя в исходном материале (см. выше), жгутиков не имеют.

Идентификация бруцелл на уровне рода.Принимают во внимание время появления макроскопически видимого роста, на питательных средах — потребность в СО2.Согласно действующему в РФ «Наставлению по диагностике бруцел­леза животных» (2000), при обнаружении в посевах бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для бру­целл, проводят их серологическую идентификацию. Для целей серологи­ческой идентификации используют двухсуточные агаровые культуры ис­следуемых бактерий и диагностические агглютинирующие R- и S-сыворотки. На предметном стекле в каплях S- и R-сывороток, физиологического раствора суспензируют бактериологической петлей испытуемую культу­ру. Для контроля R-сыворотки проверяют в разведении, указанном био­фабрикой с роз-бенгал и цветным антигенами; S-сыворотки — в титре, ука­занном на коробке с цветным бруцеллезным антигеном и в неразведенном виде с роз-бенгал антигеном.

Если испытуемая культура дает положительную РА (два креста и более) с обеими или любой одной диагностической сывороткой и отрицательный ре­зультат с физиологическим раствором, то ее относят к бруцеллам.

Оценка результатов РА проводится при условии, что R- и S-сыворотки дают в контролях с гомологичными антигенами агглютинацию интенсив ностью минимум на три креста, при отсутствии реакции с гетерологичными антигенами. Агглютинация с R-сывороткой происходит замедленно, с ней всегда реагируют культуры В. ovis и В. canis.

Для идентификации выделенной культуры на уровне рода также иссле­дуют оксидазную, каталазную активность, наличие жгутиков, образова­ние индола, уреазы, способность редуцировать нитраты, агглютинировать в бруцеллезной позитивной сыворотке, а также патогенность для лабора­торных животных (см. «Биопробу»).

Бруцеллы не обладают подвижностью, образуют каталазу, обычно ок-сидазу (кроме В. ovis и В. neotomae) и уреазу (кроме В. ovis и некоторых штаммов В. melitensis), редуцируют нитраты, не образуют индол.

Наставлением по диагностике бруцеллеза животных (2000) в РФ пре­дусмотрено использование полимеразной цепной реакции.

Идентификация бруцелл на уровне вида и биовара.Критерии дифференциации видов и биоваров бруцелл представлены в таблицах.

Определение вида и биовара выделенной культуры бруцелл дает воз­можность более детально проводить эпизоотологический и эпидемиологи­ческий анализ.

Разработанные методы дифференциации видов бруцелл предполагают работу с бруцеллами в S-форме (кроме В.ovis и В. canis), поэтому перед проведением таких исследований проверяют популяцию на диссоциацию методом окраски колоний кристаллвиолетом по Уайту-Вильсону. Для этого готовят взвесь 48-часовой изучаемой агаровой культуры в стериль­ном физиологическом растворе концентрацией 0,5-1 млрд. микробных клеток в 1 мл по бруцеллезному стандарту мутности. Одну каплю взвеси засевают последовательно шпателем на поверхность агаровой среды в трех чашках Петри.

Посевы инкубируют 5 суток при 37-38°С. При таком методе посева на плотной среде вырастает достаточно большое количество изолирован­ных колоний бруцелл. В чашки Петри с колониями осторожно пасте­ровской пипеткой наливают рабочий раствор кристаллвиолета 1 тонким слоем. Через пять минут краситель осторожно отсасывают пипеткой и сливают в емкость с дезраствором. Затем колонии изучают при помощи стереоскопического микроскопа.

Диссоциированные колонии имеют цвет от темно-фиолетового до свет­ло-синего, S-колонии окрашиваются в светло-желтый, реже — в светло-зеленый цвет. Для изучения отвивают несколько колоний в
S-форме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Качество питательных сред и условия культивирования для получения бруцелл в первой генерации имеют очень важное значение не только для количества результативных исследований, но и для выделения возбудителя болезни с наименьшими признаками диссоциации.

Стабильность последующих генераций также зависит от условий культивирования и состава питательных сред. Поэтому хотя изготовление питательных сред производится строго по рецептам, все же необходимо в диагностических лабораториях отрабатывать методику приготовления и контроля питательных сред. Требуется испытывать их качество на референтных штаммах бруцелл. Это особенно важно при использовании нестандартных ингредиентов среды.

В 5-м докладе Комитета экспертов по бруцеллезу ФАО/ВОЗ предлагается испытать основные питательные среды (в которые не добавляются ингибиторы) на рост клеток 2-го биотипа Br. abortus при незначительном их содержании (5 -10 клеток) о засеваемом материале.

Наиболее популярной средой, рекомендованной указанным Комитетом, является селективный сывороточно-декстрозный агар, на котором Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis и их биотипы растут лучше, чем на других средах. Эта среда содержит 5% сыворотки крови и следующие антибиотики: бацитроцин, полимиксин В и циклогексимид. Кроме того, амфотериксин может заменить циклогексимид или может быть добавлен к нему.

Считается, что добавление красок может частично препятствовать росту биотипов основных видов бруцелл, но краски все же рекомендуются.

Ниже приводится методика изготовления питательных сред, использующихся в нашей стране.

Плотный печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ППГГА). Эту среду применяют для исследования и культивирования Br. abortus, Br. melitensis и Br. suis.

Берут 400 г свежей говяжьей печени, освобождают ее от жора и пленок, измельчают на куски по 5—8 г, добавляют 0,5 л водопроводной воды и кипятят в течение 1 ч (при большом объеме мечет, загружают в кипящую воду). Затем фильтруют через нейлоновый или ватный фильтр.

Этот печеночный отвар разводят пополам водопроводной водой, добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистого хлорида натрия, 2,5% агара и 17 мл на 1 л 10%-ного раствора гидрокарбоната натрия.

Затем среду автоклавируют при 115° С в течение 20 мин, отстаивают в автоклаве 3—4 ч до осаждения грубых частиц и фильтруют в горячем виде через ватный или нейлоновый фильтр, устанавливают pH 7—7,2. В этот печеночный агар добавляют 1 % виноградного сахара и 2—3% глицерина. Среду разливают в пробирки или посевные колбы и стерилизуют однократно при температуре 110° С в течение 20— 25 мин.

На этой свежей (до 3-суточной давности) среде без ингибиторов при первичном посеве хорошо растут бруцеллы из свежих или замороженных абортированных плодов и отдельных органов животных, убиваемых с диагностической целью, содержимого полостей, абсцессов. Длительные пересевы музейных штаммов не вызывают большой их изменчивости. Эту же среду применяют при бактериостатическом методе дифференциации бруцелл.

Полужидкий сывороточный агар. Данную среду готовят по следующей прописи. Берут печеночного отвара (см. выше) и мясного настоя по 25%, водопроводной воды — 50%, добавляют пептона 1%, хлорида натрия — 0,5%, агара — 0,15—0,2%, устанавливают pH 7—7,2. Смесь разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве при 115° С в течение 20—25 мин. Хранят среду при 0—4° С. Перед употреблением к среде добавляют 10% стерильной овечьей или бычьей сыворотки и разливают в пробирки,

Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 15 г агара, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлорида натрия и 165 мл мясной воды. После смешивания содержимое колбы обрабатывают текущим паром в течение 1 ч. Устанавливают pH 7,8. Затем среду автоклавируют в течение 30 мин при 127° С (0,2 М/Па) для осаждения фосфора. После автоклавирования среду фильтруют через бумажный фильтр, регулируют pH до 7,4, разливают смесь в мерную посуду, стерилизуют при 116 С в течение 15 мин. Перед употреблением среду расплавляют, остуживают до 50 С, после чего к ней добавляют нормальную лошадиную или бычью сыворотку и раствор декстрозы. Эту смесь предварительно фильтруют через фильтр Зейтца. Окончательная концентрация сыворотки в среде должна быть 5%, декстрозы— 1%.

Печеночный агар Хеддлесона. Вначале готовят печеночный отвар. К 500 г свежего фарша из говяжей печени (без жира и пленок) добавляют 500 мл воды, затем кипятят в течение 1 ч при помешивании, фильтруют через ватно-марлевый или нейлоновый фильтр и стерилизуют в автоклаве.

Для изготовления агаровой среды берут 500 мл воды, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 20 г агара и автоклавируют в течение 30 мин, затем добавляют к среде 500 мл печеночного отвара, охлаждают до 60° С, устанавливают pH 7. К 1 л среды добавляют один яичный белок, автоклавируют в течение 30 мин при 120° С, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7, разливают и стерилизуют в автоклаве при 115° С в течение 30 мин.

Среда Первушина для выделения гемокультур. Мясо-пептонный бульон (МПБ), содержащий 1% глюкозы и 4% глицерина, разливают в колбы по 100 мл. Затем вводят в них по 0,5 г гигроскопической стерильной ваты. Стерилизуют и используют для посева крови.

Полужидкий агар (ПЖА) и МПБ с добавлением 1 % глюкозы и 2—3% глицерина без введения в колбы комков ваты могут быть использованы для выращивания бруцелл из крови животных и других материалов, пробы которых в стерильном состоянии.

Картофельный агар Корнеевой. Берут хорошо очищенный картофель в количестве 500 г, нарезают ломтиками, варят в 1 л водопроводной воды. Затем отвар фильтруют через слой гигроскопической ваты и доливают водой до 1 л. На 1 л фильтрата добавляют следующие ингредиенты: хлорида натрия — 5 г, пептона — 10 г, глицерина — 30 г, глюкозы—10 г, ангара — 20 г для пробирок и 30 г для колб. Смесь варят до расплавления агара, затем ее отстаивают в теплом месте. В остывшем агаре нижний слой с осадком срезают, а прозрачную часть агара режут кусочками и расплавляют. Расплавленный агар фильтруют через ватный фильтр, устанавливают pH 7. Стерилизуют при 115° С в течение 20—30 мин и устанавливают pH 6,8.

Читайте также:  Бруцеллез у человека какие сдать анализы

Среда Кроля. Указанную среду применяют при выделении культур бруцелл из молока. К печеночному агару Хеддлесона добавляют насыщенный раствор генцианвиолета в соотношении 1 : 100000. Выращивают первые 15 ч в обычных условиях, а затем при наличии в сосуде 10% СO2.

Среда Moore и др. Эту среду применяют для выделения культуры Br. canis из крови собак. В колбе вместимостью 100 мл готовят скошенный триптозный агар (коммерческий). Затем в эту же колбу вводят 15 мл бульона, приготовленного из мозга и мышцы сердца крупного рогатого скота. Затем берут по 2 мл крови в асептических условиях из яремной вены собак и тут же добавляют ее в среду, тщательно смешивают и инкубируют 3 нед, придав колбам наклонное положение, чтобы часть плотной среды была открыта.

Наиболее целесообразными являются посевы на плотные среды свежевзятого материала. На плотных средах растут изолированные колонии, что обеспечивает меньшую их диссоциацию по сравнению с жидкими средами. Отсев на плотную среду с жидких сред следует производить через 2—3-е сут. При выращивании культуры бруцелл на жидкой среде, в которой находились одновременно посторонние микроорганизмы, чаще обнаруживаются измененные варианты.

Из загрязненного посторонней микрофлорой материала, например, несвоевременно доставленные абортированные плоды (направленные в незамороженном и неохлажденном виде через сутки после выкидыша), куски плаценты, отдельные органы животных или плодов, моча, содержимое полостей трупов и др., лучше производить параллельно биопробу на морских свинках или белых мышах.

Посевы следует делать на ППГГА с содержанием в нем генцианвиолета или кристаллвиолета, которые в виде насыщенного, водного раствора вводят в среду в соотношении 1 : 200000.

При посевах крови в комбинированных условиях (косяк ППГГА + жидкая среда) СO2 может быть введен в колбу через резиновую нетолстую пробку, под давлением, через иглу со шлангом, соединенным с источником СO2.

Посевы на куриные эмбрионы и жировые (неоплодотворенные) яйца кур лучше производить только материалом, взятым в стерильных условиях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Владельцы патента RU 2688335:

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Плотная питательная среда для культивирования возбудителя бруцеллеза содержит мясную воду двойной концентрации, пептон сухой ферментативный, сыворотку крови лошади нормальную для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую, натрий хлористый, глюкозу, глицерин, натрия метабисульфит и агар микробиологический при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки. 3 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии именно к разработке питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования возбудителя бруцеллеза.

Известна питательная среда мясопептонный агар для выращивания бруцеллезного микроба, основой которой является г/л: мясная вода 1000,0 мл, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого натрия хлористого и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л). В дальнейшем среду автоклавируют при 115°С в течение 20 минут, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой и вновь устанавливают рН 7,1-7,2. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 минут (Профилактика инфекционных болезней инфекции, общие для человека и животных. Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза людей. Методические указания МУ 3.1.7.1189-03. С. 53).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность, ввиду позднего роста возбудителя.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению является питательная среда для культивирования бруцелл содержащая г/л: к 500,0 мл пептона Мартена, добавляют 500,0 мл мясной воды, и 5 г химически чистого хлористого натрия, 5,0 г натрия уксуснокислого и агар-агар 15,0-20,0. Смесь кипятят, устанавливают рН — 7,3±0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют 20 мин при 120°С (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. — 2008. — С. 65-66).

Недостатком данной среды является низкая питательная ценность для бруцеллезного микроба.

Целью изобретения является разработка рецептуры питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза, обеспечивающей достаточное количество колоний максимально в ранние сроки через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что в качестве основного источника азотистого питания в предлагаемой среде используется мясная вода, пептон ферментативный и сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая, для поддержания изотоничности среды и окислительно-восстановительного потенциала натрий хлористый, в качестве стимулирующих добавок — глюкоза, глицерин, натрия метабисульфит, а также агар микробиологический, при следующем соотношении ингредиентов г/л:

Мясная вода 0,800-1200,0
Пептон сухой ферментативный 8,0-12,0
Сыворотка крови лошади нормальная
для культивирования микоплазм на
Натрий хлористый 4,0-6,0
Глюкоза 5,0-15,0
Глицерин 15,0-25,0
Натрий метабисульфит 0, 1-0,5
Агар микробиологический 14,0-22,0

В качестве исходного сырья используют мясную воду, являющуюся основой для многих питательных сред, обычно для приготовления мясной воды служит говядина или конина. Конина отличается большим содержанием углеводов (гликоген). Из мяса молодых хорошо упитанных животных (телят) обычно получают мясную воду лучшего качества (питательные свойства, прозрачность). Азотистые вещества от 12,7 до 21,71%, жиры от 1,4 до 15,5%. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа, общее количество их достигает 1%. Мясо свежее содержит также витамины, экстрактивные вещества в большем количестве чем в замороженном (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз — 1950 г. С. 46-48).

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей — ГОСТ 13805-76. Производитель «НПО Порт-Петровск».

Сыворотка крови лошади нормальная для культивирования микоплазм на питательных средах жидкая. Дата выпуска 27.05.2016. Серия Л-16-04. Срок годности 2 года. Производитель ООО БиолоТ. С-Петербург.

Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24. Производитель г. Барнаул. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.

Глюкоза кристаллическая, чда, партия 20140327 0 00«МСД Торговая компания». Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глюкозы в концентрации 1% — улучшается ее ростовые свойства.

Глицерин ГОСТ 6259-75, партия 21/2015. Дата выпуска 04.2015. Срок годности 3 года. С внесением в питательную среду глицерина в концентрации 2% — улучшается ее ростовые свойства. Производитель Польша.

Натрия метабисульфит ГОСТ 11683-76 в средах переходит в гидросульфит натрия, при нагревании происходит термическое разложение с выделением двуокиси серы (SO2), что способствует нейтрализации продуктов жизнедеятельности культивируемых микроорганизмов.

Агар микробиологический — агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 10.2017 г. Дата изготовления: октябрь 2013 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0.85% не ниже 80°С, температура застудневания — 30-37°С, прочность студня не менее — 350±40 г. Главная особенность агара — его желирующая способность.

Приготовление мясной воды двойной концентрации

Способ приготовления питательной основы для культивирования возбудителя бруцеллеза: 1 кг мясного фарша заливают 1 л дистиллированной воды и ставят на один сутки при температуре 6-8°С. Через сутки смесь фарша с водой кипятят в течение часа. Небольшие количества — до 5 литров можно кипятить на открытом огне, часто помешивая, чтобы не произошло пригорания частичек мяса. После кипячения мясную воду отжимают от фарша, доливают до первоначального объема дистиллированную воду, фильтруют и стерилизуют 30 минут при температуре 120°С. Хранят мясную воду двойной концентрации в стерильном виде.

Приготовление питательной среды плотной

Питательную среду на основе мясной воды двойной концентрации для культивирования возбудителя бруцеллеза готовят следующим способом: соединяют мясную воду — 1000,0; пептон ферментативный — 10,0; натрий хлористый — 5,0; агар микробиологический — 18,0. Среду кипятят до полого растворения ингредиентов, устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси добавляют глюкозу — 10,0; глицерина — 20,0; натрий метабисульфит — 0, 3; тщательно перемешивают разливают по 330 мл питательной среды в градуированные флаконы объемом 450 мл, перекрывают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт, фиксируют резиновым кольцом, стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°С, стерильно над факелом добавляют в каждый флакон по 40,0 мл сыворотки крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкой (т.е 120,0 мл на 880,0 мл среды), затем разливают на чашки Петри по 35-40 мл приготовленной питательной среды. Подсушенные чашки помещают в термостат на 48 ч при 37°С, проверяют на стерильность.

Сочетанное применение выше описанных ингредиентов, обеспечивает существенное усиление ростовых качеств при культивирования возбудителя бруцеллезного микроба в значительно ранние сроки на 2-3 сутки на пластинках питательного агара. Готовую питательную среду плотную используют для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.

Эффективность полученной среды оценивают в соответствии с методическими указаниями (МУ 3.3.2.2124-06) «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», Москва, 2007 г., с использованием вирулентных культур: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M.

Испытуемые культуры выращивают в бактериологических пробирках на поверхности скошенного агара рН 7,2±0,1 при температуре 37°С в течение 48 ч. Из двухсуточных культур тест-штаммов бруцелл смывают с поверхности скошенного агара 0,9% раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ НЦЭСМП МЗ России, эквивалентную 1,7×10 9 бруцелл 1 мл. Полученную микробную взвесь культуры разводят сначала до концентрации 1×10 -9 м.к./мл затем серийными десятикратными разведениями до 1×10 6 и 1×10 7 м.к./мл. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения. По 0,1 мл каждой культуры: Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M из разведений 10 -6 (100 м.к.) и 10 -7 (10 м.к.) высевают на 3 чашки Петри с испытуемыми средами и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С.

Оценку ростовых свойств питательной среды плотной для культивирования возбудителя бруцеллеза Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M проводят путем подсчета количества выросших колоний бруцелл посуточно на пластинках агара с плотной питательной средой через каждые 24-48-72-120 ч. В качестве контроля использовали бруцеллагар.

Пример 1. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду — 800,0 мл; пептон сухой ферментативный — 8,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую — 90,0; натрий хлористый — 4,0; глюкозу — 5,0; глицерин — 15,0; натрия метабисульфит — 0, 1; агар микробиологический — 14,0.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 52 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 разведения вырастает 132; 36; 51; 99 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10 -7 разведения вырастает 12; 8; 3; 11 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 и 10 -7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар — питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 2. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду — 1000,0; пептон сухой ферментативный — 10,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую — 120,0; натрий хлористый — 5,0; глюкозу — 10,0; глицерин — 20,0; натрия метабисульфит — 0, 3; агар микробиологический — 18,0.

При таком соотношении ингредиентов на испытуемой среде колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M начинали формироваться через 48 ч отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 разведения вырастает 184; 50; 86; 134 колоний диаметром 1,5 мм соответственно, из 10 -7 разведения вырастает 22; 12; 4; 18 колонии соответственно типичных по морфологии бруцеллезному микробу, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, отмечался интенсивный рост колоний через 72 ч (на 3 сутки) при посеве 0,1 мл из 10 -6 и 10 -7 разведений вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний соответственно диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар — питательная среда темно- коричневого цвета в микроскоп не просматривается морфология колоний.

Пример 3. Культуры выращивали на питательной среде плотной для культивирования возбудителя бруцеллезного микроба Brucella abortus 544, Brucella abortus 19B A. Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M содержащей, г/л: мясную воду — 1200,0; пептон сухой ферментативный — 12,0; сыворотку крови лошади нормальной для культивирования микоплазм на питательных средах жидкую — 150,0; натрий хлористый — 6,0; глюкозу —

При таком соотношении ингредиентов колонии Brucella abortus 544, Brucella abortus 19BA, Brucella suis 1330, Brucella melitensis 16M на испытуемой среде начинали формироваться через 67 ч, через 76 ч (на 3 сутки — 4 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве 0,1 мл из разведения 10 -6 вырастало 102; 25; 39; 72 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Из разведения 10 -7 вырастало 8; 7; 4; 8 типичных по морфологии колоний вышеуказанных штаммов, соответственно, а на бруцеллагаре начинали формироваться колонии через 48 ч, через 72 ч (на 3 сутки) отмечался интенсивный рост колоний, при посеве по 0,1 мл из разведений 10 -6 и 10 -7 вырастало 151; 37; 68; 98 и 23; 8; 6; 15 колоний указанных штаммов, соответственно, диаметром 1,5 мм. Контрольная среда бруцеллагар — питательная среда темно-коричневого цвета, морфология колоний в микроскоп не просматривается.

Таким образом, заявленная питательная среда плотная для культивирования возбудителя бруцеллеза (пример №2) является оптимальной по количеству подобранных ингредиентов, что позволяет получить достаточное количество колоний в максимально ранние сроки -через 48 ч, а через 72 ч отмечается увеличение колоний до 1,5 мм в диаметре.

Питательная среда плотная для культивирования возбудителя бруцеллеза, при следующем соотношении ингредиентов:

источник