Окраска мазков на бруцеллез

К АВТОРСКОМУ СБИДЕТЕЛЬСТ8У

СПОСОБ ОКРАСКИ МАЗКОВ С БРУЦЕЛЛЕЗНЪ|МИ МИКРОБАМИ

Заявлено 10 июля 1961 г. за № 737509/30 — 15 в Комитет по делам изобретений и открькгий при Совете Министров СССР

Опубликовано в «Бюллетене изобретений» № 3 за 1962 г.

Способы окраски мазков с целью идентификации типа возбудителя заболеваний известны, однако для идентификации типа возбудителя бруцеллеза применяются трудоемкие методы по изучению биологических, биохимических и серологических свойств бактерий. Чаще используют бактериостатический (изучение роста чистых культур возбудителя на средах с фуксином и тионином) и серологический метод, заключающийся в постановке реакции агглютинации с монорецепторными сыворотками. Эти методы требуют стандартных красок, типоспецифнче=ких сывороток и много времени, чтобы получить приближенной точности определение.

Способ дифференциальной окраски бруцелл, описанный в авт. св.

; в 693317 от 10.5.1961 г., выданном автору данного изобретения, позволяет дифференцировать бруцелл типа бовпс от супс и мелитензис, но не обеспечивает дифференциации супс от мелитензис.

Описываемый способ не имеет указанных выше недостатков благодаря применению специального реактива для окраски бруцелл типа мелитензис.

Отличительной особенностью способа является применение реактива, состоящего из равных частей 1%-ного водного раствора основного фуксина и 4%-ного водного раствора бриллиантовой зелени. Этим реактивом окрашивают мазки в течение 10 — 11 мин, после чего промывают водой и высушивают. Подсушенный мазок исследуют под микроскопом с иммерсионной системой. Такой способ окраски мазков с бруцеллпми обеспечивает дефференциацию бруцеллы мелитензис от типов супс и бовис с наименьшей затратой средств и времени. Использование такого простого способа идентификации типов бруцелл имеет большое значение не только в микробиологии, но и в практике борьбы с бруцеллезом.

Для осуществления способа окраски мазков реактив, включающий фуксин и бриллиантовую зелеш; готовят следующим образом.

Способ окраски мазков с бруцеллезными микробами с применением химических реактивов, отличающийся тем, что, с целью обнаружения бруцелл типа мелитензис путем придания им ярко-красного цве-та, применяют реактив, состоящий из равных частей 1%-ного водного раствора основного фуксина и 4%-ного водного раствора бриллиантовой зелени, которым окрашивают мазок в течение 10 — 11 мин, после чего промывают водой, высушивают и исследуют под микроскопоэм с иммер«ионной системой.

Описание составил эксперт А. Д. Мусин

Редактор М. И. Бородина Техред А. А. Кудрявицкая Корректор Р. Я. Беркович

ЦБТИ при Комитете по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, М, Черкасский пер., д. 2/6.

Типография ЦБТИ Комитета по делам изобретений и открытий,при .Совете Министров СССР, Москва Петровка, 14.

Ввиду того, что растворимость фуксина. в воде равняется только 0,39%, оба раствора препаратов перед смешиванием подогревают до 70 — 80 .

Для ускорения растворения фуксина раствор при подогревании помешивают. После подогрева растворы смешивают в горячем виде и полученную смесь в течение суток выдерживают в термостате при 37 .

Мазки для окраски готовят из 2 — 4-суточной культуры бруцелл, выращенной на плотном агаре. При нанесении культуры на стекло ее смешивают с физиологическим раствором. Мазки подсушивают на воздухе. или слабо фиксируют над пламенем. Подготовленный мазок окрашивают реак ивом в течение 10 — 11 мин, затем подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

При микроскопии мазков наблюдают следующую микроскопическую картину: живые недиссоциированные бруцеллы типа суис и бовиссине-зеленого цвета, а мертвые — красного цвета: недиссоциированные бруцеллы типа мелитензис — мертвые и живые — ярко-красного цвета, в некоторых случаях среди этих клеток встречаются зеленоокрашенные клетки.

источник

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Изучить свойства возбудителя и методы микробиологической диагностики бруцеллеза/

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Для демонстрации необходимы схема микробиологической диагностики бруцеллеза, таблицы (морфология бруцелл), микроскопические препараты – мазки, окрашенные по методу Козловского и по Граму, пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком, биопрепараты, пробирки с культурой бруцелл (вакцинный штамм) на питательных средах (мясо-пептонный печеночный бульон – МППБ, мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар – МППГГА, МППБ и МППГГА с 10 % глюкозой и 2-3 % глицерином), труп морской свинки, павшей после заражения вакцинным штаммом бруцелл, бруцеллезная сыворотка, бруцеллезный антиген, взвесь бруцелл, кишечной палочки.

При подготовке к занятию необходимо уяснить следующие вопросы:

1. Виды возбудителя бруцеллеза, морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические особенности бруцелл.

2. Схема бактериологической диагностики бруцеллеза.

3. Серологическая диагностика бруцеллеза.

4. Специфическая профилактика бруцеллеза.

1. Классификация возбудителя

Виды: Вг. melitensis(овец и коз)

Вг. abortus (крупного рогатого скота)

Вг. suis (4 биовар) бруцеллез северных оленей

Вг. ovis (инфекционного эпидидимита баранов)

Вг. neotomaе (кустарниковых крыс).

2. Общая характеристика болезни:

Бруцеллез – хроническая инфекционная болезнь, у животных протекает в скрытой форме, происходят массовые аборты, задержание последа, метриты и др.

— многие виды с.-х. и диких животных, включая человека.

4. Патогенез и факторы вирулентности:

— возбудитель в организм проникает алиментарным и половым путями,

— бруцеллы вначале размножаются в ближайших лимфатических узлах, далее проникают во внутренние органы, инфекция принимает генерализованный характер. Наиболее благоприятную среду для размножения бруцеллы находят в беременной матке, что приводит к эндометриту, нарушению питания плода и аборту. Плодные оболочки многих животных содержат эритриол – фактор роста бруцелл,

— факторами вирулентности у бруцелл являются эндотоксины и ферменты патогенности — гиалуронидаза, каталаза, уреаза.

Методы диагностики (рис. 101):

А. Бактериологический метод:

1. Материал для исследования:

— абортированный плод с оболочками, желудок, печень, почки плода, молоко и др.

Рис. 101. Схема лабораторной диагностики бруцеллеза

а) методы окраски: по Граму, по Козловскому

— 2%-ный раствор сафранина (при подогревании) – 2 мин;

— 2%-ный раствор малахитовой зелени – 2 мин.

Бруцеллы окрашиваются в красный цвет; ткани, форменные элементы, другие бактерии – в зеленый.

б) микрокартина: мелкие коккобактерии (0,3-0,6 мкм) или мелкие палочки (0,6-2,5 мкм), располагаются одиночно, парами и небольшими группами (рис 102);

а) посев на питательные среды – мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозо-глицериновый бульон и агар (МГГБ и МГГА) с 10%-ной глюкозой и 2-3%-ным глицерином.

б) особенности выделения возбудителя:

— выращивают в атмосфере 10-15 % СО₂ (Вг. abortus, Вг.ovis в первой генерации);

— остальные виды бруцелл – аэробы;

— оптимальная температура 37°С;

— срок культивирования от 15 до 30 дн.

— на жидких средах – равномерное помутнение, пристеночное кольцо, незначительный осадок;

— на плотных средах – мелкие, прозрачные с ровным краем колонии.

— сахаролитические свойства выражены слабо;

Рис. 102. Возбудитель бруцеллеза из чистой агаровой культуры. Увеличение, х900

— протеолитические свойства – молоко не свертывают, желатин не разжижают, сероводород образуют Вг.suis, в меньшей степени Вг.abortus

— заражают подкожно морских свинок, белых мышей.

Дифференциацию проводят по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, по бактериостатическому действию красок, РА и вирулентности.

— используют РА, РСК, РДСК, РИД-ОПС (РИД с ОПС-антигеном), кольцевую пробу с молоком, Роз-Бенгал пробу.

— для диагностики бруцеллеза у свиней используют аллерген бруцеллин ВИЭВ, который вводят внутрикожно с наружной стороны ушной раковины,

— у животных, больных бруцеллезом, на месте введения аллергена развивается воспалительная реакция.

5. Биопрепараты для специфической профилактики:

— для крупного рогатого скота – живые вакцины из штамма 19 и штамма 82;

— для мелкого рогатого скота – живая вакцина из штамма 19.

6. Биопрепараты для специфической терапии:

Задания для самостоятельной работы

1. Изучить культуральные особенности бруцелл на плотной и жидкой питательных средах. Сравнить культуральные свойства со свойствами других видов бактерий.

2. Приготовить препараты-мазки из органов морской свинки, зараженной вакцинным штаммом возбудителя бруцеллеза. Окрасить по Козловскому и провести микроскопию. Провести дифференциацию бруцеллы от других микроорганизмов.

3. Приготовить препараты из смешанной бактериальной культуры, окрасить по Граму.

4. Провести постановку пробирочной РА на бруцеллез с сывороткой крови крупного рогатого скота.

5. Провести постановку кольцевой пробы с молоком.

источник

Окраска бруцелл по Шуляку-Шин. Мазок фиксируют на пламени, окрашивают 2 минуты карболовым фук­сином Циля, разведенным водой 1:5, промывают водой, окрашивают 5 минут 2%-ным водным раствором метиленового синего, промывают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы — красные, другие бактерии име­ют синий цвет.

Окраска бруцелл по Кюстеру. Препарат фиксируют на пламени, окрашивают 60 секунд щелочным ра­створом сафранина, промывают водой, обрабатывают 15 секунд 0,05%-ным раствором серной кислоты, тщательно промывают водой, окрашивают 15-20 секунд 3%-ным водным раствором метиленового синего. Микроскопичес­кая картина: бруцеллы — красные, другие бактерии синего цвета.

Микроскопическое исследование исходного материала

Из поступившего материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и одним из специальных методов (по Козловскому, Стампу и т.д.), а также бруцеллезными люминесцирующими сыворотками.

В препаратах, окрашенных по методу Грама, бруцеллы имеют форму мел­ких, коротких, коккоподобных или палочковидных грамотрицательных бак­терий, размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм, истинной капсулы не образуют, рас­положены одиночно, реже — парами, короткими цепочками или небольши­ми группами.

Для бруцелл характерно более медленное окрашивание и отдача краси­теля при промывании водой или обработке слабыми растворами кислот по сравнению с другими видами бактерий, что позволило ряду авторов предло­жить дифференциальные методы окраски клеток возбудителя.

Окраска бруцелл по Е.В. Козловскому. Мазок фиксируют на пламени, окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина 2 минуты с подогреванием до появления пузырьков, затем про­мывают водой и докрашивают 0,75-1%-ным водным раствором брилли­антовой или малахитовой зелени (или метиленового синего) в течение 1-2 минут, споласкивают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы — ярко-красные, другие бактерии — зеленого или синего цвета.

Окраска бруцелл по Стампу (модифицированный метод Циля- Нильсена). Мазок фиксируют на пламени, окрашивают фуксином Пфейффера в те­чение 10 минут, промывают водой, обрабатывают
30 секунд 0,5%-ным вод­ным раствором уксусной кислоты, промывают водой, окрашивают 20-30 секунд 1%-ным водным раствором метиленового синего, промывают во­дой. Микроскопическая картина: бруцеллы — красные, прочие бактерии имеют синий цвет.

Приготовление щелочного раствора сафранина (ex tempore). Смешивают 5 капель 3%-ного водного раствора сафранина и 1,5 мл нормального раствора КОН (5,6 г на 100 мл воды).

Иммунолюминесцентное выявление бруцелл проводят прямым или не­прямым способом.

Культивирование.Обычно исследуемый материал засевают в пробирку с жидкой и в не­сколько пробирок (5-10) — с агаровой питательной средой (мясо-пептонный печеночный бульон, мясо-пептонный-печеночно-глюкозный-глицериновый бульон, альбими-бульон, аналогичные агаровые среды, сывороточнокартофельный агар, сывороточно-декстрозный агар). Бруцеллы хоро­шо растут на кровяном агаре (5-10%). Загрязненный материал высевают на сывороточно-декстрозный агар с ингибиторами (рекомендация Объеди­ненного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу): генцианвиолет 1:200 тыс. или кристаллический фиолетовый 1:100 тыс., уксуснокислый натрий (0,25 мг/мл) или паранитрофенилглицерин (0,005-0,007%).

Бруцеллы — аэробы или микроаэрофилы. Температурный оптимум 37°С, диапазон — 20-40°С, оптимум рН 6,6-7,4. Микроаэрофильные свойства проявляют В. abortus и В. ovis. Поскольку не известно, какой вид бруцелл присут­ствует в исследуемом материале от крупного рогатого скота, то половину пробирок с посевами инкубируют в условиях обычной атмосферы, вторую — в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (10-12%). Посевы при исследовании на наличие В. ovis инкубируют только в атмос­фере СО₂. В первой генерации бруцеллы обладают замедленным ростом, по­этому посевы культивируют, периодически просматривая, до 30 дней. Подготовка и исследование различных материалов имеют некоторые особенности.

При исследовании абортированного плода производят посев тканевого гомогената или пастеровскими пипетками непосредственно из органов. Посевы делают из экссудата грудной и брюшной полостей, содержимого желудка, крови сердца, печени, селезенки, легких. При посеве из паренхи­матозных органов выбирают участки с фокусами некрозов, кровоизлияни­ями.

Для изготовления тканевого гомогената кусочки паренхиматозных ор­ганов обжигают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком и физиологическим раствором (1:10), гомогенат высевают на среды. Анало­гичным образом подготавливают для посева материал, взятый при диагно­стическом убое животных.

При осмотре плаценты отбирают участки с утолщенными ворсинками и стенками, с наличием гнойного экссудата. Поверхность плаценты обраба­тывают тампонами с дезинфектантами, просушивают стерильными тампо­нами, прижигают выбранный участок, вырезают необходимые фрагменты, измельчают, как было описано выше, и высевают на среды с ингибитора­ми.

Порции молока из каждой четверти вымени центрифугируют при 1000-3000 об/мин в течение 10-20 минут. Посев производят из осадка и слоя сливок на селективные среды. Рекомендуется исследовать пробы молока, взятые от животного несколько раз с интервалом 5-10 суток.

Мочу (75-100 мл) перед посевом на питательные среды центрифугиру­ют при 3000 об/мин в течение 10 минут и осадок высевают на селективные среды. Возможна концентрация бруцелл путем добавления к моче бруцеллез­ной агглютинирующей сыворотки (1-2%) с титром не менее 1:800. После непродолжительного инкубирования мочу центрифугируют и осадок высе­вают на питательные среды.

Эффективен посев в жировые куриные яйца при исследовании крови, мочи и других материалов, содержащих малое количество возбудителя. Исполь­зуют свежие куриные яйца (3-5 дней). На каждый материал берут 3-5 яиц. Исследуемый материал в количестве 0,2 мл вводят в желточный мешок, ин­кубируют при 37° С в течение пяти суток, вскрывают, набирают пастеровс­кими пипетками белок и желток и высевают на плотные и жидкие питатель­ные среды (методика Одесского ИМ имени И.И. Мечникова).

Кровь высевают сразу после взятия в жидкие питательные среды с антикоагулянтом (2%-ный цитрат натрия). В 100 мл среды засевают около 20 мл крови. В качестве питательной среды используют бульон Альбими, триптозный бульон, среду Первушина, МПБ с 1% глюкозы и 2-3% глицерина. Хо­рошие результаты получаются при посеве на комбинированные среды (ме­тод Кастанеда). Например, в колбе (пробирке) скашивают агар (ППГГА), добавляют какую-либо жидкую питательную среду, чтобы она покрывала половину поверхности агара, и в нее засевают кровь (П.А. Триленко 1976). Через 4-6 дней культивирования поверхность агара увлажняют жидкой средой и в последующем периодически просматривают с целью обнаружения колоний бруцелл.

Характер роста бруцелл на питательных средах.Колонии бруцелл появляются на поверхности плотных питательных сред на 5-10-е, реже — на 20-25-е сутки. В первичных посевах формируются, как правило, колонии S-формы: бесцветные, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкой маслянистой поверхностью, полупрозрачные, диаметр коло­ний в зависимости от типа питательной среды от 0,1-0,7 до 2,0-2,5 мм и более. По мере старения колонии теряют прозрачность, мутнеют и темнеют за с 1ст появления пигмента. На ППГГА в проходящем свете колонии имеют ян-гарный оттенок.

При изучении колоний в косопроходящем пучке света они имеют зеленовато-серо-голубой цвет с неболь­шим красновато-желтым центром.

При исследовании материала от животных с хроническим течением бру­целлеза могут быть выделены бруцеллы в R-форме, отличающиеся не толь­ко по форме, но особенно по характеру свечения колоний.

В жидких питательных средах бруцеллы растут с равномерным помут­нением среды, медленным появлением небольшого, голубоватого в прохо­дящем свете пристеночного кольца или кольца и поверхностной пленки. На дне пробирки постепенно образуется рыхлый осадок.

Морфология и тинкториальные свойства клеток бруцелл в культуре.Из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, Коз­ловскому. Клетки бруцелл в культуре не отличаются по морфологии от кле­ток возбудителя в исходном материале (см. выше), жгутиков не имеют.

Идентификация бруцелл на уровне рода.Принимают во внимание время появления макроскопически видимого роста, на питательных средах — потребность в СО₂.Согласно действующему в РФ «Наставлению по диагностике бруцел­леза животных» (2000), при обнаружении в посевах бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для бру­целл, проводят их серологическую идентификацию. Для целей серологи­ческой идентификации используют двухсуточные агаровые культуры ис­следуемых бактерий и диагностические агглютинирующие R- и S-сыворотки. На предметном стекле в каплях S- и R-сывороток, физиологического раствора суспензируют бактериологической петлей испытуемую культу­ру. Для контроля R-сыворотки проверяют в разведении, указанном био­фабрикой с роз-бенгал и цветным антигенами; S-сыворотки — в титре, ука­занном на коробке с цветным бруцеллезным антигеном и в неразведенном виде с роз-бенгал антигеном.

Если испытуемая культура дает положительную РА (два креста и более) с обеими или любой одной диагностической сывороткой и отрицательный ре­зультат с физиологическим раствором, то ее относят к бруцеллам.

Оценка результатов РА проводится при условии, что R- и S-сыворотки дают в контролях с гомологичными антигенами агглютинацию интенсив ностью минимум на три креста, при отсутствии реакции с гетерологичными антигенами. Агглютинация с R-сывороткой происходит замедленно, с ней всегда реагируют культуры В. ovis и В. canis.

Для идентификации выделенной культуры на уровне рода также иссле­дуют оксидазную, каталазную активность, наличие жгутиков, образова­ние индола, уреазы, способность редуцировать нитраты, агглютинировать в бруцеллезной позитивной сыворотке, а также патогенность для лабора­торных животных (см. «Биопробу»).

Бруцеллы не обладают подвижностью, образуют каталазу, обычно ок-сидазу (кроме В. ovis и В. neotomae) и уреазу (кроме В. ovis и некоторых штаммов В. melitensis), редуцируют нитраты, не образуют индол.

Наставлением по диагностике бруцеллеза животных (2000) в РФ пре­дусмотрено использование полимеразной цепной реакции.

Идентификация бруцелл на уровне вида и биовара.Критерии дифференциации видов и биоваров бруцелл представлены в таблицах.

Определение вида и биовара выделенной культуры бруцелл дает воз­можность более детально проводить эпизоотологический и эпидемиологи­ческий анализ.

Разработанные методы дифференциации видов бруцелл предполагают работу с бруцеллами в S-форме (кроме В.ovis и В. canis), поэтому перед проведением таких исследований проверяют популяцию на диссоциацию методом окраски колоний кристаллвиолетом по Уайту-Вильсону. Для этого готовят взвесь 48-часовой изучаемой агаровой культуры в стериль­ном физиологическом растворе концентрацией 0,5-1 млрд. микробных клеток в 1 мл по бруцеллезному стандарту мутности. Одну каплю взвеси засевают последовательно шпателем на поверхность агаровой среды в трех чашках Петри.

Посевы инкубируют 5 суток при 37-38°С. При таком методе посева на плотной среде вырастает достаточно большое количество изолирован­ных колоний бруцелл. В чашки Петри с колониями осторожно пасте­ровской пипеткой наливают рабочий раствор кристаллвиолета 1 тонким слоем. Через пять минут краситель осторожно отсасывают пипеткой и сливают в емкость с дезраствором. Затем колонии изучают при помощи стереоскопического микроскопа.

Диссоциированные колонии имеют цвет от темно-фиолетового до свет­ло-синего, S-колонии окрашиваются в светло-желтый, реже — в светло-зеленый цвет. Для изучения отвивают несколько колоний в
S-форме.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

В СССР в настоящее время известны 4 вида бруцелл — Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis и Br. ovis.

Микроскопически все 4 вида бруцелл между собой не различимы.

Морфологические свойства бруцелл. Морфология бруцелл несколько варьирует в зависимости от среды, в которой они культивируются (жидкая, плотная, содержащая кровь), давности пересева и других условий. Особенно часто наблюдается это с культурами Br. ovis.

Бруцеллы имеют вид мелких кокков или очень коротких палочек, похожих на овоиды. Br. melitensis имеет размер 0,4—2,2 мкм в длину и 0,4—0,8 мкм в ширину; Br. abortus — 0,4—2,5 мкм в длину и 0,4—0,6 мкм в ширину; Br. suis чаще встречается в виде палочек 0,6—3 мкм в длину и 0,2—0,8 мкм в ширину.

В мазках из патологического материала, например из содержимого сычуга абортированного плода, бруцеллы часто группируются кучками, располагаясь в одной плоскости. В таких скоплениях бруцеллы имеют вид микрококков, а клетки, лежащие отдельно в этом же мазке, — коротких палочек.

Бруцеллы спор не образуют. В особых условиях, чаще в организме животных, образуют капсулы. Хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красками и по Романовскому.

Методы окраски бруцелл. Для окраски бруцелл чаще применяют 2 способа — по Козловскому и по Граму. Также рекомендуется окраска их по Кюстеру.

Окраска по Козловскому. Метод Козловского основан на свойстве бруцелл более медленно воспринимать некоторые краски, в частности растворы сафранина, по сравнению с посторонними микроорганизмами, наиболее часто встречающимися в обследуемых материалах. По Козловскому очень показательно окрашиваются присылаемые в лабораторию мазки, приготовленные из выделений матки, плаценты, сычуга и других органов абортированного плода, плодных оболочек, гноя и др. Бруцеллы окрашиваются в красный цвет, а другие микроорганизмы — в зеленый. При исследовании выделений из матки бруцеллы могут быть обнаружены внутри лейкоцитов. Этот метод пригоден также для окраски музейных культур.

Окраску по Козловскому производят следующим образом. Нетолстый мазок из культуры или отпечаток из органов на предметном стекле высушивают на воздухе или в термостате, затем фиксируют над пламенем горелки. Покрывают 2%-ным водным раствором сафранина и подогревают при движении стекла над пламенем горелки в течение 1,5—2 мин, до появления пузырьков газа. Затем мазок промывают водой, окрашивают 0,75—1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 20—30 с, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Малахитовую зелень можно заменить 1%-ным раствором бриллиантовой зелени или метиленовой синьки.

Окраска по Граму. Приготовленные и фиксированные мазки таким же образом, как и в предыдущем случае, покрывают фильтровальной бумагой, увлажненной изотоническим раствором хлорида натрия или дистиллированной водой. Наносят на 2 мин кристаллвиолет или генцианвиолет так, чтобы краска не заходила за края бумаги, и равномерно распределяют по поверхности стекла. Затем удаляют бумагу, наносят на 2 мин свежеприготовленный люголевский раствор, а по истечении указанного срока раствор смывают и на 2 мин покрывают мазок йодированным спиртом (2 мл 10%-ного спиртового раствора йода и 98 мл 96%-ного этилового спирта). После этого мазок промывают и докрашивают в течение 2 мин 1%-ным водным раствором сафранина или фуксином Циля, разведенным 1 : 10 дистиллированной водой. Затем мазок вновь промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Окраска бруцелл по Граму является одним из лучших методов.

Окраска по Кюстеру. Приготовленный тонкий мазок из материала, разведенного изотоническим раствором хлорида натрия, высушивают и фиксируют над пламенем горелки. Готовят ex tempore щелочной раствор сафранина: берут 1,5 мл нормального раствора КОН (5,6 г КОН на 100 мл дистиллированной воды) и добавляют 5 капель 3%-ного водного раствора сафранина. Красят мазок щелочным раствором сафранина в течение 1 мин и смывают водой. Затем на мазок наносят 0,05%-ный раствор серной кислоты на 15 мин (протрава). Мазок тщательно промывают водой и красят в течение 15—20 с 3 %-ным водным раствором метиленовой синьки, промывают водой и высушиваю фильтровальной бумагой. Бруцеллы окрашиваются в красный цвет, остальные микроорганизмы — в синий.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

источник

Цель занятия:Ознакомить студентов с правилами отбора проб материала от жи­вотных, его упаковки и пересылки в лабораторию, а также с методами бактерио­логических и серологических исследований материала на бруцеллез.

1. Приготовить мазки из патологического материала;

3. Окрасить по Козловскому;

4. Просмотреть под микроскопом, микрокартину зарисовать в тетради;

5. Поставить розбенгал-пробу;

6. Поставить кольцевую реакцию с молоком.

Материалы и оборудование:Растворы красителей для окраски по методу Козлов­ского, сыворотки крупного рогатого скота — позитивная (бруцеллезная) и нор­мальная в пробирках по 1 мл и те же сыворотки под разными номерами (шифра­ми) — испытуемые, бруцеллезный антиген для розбенгал-пробы и антиген бру­целлезный для кольцевой пробы с молоком; молоко коровье, свежее — отдельно пробирки с молоком от здоровых животных и пробирки с молоком от коров, больных бруцеллезом (содержащие антитела), по 2 мл в каждой; пробирки соот­ветственно помечены № 1 и 2; пипетки градуированные стерильные емкостью 1 и 0,1 мл (количество пипеток в зависимости от количества студентов в группе); пластины с луночками для постановки розбенгал-пробы, пробирки со взвесью бруцелл (антиген) и в смеси с бактериями других видов в физрастворе (сальмо­неллы или мезентерикус), вакцинный штамм микроба сибирской язвы и пробирки по 10 мл с физраствором. Для демонстрации необходимы таблицы (морфология бруцелл); пробирки с агаровой культурой бруцелл, залитые парафином (вак­цинный штамм); микроскопические препараты — мазки, окрашенные по методу Козловского и по Граму; в мазках — бруцеллы в смеси с другими бактериями; пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком; био­препараты.

Классификация:

Секция – 4, грамотрицательные аэробные палочки и кокки.

Виды – Br. melitensis (выделен от коз и овец), Br. abortus (выделен от крупного рогатого

скота), Br.suis (свиной), Br. ovis (бараний вид), Br. canis (собачий) и Br. neotoma

Бруцеллы— микроорганизмы, вызывающие инфекционную, хронически протекающую болезнь животных (и человека) — бруцеллез. Наибольшее значение в патологии бруцеллеза животных и человека имеют бруцеллы первых трех видов. Бруцеллез жи­вотных преимущественно протекает бессимптомно. Диагностика этой болезни основывается на показаниях результатов серологических, бактериологических, а также аллергических методов исследования с учетом клинических признаков болезни — аборты, бурситы, орхиты, эпидидимиты, эндометриты.

Патологический материал. Для бактериологического исследования на бруцеллез (при жизни животного) в лабораторию направляют: абортированный плод с плодными оболочками, околоплодную жидкость, истечения из родовых путей, желудок плода, перевязанный с двух концов лигатурой, кусочки печени и селезенки плода. Молоко берут от коров в стерильные пробирки по 10—15 мл из каждой доли вымени (последние порции), у овец и коз — путем пункции цистер­ны вымени посредством стерильного шприца с иглой. Для исследования молоко отсылают свежим (в день взятия пробы); если это не представляется возможным, то его консервируют (лучше сухой борной кислотой из расчета 0,1 г на 10 мл мо­лока). При убое самцов (баранов и др.) исследуют пораженные ткани органов — семенники с придатками.

Бактериологическая диагностика бруцеллеза проводится по общеприня­тому принципу — микроскопия, высев на питательные среды для выделения и изучения чистой культуры, биопроба (заражение морских свинок).

Микроскопия. Из каждой пробы патматериала готовят два мазка-отпечатка из тканей органов или два мазка из жидкого материала (истечения), высушивают, фиксируют над пламенем. Один препарат окрашивают по Граму, другой — спе­циальным методом (по Козловскому; Шуляку — Шину или Стампу). Мазки, при­готовленные из осадка молока (сливок), после центрифугирования перед окрас­кой следует обезжирить смесью Никифорова. Бруцеллы — мелкие, палочко- или кокковидной формы бактерии, длиной 0,6—1,5 мкм, в диаметре — 0,3—0,5 мкм; неподвижные, спор не образуют, рас­полагаются в мазке изолированно, попарно или небольшими скоплениями, куч­ками.

Грамотрицательные.

Окраска по методу Козловского. Фиксированные препараты окрашивают свежеприготовленным 2 %-ным водным раствором сафранина при подогревании до появления паров (2 минут). Мазок быстро промывают водой и докрашивают 1 %-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 1 минут, затем его про­мывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют: бру­целлы — красные, остальные микробы — зеленые.

Культуралъные свойства. Для выделения бруцелл делают посевы на специальные питательные среды: мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый агар и бульон (ПГГА, ПГГБ), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар и др.

Посев исследуемого материала в жидкие и на плот­ные питательные среды проводят пастеровской пипеткой в несколько пробирок или чашек Петри. При исследовании молока полагается предварительно его центрифуги­ровать (300 об/мин 30 минут). Затем осадок высевают на агаровую среду в чашках Петри, содержащую бактериостатическое вещество, например в среду Козловского (МППА с глюкозой и краской — генциан фиолетовый или малахитовая зелень). За­сеянные среды помещают в термостат при +37—38 °С на 30 дней. Следует учиты­вать что В. abortus в первых генерациях растет при пониженном содержании 0₂. По­этому половину посевов из пат.материала от крупного рогатого скота культивируют при обычных условиях, другую половину (и все посевы при выделении В. ovis) — в атмосфере, содержащей 10—15 % углекислоты (в эксикаторах). Все посевы про­сматривают через сутки, затем через каждые 3—4 дня. Рост бруцелл проявляется через 7—10—30 и даже 40 дней. По мере адаптации к питательным средам рост культуры может появиться на 2—3-й день. На плотных питательных средах рост бруцелл проявляется мелкими прозрачными выпуклыми, округлыми, блестящими колониями с гладкой (S-формы) поверхностью и голубова­тым оттенком (встречаются и R-формы). При более длительном культивировании ко­лонии мутнеют, с появлением пигмента — темнеют, сливаются. В жидких питатель­ных средах рост бруцелл проявляется вначале равномерным помутнением и образо­ванием пристеночного кольца голубоватого оттенка; впоследствии образуется незна­чительный осадок. При обнаружении роста из типичных колоний готовят мазки, ок­рашивают специальными методами и просматривают под микроскопом. Затем пере­севают на плотную питательную среду и культивируют при тех же условиях.

Культу­ры идентифицируют по тинкториальным, морфологическим, культуральным свойст­вам. Кроме того, ставят РА на предметном стекле с позитивной бруцеллезной сыво­роткой, разведенной 1:50 и 1:2 (для выявления слабо агглютинирующих культур). Первичную культуру Br.ovis надлежит подвергнуть серологической идентификации — чистой выделенной культурой гипериммунизируют кроликов, затем их сыворотку исследуют в РДСК с антигеном Br.ovis (овисный антиген).

Биопроба осуществляется заражением морских свинок (параллельно с по­севами материала на питательные среды), которых предварительно подвергают серологическому контролю посредством РА (должен быть отрицательный ре­зультат в разведении сыворотки 1:5). Суспензию из ткани органов, содержимого желудка плода (1:10 в физрастворе) в дозе 1 мл, осадка после центрифугирования проб молока с добавленными сливками из верхнего слоя — 2—3 мл вводят мор­ской свинке подкожно с внутренней стороны бедра. Свинка не погибает. На 15— 25-й и 40-й день после заражения у свинок исследуют пробы сывороток крови пробирочным методом РА в разведениях от 1:10 до 1:80. При получении положи­тельных результатов морских свинок убивают и из органов делают посевы на пи­тательные среды с целью выделения культуры бруцелл. При выделении культуры возбудителя или получении положительного результата РА в титре 1:10 и выше лабораторный диагноз бруцеллеза считают установленным.

Все выделенные культуры бруцелл после их идентификации уничтожают автоклавированием при 1,5 атм в течение 1 часа. При необходимости определения вида бруцелл выделенную культуру на­правляют в областную (или республиканскую) лабораторию или в НИИ, имею­щие разрешение на работу с особо опасными инфекциями, где и определяют ферментативную (биохимическую) активность чистой культуры и учитывают дифференциальные признаки бруцелл.

Биохимические свойства. Желатину и свернутую сыворотку бруцеллы не разжижают, индол не образуют, сероводород и аммиак образуют в зависимости от вида и штамма. Молоко не свертывают, образуют каталазу. Ферментируют глюкозу, арабинозу, декстрозу, левулезу и др. с образованием кислоты.

Для дифференциации видов бруцелл используют чистые культуры (в S-форме). Наличие диссоциации культуры бруцелл определяют путем реакции термоагглютинации, пробы с флавакридином, окраской колоний кристаллвиоле-том. Посредством последнего метода устанавливают: если после внесения пасте­ровской пипеткой в культуру, выросшую в чашке Петри, краски в разведении 1:2000, приготовленной ex tempore (ее отсасывают из чашки через 5 минут), ко­лонии, просматриваемые под лупой, окрашены в темно-фиолетовый цвет,— культура диссоциированная. Если же колонии зеленого цвета или светло-желтого, значит, культура недиссоциирована (S-форма). Из типичных S-форм колоний микроорганизмы пересевают на скошенный МППА (в пробирках) и вы­росшую культуру идентифицируют по показателям.

Серологическая диагностика бруцеллеза осуществляется посредством про­бирочной РА, РСК, РДСК, розбенгал-пробы (РБП) с сыворотками крови исследо­вания молока с помощью кольцевой реакции (КР), ИФА, ПЦР.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

источник

Купить ГОСТ 25385-91 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

• Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
• Курьерская доставка (7 дней)
• Самовывоз из московского офиса
• Почта РФ

Распространяется на методы диагностики бруцеллеза животных.

×

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

КОМИТЕТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И МЕТРОЛОГИИ СССР Москва

УДК 636.9.001.4:006.354 Группа С7в

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ стандарт СОЮЗА ССР

Методы диагностики бруцеллеза ГОСТ

Agricultural animals. Methods of diagnostics 25385_91

Настоящий стандарт распространяется на методы диагностики бруцеллеза животных.

1.1. Для бактериологического исследования берут абортированные плоды (от свиноматки не менее трех плодов) или их части (перевязанный желудок с содержимым, печень, селезенка), околоплодную жидкость, плодовые оболочки, молоко, содержимое гигром (бурситов), абсцессов, а от животных, убитых с диагностической целью — паренхиматозные и половые органы и лимфатические узлы.

Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).

Для исследования на инфекционный эпидидимит в лабораторию направляют: от баранов — семенники с придатками; от овцематок — абортированные плоды с плодовыми оболочками.

Отобранные для бактериологических исследований пробы упаковывают в полиэтилен, целлофан или пергаментную бумагу, помещают в общую тару (ящик, пакет) и в тот же день отправляют в лабораторию.

Одновременно с материалом в лабораторию направляют кровь животного для серологического исследования и акт с анамнестическими данными.

1.2. Для серологического исследования берут кровь из яремной вены (у свиней из ушной или хвостовой) в стерильные про-

(С) Издательство стандартов, 1992

Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта СССР

бирки по 5—10 см 5 от каждого животного или используют кровь, полученную при убое.

Пробирки маркируют, составляют опись проб и направляют в лабораторию.

2.1. Метод бактериологического исследования Сущность метода заключается в выявлении бруцелл в исследуемом материале путем определения характера роста выделенных культур микробов на питательных средах, их морфологии, тинкто-риальных, антигенных и патогенных свойств для морских свинок.

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы Гомогенизатор электрический бактериологический.

Микроскоп иммерсионный с контрастным приспособлением или стереоскопический.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5, 10 и 100 см 3 по ГОСТ 20292.

Чашки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

Масло иммерсионное для микроскопии.

Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16280.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Генциан фиолетовый (генцианвиолет).

Йод металлический (кристаллический).

Кислота карболовая кристаллическая.

Сыворотка крови бычья или лошадиная (нормальная).

Набор компонентов для серологической дифференциации куль тур бруцелл.

Свинки морские массой 300—400 г.

2.1.2 Подготовка к исследованию

2.1.2.1. Для приготовления карболового кристаллического фиолетового или генциан фиолетового для окраски по Граму берут 1 г кристалл- или генцианфиолетового, растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см 3 96%-ного этилового спирта. После того как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр.

2.1.2.2. Для приготовления раствора Люголя в 10 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают от 5 до 6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см 3 дистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.

2.1.2.3. Для приготовления карболового фуксина Циля берут 1 г основного кристаллического фуксина, растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 см 3 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см 3 этилового 96%-ного спирта. После того как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см 3 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.

Перед работой к одной части карболового фуксина Циля прибавляют девять частей дистиллированной воды.

2.1.2.4. Для проведения исследований используют также готовые стандартные растворы генциана фиолетового, Люголя, фуксина Циля, зелени малахитовой.

2.1.2.5. Для приготовления сывороточно-декстрозного и кровяного агара на мясном экстракте вначале готовят питательный агар. К 1000 см 3 дистиллированной воды прибавляют 15 г агара, 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 5 г мясного экстракта. Все ингредиенты помещают в сосуд и подвергают обработке текучим паром в течение 1 ч. Устанавливают pH 6,8. Затем автоклавируют при 127°С для выпадения фосфатов. Среду фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 7,4 и стерилизуют при 115°С в течение 15 мин.

Для приготовления сыворочно-декстрозной среды питательный агар охлаждают до 50°С и добавляют 5% нормальной инактивированной лошадиной или бычьей сыворотки и 1% раствора декстрозы.

Для приготовления кровяной среды питательный агар охлаждают до 50°С и добавляют от 10 до 20% дефибринированной крови нормальных телят, лошадей или овец. Смешивают и разливают в стерильные пробирки или бактериологические чашку.

2.1.2.6. Для исследования на Brucella ovis приготовляют сы-вороточно-глицериново-декстрозный агар.

Расплавленный питательный агар охлаждают до 50°С и добавляют к нему глицерина 2%, декстрозы 1% и сыворотки инактивированной 10—20%. Смешивают и разливают в стерильные пробирки или бактериологические чашки.

2.1.2.7. Для приготовления печеночного настоя свежую говяжью печень освобождают от жира и пленок и пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой (на 1 кг фарша — 1 дм 3 воды) и настаивают при 25—30°С в течение 3 ч или при 4—10°С в течение 6—10 ч. Затем смесь подвергают обработке текучим паром в течение 20 мин или варят в котле 2 ч, постоянно помешивая и снимая накипь. После варки настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по бутылям и стерилизуют 30 мин при 112—115°С.

2.1.2.8. Для приготовления печеночного бульона к 500 см 3 печеночного настоя, приготовленного по п. 2.1.2.7, добавляют 500 см 3 водопроводной воды, 10 г сухого пептона и 5 г хлористого натрия. Смесь кипятят, устанавливают pH 7,4 и фильтруют через фильтровальную бумагу, затем разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют 20 мин при 115—120°С. После стерилизации pH бульона должен быть 7,1—7,2.

2.1.2.9. Для приготовления печеночного агара к 500 см 3 печеночного настоя, приготовленного по п. 2.1.2.7, добавляют 500 см 3 водопроводной воды, 10 г сухого пептона, 5 г хлористого натрия

и 25 г агара. Устанавливают pH 7,4 и варят до растворения агара. Затем автоклавируют при 115°С в течение 20 мин, отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой). Устанавливают pH 7,1—7,2. Разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют при 115°С в течение 20 мин.

2.1.2.10. Для приготовления мазков из патологического материала требуются чистые обезжиренные предметные стекла. Абортированный плод вскрывают, поверхность паренхиматозных органов стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая тампоном, смоченным в спирте. Затем вырезают стерильными ножницами кусочки размером 1,5×1,0X1,5 см 3 и прикладывают поверхностями срезов к предметному стеклу по три отпечатка на двух предметных стеклах. В таком же порядке готовят мазки нз котиледонов последа, лимфатических узлов и другого материала. Содержимое желудка плода и другой жидкий материал набирают пастеровской пипеткой и также готовят мазки. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки. Один мазок из каждого объекта окрашивают по Козловскому или Stamp, другой — по Граму. Мазки микроскопируют.

2.1.2.11. Для окраски мазков по Граму на фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают карболовый генциан фиолетовый на 2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску и промывают водой, наливают на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают, наливают этиловый спирт на 0,5—1 мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным 1:10 фуксином Циля в течение 1—2 мин. Краску сливают, промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

2.1.2.12. Для окраски мазков по Козловскому фиксированный мазок окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина с подогреванием до появления пузырьков. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают 0,75—1%-ным водным раствором малахитовой зелени в течение 0,5—1 мин. Краску сливают, промывают водой, просушивают мазок фильтровальной бумагой.

2.1.2.13. Для окраски мазков по Stamp фиксированный мазок скрашивают в течение 10 мин раствором карболового фуксина Циля в разведении 1:10. Затем мазок промывают водой и дифференцируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают и докрашивают 1%-ным раствором метиленового синего в течение 20—30 с. Краску сливают, промывают водой, подсушивают мазок фильтровальной бумагой.

2.1.2.14. Для проведения посева из патологического материала кожу абортированного плода обжигают с поверхности по белой линии тампонами, смоченными спиртом, стерильными ножницами вскрывают брюшину и грудную клетку и пипеткой Пастера высе-

вают жидкое содержимое грудной, брюшной полостей и желудка плода, а также вырезают кусочки печени и селезенки размером не менее 2,0Х1,5Х2,5 см. Каждую пробу погружают в спирт и обжигают с поверхности, а затем помещают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан добавляют стерильный физиологический раствор в количестве, равном массе жидкой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Взвесь пипеткой Пастера по 0,1—0,2 см 3 втирают в поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается предварительный высев материала в жидкие питательные среды (в пробирках).

При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы путем внесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках.

Из плодовой оболочки, плаценты вырезают кусочки менее загрязненный и без некротических участков, обрабатывают стерильным физиологическим раствором, подсушивают стерильным тампоном, обжигают на пламени и готовят из этого материала суспензию в электрическом гомогенизаторе. Суспензию засевают на чашки Петри со средой, содержащей препараты, задерживающие рост посторонней микрофлоры: генцианвиолет 1 :2000 000 или кристаллический фиолетовый 1 : 100 000, уксуснокислый натрий из расчета 0,125 мг на 1 см 3 или паранитрофенилглицерин (0,005— 0,007%).

2.1.2.15. Для выращивания посевы помещают в термостат при температуре 37—38°С. При исследовании материала от крупного рогатого скота и баранов половину засеянных пробирок и чашек помещают в эксикатор с содержанием 10—20% С0₂ и выдерживают их в термостате при 37—38°С. Через каждые 3—4 сут пробирки с посевами просматривают визуально, при необходимости через лупу или под малым увеличением микроскопа в отношении роста бруцелл. При отсутствии роста бруцелл все посевы выдерживают в термостате до 20 сут.

2.1.3. Проведение исследования

2.1.3.1. Бруцелл обнаруживают тремя методами исследований: бактериоскопией мазков из патологического материала; получением культуры бруцелл на питательных средах и постановкой биологической пробы на морских свинках.

2.1.3.2. При бактериоскопии мазков из патологического материала, приготовленных по п. 2.1.2.10, обращают внимание на форму, размеры и расположение отдельных микробов и способность к элективным окраскам. Характерный вид бруцелл — мелких грамотрицательных, отдельно расположенных, не образующих спор кокко-бактсрий, окрашивающихся по Козловскому или Stamp в красный цвет, дает основание к предварительному заключению об обнаружении возбудителя бруцеллеза или инфекционного эпи-

дидимита, которое требует подтверждение выделением чистой культуры или положительной биопробой.

2.1.3.3. При осмотре посевов, проведенных по п. 2.1.2.14, обращают внимание на характер роста микробов. В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение, а в дальнейшем пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

Из бульонной культуры делают посев в пробирку с плотной средой и готовят мазки. При микроскопировании препарата обнаруживают характерные для бруцелл кокко-бактерии.

На поверхности плотных питательных сред бруцеллы образуют прозрачные, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок. С возрастом колонии приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

Подозрительные колонии пересевают на скошенный агар в пробирках и двухсуточные культуры идентифицируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму, Козловскому или Stamp, агглютинации на предметном стекле с помощью набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл. В набор компонентов входят: R—сыворотка агглютинирующая бруцеллезная; S—сыворотка агглютинирующая бруцеллезная; R—антиген бруцеллезный цветной; антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы (РБП).

Для проведения пластинчатой реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл R и S—сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным карболизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке. Разведенные сыворотки можно использовать в течение месяца. R—антиген бруцеллезный цветной и антиген бруцеллезный для РБП в пластинчатой РА применяют неразведенными.

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R и S—сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру эмульгируют в каплях R и S— сывороток и в капле физиологического раствора. Параллельно в каждом опыте ставят контроль: R—сыворотки в рабочем разведении с антигенами цветными и для роз бенгал пробы;

S—сыворотки в рабочем разведении с цветным бруцеллезным антигеном и с антигеном для РБП.

При положительной РА в течение 1—3 мин в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе (контрольном) наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

Следует учитывать, что реакция с R—сывороткой бруцеллезной проходит замедленно, агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты дифференциации испытуемых культур считают достоверными, если в контролях R и S—бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами наблюдается четко выраженная агглютинация и отсутствует с гетерологичными. Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии 50—100%-ной агглютинации.

При отрицательной реакции агглютинации с культурой из одной колонии дополнительно исследуют еще не менее трех-четырех подозрительных колоний.

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов постоянно агглютинируется только R—бруцеллезной сывороткой.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с S или R—бруцеллезными сыворотками одновременно или с одной из них в отдельности при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе относят к бруцеллам.

2.1.3.4. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.

Заражение морских свинок (не менее двух), предварительно проверенных на бруцеллез исследованием сыворотки их крови в реакции агглютинации, проводят подкожно в области паха в дозе 1 см 3 .

Через 15—30 сут у свинок берут кровь и сыворотку, исследуют на бруцеллез в реакции агглютинации в разведениях 1 : 10—1 :80.

При положительной РА морских свинок убивают, отмечают па-тологоанатомические изменения в селезенке, печени и лимфатических узлах и при необходимости исследуют их бактериологочес-ки. При отрицательной РА свинку выдерживают до 60 сут, а затем исслстуют серологически и бактериологически.

2.1.4.1. Заболевание бруцеллезом или инфекционным эпидиди-митом считают установленным при выделении культуры возбудителя из исследуемого материала или от морской свинки (биопроба), а также при получении у свинки положительной РА 1:10 и выше.

2.1.4.2. При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах биологического исследования и биопробы материал считают подозрительным в заражении бруцеллами и проводят серологическое и аллергическое исследования животных данной группы.

2.2. Метод серологического исследования

Сущность метода заключается в выявлении в сыворотке крови

животного специфических антител к бруцеллезному или овисно-му антигенам.

роз бенгал проба (РБП) rose Bengal test, реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК) или реакция длительного связывания комплемента (РДСК).

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Баня водяная с терморегулятором.

Комплект инструментов и приспособлений для проведения серологических исследований на бруцеллез крови животных (КИ).

Пластины с лунками полистироловые.

Фильтр Зейтца, пластины стерилизующие.

Стекла предметные чистые по ГОСТ 9284.

Пробирки серологические по ГОСТ 25336.

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см 3 по ГОСТ 20292.

Кислота карболовая кристаллическая.

Антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК.

Антиген бруцеллезный цветной для роз бенгал пробы (РБП).

Набор специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой бруцеллой овис (антиген овисный для РДСК, позитивная овисная и негативные сыворотки).

Сыворотка бруцеллезная позитивная.

Сыворотка овисная позитивная .

Гемолизин (гемолитическая сыворотка) по ГОСТ 16445.

Комплемент сухой, консервированный или нативный по ГОСТ 16446.

Бруцеллезные антигены для реакции агглютинации (РА), роз бенгал пробы (РБП), реакции связывания комплемента (РСК) или реакции длительного связывания комплемента (РДСК) готовят из штаммов Brucella abortus. Антиген овисный для РДСК из штаммов Brucella ovis.

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory Diagnostics of Brucellosis. Bacteriological methods

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2015 г. N 1949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33675-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает бактериологические методы лабораторной диагностики бруцеллеза.

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Brucella .

2 Бактерии рода Brucella относятся ко II группе патогенности.

Настоящий стандарт также устанавливает общие требования к проведению молекулярно-генетических методов диагностики бруцеллеза (ПЦР).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 3-88 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 2222-95 Метанол технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4159-79 Йод кристаллический. Технические условия

ГОСТ 4232-74 Калий йодистый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7864-2011 Иглы инъекционные однократного применения стерильные

ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16280-2002 Агар пищевой. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 22280-76 Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 32275-2013 Перчатки медицинские анатомические одноразовые. Технические требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.2 антиген бруцеллезный: Поверхностные или цитоплазматические полисахаридно-белковые структуры бруцелл, на которые животными вырабатываются специфические антитела.

3.1.3 реакция агглютинации: Метод выявления специфических агглютинирующих антител в сыворотке крови животных.

3.1.4 биовар: Внутривидовая систематическая категория для обозначения штамма или совокупности штаммов бактерий со сходными ферментативными или антигенными свойствами, отличающимися от других вариантов этого вида.

3.1.5 антитела бруцеллезные (иммуноглобулины, ИГ, lg ): Особый класс гликопротеинов в сыворотке крови и тканевой жидкости животных в виде растворимых молекул, присутствующих на поверхности В-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и обладающих способностью избирательно связываться с антигенами конкретных бруцелл, обусловленной предварительным взаимодействием иммунной системы организма с возбудителем.

3.1.6 полимеразная цепная реакция (ПЦР): Молекулярно-генетический метод увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

3.1.7 стандарт мутности: Взвесь частиц стекла Pyrex в запаянной стеклянной пробирке, соответствующая 10 (5) международным единицам мутности.

Примечание — Стандарт мутности используют для визуального определения оптической концентрации бактериальных взвесей.

3.1.8 сыворотки монорецепторные A и M : Антивидовые бруцеллезные сыворотки крови кроликов к рецепторам культур Brucella abortus и Brucella melitensis .

Примечание — Монорецепторные сыворотки A и M используют для дифференциации культур бруцелл в пробирочной реакции агглютинации.

3.1.9 сыворотка S-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая S -бруцеллезные антитела.

Примечание — S -бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

3.1.10 сыворотка R -бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая R -бруцеллезные антитела.

Примечание — R -бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

3.1.11 бактериофаг: Ультрамикроскопический внутриклеточный вирус бактерии, заражающий бактериальную клетку, размножающийся в ней и часто вызывающий ее лизис.

3.1.12 корпускула бактериофага: Частица бактериофага, имеющая форму сперматозоида, состоящая из белковой оболочки и внутриклеточного содержимого, представляющего собой фибриллы дезоксирибонуклеиновой кислоты.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

МППГГА — мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар;

МППГГБ — мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый бульон;

МППБ — мясо-пептонный печеночный бульон;

РА — реакция агглютинации;

ПЦР — полимеразная цепная реакция.

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Требования к лабораториям, проводящим работы по диагностике бруцеллеза, регламентируются нормативными и правовыми актами государства, принявшего стандарт.

4.1.2 Требования к персоналу — по ГОСТ ИСО/МЭК 17025.

4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, вакцинированные против бруцеллеза вакцинами, зарегистрированными на территории государства, принявшего стандарт, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности и владеющие методами бактериологических исследований.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с биологическими объектами должны отвечать положениям ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.4. Обеззараживание биологического материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 0,20 МПа и температуре (132±2)°С.

CO -инкубатор или эксикатор стеклянный (микроанаэростат) с содержанием углекислого газа от 10% до 15%.

Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317.

Баня водяная с терморегулятором.

5.2 Питательные среды и реактивы

Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16280.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Акрифлавин.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Глицерин по ГОСТ 6259.

Глюкоза по ГОСТ 975.

Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Кислота борная по ГОСТ 9656 или ГОСТ 18704.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Кристаллический фиолетовый (генцианвиолет) по ГОСТ 4919.1.

Малахитовый зеленый по ГОСТ 4919.1.

Метанол технический по ГОСТ 2222.

Метиленовый синий по ГОСТ 4919.1.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.

Раствор антисептический.

Раствор натрия хлорида 0,9%-ный изотонический (физиологический раствор).

Физиологический раствор фенолизированный 0,5%-ный.

Сафранин, 2%-ный водный раствор по ГОСТ 4919.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Стандарт мутности оптический, эквивалентный 10 международным единицам.

Тиаминобромид.

Тионин.

Фенол по ГОСТ 23519.

Фуксин основной.

5.3 Посуда

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 29230.

Пипетки Мора вместимостью 100 см .

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пробирки серологические Флоринского по ГОСТ 25336.

Пипетки пастеровские.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

Чашки бактериологические одноразового использования или стеклянные по ГОСТ 25336.

5.5 Допускается применение других средств измерений и посуды с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше.

5.6 Допускается применение готовых питательных сред, а также других сред, приготовленных по прописи производителя, предназначенных для культивирования бруцелл с проверенными ростовыми свойствами.

5.7 Допускается применение готовых растворов генциан фиолетового, Люголя, фуксина Циля, малахитового зеленого и 5%-ной спиртовой настойки йода.

5.8 Допускается использовать другие селективные добавки, обладающие аналогичным действием, указанным в 5.4.

5.9 Допускается использовать посуду одноразового применения.

6.1.1 Материал для диагностики бруцеллеза отбирают от каждого животного в отдельности.

6.1.2 При взятии проб необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды в соответствии с требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

6.1.3 Пробы направляют в лабораторию и исследуют в день отбора или на следующий день.

6.2 Отбор проб патологического материала

6.2.1 Для бактериологического и молекулярно-генетического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от многоплодных животных берут не менее трех плодов). От плодов крупных животных направляют селезенку, печень, желудок с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

6.2.2 Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в четыре-пять раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

6.2.3 От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для молекулярно-генетического исследования на бруцеллез.

6.3 Отбор проб для прижизненной диагностики бруцеллеза

6.3.1 Общие требования

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут:

— кровь;

— молоко;

— содержимое гигром, бурс и абсцессов.

При диагностическом убое дополнительно берут:

— селезенку;

— печень;

— лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые;

— семенники.

6.3.2.2 Приготовление сыворотки

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при температуре 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают в холодильнике при температуре 4°С-10°С. Через 20-24 ч полученные сыворотки сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию.

6.3.2.3 Пробы крови от животных для бактериологического исследования берут стерильными шприцами в объеме 18-20 см , в которые предварительно набирают антикоагулянтное средство (глюгицир или аналогичное). Сразу после взятия крови иглы, не отсоединяя от шприцев, закрывают колпачками и перемешивают содержимое, переворачивая шприцы. Перед посевом использованные иглы заменяют стерильными.

6.3.5 Упаковка и маркировка проб

6.3.5.1 Отобранные в стерильные пробирки пробы крови и молока помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

Пробы патологического материала упаковывают в пергаментную бумагу, маркируют и помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

6.3.5.2 Пробы маркируют с указанием:

— наименования хозяйства;

— вида, пола и возраста животного;

— инвентарного номера животного;

— наименования пробы;

— цели и вида исследования.

7.1 Сущность метода

Сущность бактериоскопического метода заключается в окрашивании мазков и мазков-отпечатков из патологического материала и последующем микроскопическом выявлении клеток бруцелл.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка растворов для окраски

7.2.1.1 Приготовление кристаллического фиолетового и генцианового фиолетового

Берут 1 г кристаллического фиолетового или генцианового фиолетового и растирают в ступке с 2 г фенола, добавляя небольшими порциями 96%-ный этиловый спирт в объеме 10 см . После полного растворения краски в ступку при постоянном помешивании добавляют 100 см дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см .

Срок хранения растворов при температуре от 2°С до 10°С — не более 6 мес.

7.2.1.2 Приготовление раствора Люголя

Для приготовления раствора Люголя в 10 см дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают в течение 5-6 ч до полного растворения йода и добавляют 290 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2°С до 10°С в склянке из темного стекла — не более 30 сут.

7.2.1.3 Приготовление карболового фуксина Циля

Для приготовления карболового фуксина Циля 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллического фенола и 0,5 см глицерина, добавляя небольшими порциями 96%-ный этиловый спирт в объеме 10 см , а затем при постоянном помешивании в ступку добавляют 100 см дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см .

Срок хранения раствора при температуре 18°С-22°С во флаконах из темного стекла с притертой пробкой — не более 6 мес.

Непосредственно перед работой к одной части полученного раствора карболового фуксина Циля добавляют девять частей дистиллированной воды.

7.2.1.5 Приготовление 0,5%-ного раствора уксусной кислоты

Берут 0,5 см уксусной кислоты и добавляют 99,5 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2°С до 8°С — не более 1 мес.

7.2.1.8 Приготовление 5%-ного спиртового раствора йода

Берут 5 г кристаллического йода и переносят в мерную колбу вместимостью 250 см , добавляют 10 г калия иодида и равные объемы дистиллированной воды и 96%-ного этилового спирта, доводя раствор до объема 100 см .

Срок хранения раствора при температуре не выше от 2°С до 25°С в склянке из темного стекла — не более пяти лет.

7.2.1.9 Приготовление 3%-ного спиртового раствора гидроокиси калия

Берут 3 г гидроокиси калия, растворяют в 5 см дистиллированной воды и в мерной колбе вместимостью 200 см доводят объем раствора 96%-ным этиловым спиртом до 100 см . Декантируют прозрачный раствор.

Срок хранения раствора при температуре не выше 25°С не более одного года.

7.2.2.1 Из проб патологического материала по 6.2 делают по два мазка. При исследовании абортированных плодов готовят мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (печени, селезенки), котиледонов плодовых оболочек и другого плотного материала, а жидкий материал (содержимое желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, околоплодную жидкость) наносят на предметные стекла пастеровской пипеткой.

7.3 Проведение исследования

7.3.1 Окрашивание по Граму

Для окраски мазков по Граму на фиксированный мазок по 7.2.2 кладут кусочек фильтровальной бумаги, наносят кристаллический фиолетовый или генциан фиолетовый и выдерживают в течение 2 мин, после чего снимают бумагу, сливают краску, промывают дистиллированной водой и наносят на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1-2 мин раствор сливают и наносят 96%-ный этиловый спирт на 0,5-1,0 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают разведенным в соотношении 1:10 фуксином Циля в течение 1-2 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

Если после нанесения раствора Люголя мазок не чернеет, то необходимо приготовить новый раствор.

7.3.2 Окрашивание по Козловскому

Для окраски по Козловскому фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина с подогреванием на водяной бане до появления пузырьков. Мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают 0,75%-ным или 1%-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 0,5-1,0 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.3 Окрашивание по Стампу

Для окраски по Стампу фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают в течение 10 мин карболовым фуксином Циля, разведенным по 7.2.1.3 в соотношении 1:10. Мазок промывают дистиллированной водой, а затем 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают 1%-ным раствором метиленового синего в течение 20-30 с. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.4 Полученные по 7.3.1-7.3.3 мазки микроскопируют под иммерсионным маслом.

7.4 Обработка результатов

При микроскопии окрашенных мазков, содержащих бруцеллы, должны наблюдаться мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашенные в красный цвет.

8.1 Сущность метода

Сущность культурального метода заключается в посеве патологического материала на питательные среды с последующим культивированием, идентификацией и дифференциацией выделенной культуры.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 дм водопроводной воды и выдерживают в течение 15-18 ч в прохладном месте. Затем сливают полученный настой в колбу вместимостью 2 дм или кастрюлю из нержавеющей стали вместимостью 3 дм и кипятят в течение 30-40 мин на электрической или газовой плите, доливают дистиллированную воду до объема 1 дм и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную мясную воду стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 мин.

Срок хранения мясной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5-15 дм при температуре от 2°С до 25°С — не более одного года.

8.2.2 Приготовление печеночной воды

Для приготовления печеночной воды свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм вносят 500 г фарша, заливают 1 дм водопроводной воды, настаивают в течение 1 ч и кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин. После отстаивания фарш удаляют, а полученную жидкость доводят до 1 дм дистиллированной водой и фильтруют через ватно-марлевый фильтр или тканевый фильтр. Полученную печеночную воду разливают по колбам и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин.

Срок хранения печеночной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5-15 дм при температуре от 2°С до 25°С — не более одного года.

8.2.3 Приготовление МППГГБ

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм наливают 610 см мясной воды по 8.2.1 и 305 см печеночной воды по 8.2.2, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 20-30 г пищевого или микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 30 мин, устанавливают рН 7,2-7,4 10%-ным раствором натрия гидроокиси, добавляют 10 г глюкозы и 20 см глицерина и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки по 7-8 см или во флаконы по 250-300 см соответствующей вместимости и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин. рН среды после стерилизации составляет 6,8-7,0.

Срок хранения МППГГБ в пробирках и флаконах при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

8.2.4 Приготовление МППГГА

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм наливают 610 см мясной воды по 8.2.1 и 305 см печеночной воды по 8.2.2, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 20-30 г микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 1 ч, устанавливают рН 7,2-7,4 10%-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют 10 г глюкозы и 20 см глицерина и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки или флаконы вместимостью 500 см и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин. рН среды после стерилизации составляет 6,8-7,0.

Срок хранения МППГГА в пробирках и флаконах при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

8.2.5 Приготовление МППБ

МППБ готовят аналогично МППГГА по 8.2.3 без добавления агара, глюкозы и глицерина.

Срок хранения МППБ при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

8.2.6 Приготовление сывороточно-декстрозного агара

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм наливают 835 см дистиллированной воды, добавляют 20 г пищевого или микробиологического агара, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 165 см мясной воды по 8.2.1. Полученную смесь кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин до расплавления агара, рН до стерилизации — 7,8. Затем стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 ч, затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят рН среды до 7,2-7,4 10%-ным раствором гидроокиси натрия, разливают в колбы (пробирки, флаконы) и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин. После стерилизации рН среды составляет 6,8 -7,0.

Срок хранения сывороточно-декстрозного агара при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

Перед применением среду в колбах (пробирках, флаконах) расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до температуры 50°С-60°С и добавляют 40%-ный стерильный раствор глюкозы в количестве 1% к объему питательной среды во флаконе (например, 2,5 см 40%-ного стерильного раствора глюкозы добавляют к 97,5 см питательной среды).

8.2.7 Приготовление селективной добавки для внесения в питательные среды

Содержимое флакона по 5.4 растворяют в 5 см 50%-ного метилового спирта и перемешивают до образования гомогенной суспензии.

Раствор используют свежеприготовленным.

Полученное количество селективной добавки стерильно добавляют к 500 см расплавленной питательной среды.

8.3 Проведение исследования

8.3.1 Перед посевом материала кожу абортированного плода по белой линии живота протирают тампоном, смоченным 5%-ным раствором фенола, приготовленного путем растворения 5 г кристаллического фенола в 100 см дистиллированной воды. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей пастеровскими пипетками высевают в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь переносят в объеме по 1,0-1,5 см на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в двух пробирках. Содержимое желудка в объеме по 1-2 см высевают в две пробирки с МППГББ и в пять пробирок на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6.

8.3.2 Лимфатические узлы, очищенные от жира и мышечных волокон, кусочки печени и селезенки размером 2,0 1,5 2,5 см погружают в 96%-ный этиловый спирт на 1 с и обжигают, проведя над пламенем спиртовки. После обработки от лимфоузлов стерильными ножницами отрезают кусочки размером 1-2 см. Подготовленный материал помещают в пакет для гомогенезации с фильтром, добавляют 4-5 см физиологического раствора и гомогенезируют с использованием гомогенизатора по 5.1.

Допускается приготовление суспензии путем растирания материала в стерильной фарфоровой ступке с добавлением физиологического раствора до получения однородной гомогенной суспензии.

Полученный гомогенат высевают пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 см на поверхность предварительно подсушенных после скашивания плотных питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 в пробирках и на чашки Петри.

Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из лимфатических узлов и органов. Для этого место прокола пастеровской пипеткой предварительно прижигают шпателем, нагретым над пламенем спиртовки. Из каждого объекта проводят посев в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь в объеме по 1,0-1,5 см переносят на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в две пробирки.

8.3.3 Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем в десять пробирок на среды по 8.2.4-8.2.6.

8.3.4 При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

8.3.6 Содержимое бурс, гигром и абсцессов высевают на три-четыре чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6, содержащей бактериостатические красители. Во всех случаях вместо бактериостатических красителей допускается применение селективных добавок.

8.3.8 Для выделения культуры бруцелл, в том числе и Brucella canis , кровь от животных с антикоагулянтом вносят по 10-18 см во флаконы, содержащие по 100 см МППГГБ, и по 0,3-0,5 см в чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. Посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды. Через 25-30 мин чашки Петри помещают в термостат при температуре 37°С-38°С агаром вверх. Туда же помещают и флаконы с посевами.

Через семь суток инкубирования из посевов во флаконах делают пересев на три пробирки с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6 и инкубируют при тех же условиях.

8.3.9 При исследовании материала от крупного рогатого скота половину пробирок и чашек Петри культивируют в термостате при температуре 37°С-38°С, другую — в CO -инкубаторе с содержанием 5%-10% углекислого газа или эксикаторе (микроанаэростате).

Примечание — Допускается культивирование в пробирках, которые плотно укупоривают резиновыми пробками и заливают парафином или обертывают ватно-марлевые пробки парафильмом.

8.3.10 Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 см 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 см концентрированной соляной кислоты на 1 дм объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

8.3.11 Посевы, полученные по 8.3.1-8.3.9, выдерживают в термостате при температуре 37°С-38°С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 48-72 ч. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

В последующем посевы просматривают каждые 4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

8.4.1 При просмотре посевов обращают внимание на характер роста бактерий.

8.4.2 На поверхности твердых питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью бесцветные колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. При длительном культивировании колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

8.4.3 В жидких питательных средах по 8.2.1, 8.2.3 и 8.2.5 бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над поверхностью бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

8.4.4 При обнаружении роста на жидких питательных средах и отсутствии характерного роста на твердых питательных средах из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из методов по 7.3.1-7.3.2, и делают пересев на чашки Петри с твердой питательной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках Петри культивируют так же, как и высевы из патологического материала. При отсутствии роста культуры бруцелл наблюдение за посевами прекращают по истечении 30 сут.

9.1 Пластинчатая реакция агглютинация

9.1.1 Подготовка к исследованию

9.1.1.1 Подготовка двухсуточных культур бруцелл

Для идентификации используют двухсуточные агаровые культуры (изоляты) бруцелл, выделенные из патологического материала. С этой целью выделенные культуры пересевают бактериологической петлей штрихом на поверхность плотной питательной среды по 8.2.4, 8.2.6, скошенной в пробирках. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С-38°С в течение двух суток. Выращенные культуры исследуют непосредственно после извлечения из термостата.

Примечание — Допустимый срок хранения культур при температуре от 2°С до 8°С — не более 14 сут.

9.1.1.2 Подготовка R — и S -бруцеллезных агглютинирующих сывороток

R — и S -бруцеллезные агглютинирующие сыворотки разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения. Разведенные сыворотки хранят при температуре от 2°С до 8°С и используют в течение 30 сут.

9.1.2 Проведение исследования

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R — и S -бруцеллезных сывороток по 9.1.1 и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно перемешивают в капле S -, R -бруцеллезной сыворотки и физиологического раствора. Параллельно ставят контроли: со стандартными S — и R -бруцеллезными сыворотками и гомологичными антигенами.

9.1.3 Учет и оценка результатов реакции агглютинации

При положительной РА в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

Реакцию учитывают визуально в течение 1-3 мин и оценивают в крестах:

— «++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

— «+++» (три креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

— «++» (два креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

— «+» (один крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— «-» (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R — и S -бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем на два креста, а с физиологическим раствором — отсутствует.

9.1.4 Обработка результатов

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными (см. раздел 8) и тинкториальными свойствами (см. раздел 7), а также дающие положительную реакцию агглютинации с S — или R -бруцеллезной сывороткой или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, считают бруцеллами.

9.2 Методы определения диссоциации культур бруцелл

9.2.1 Проба на стекле с раствором акрифлавина

На предметное стекло наносят каплю раствора акрифлавина в разведении 1:1000 в дистиллированной воде, в которой суспензируют с помощью бактериологической петли испытуемую культуру. У диссоциированных культур ( R -форма) в течение 1-2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культур бруцелл в S -форме остается гомогенной.

9.2.2 Реакция термоагглютинации

Взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с содержанием по оптическому стандарту мутности 1 млрд/см микробных клеток в объеме 4-5 см прогревают в пробирке вместимостью 20 см на водяной бане при температуре 90°С в течение 30 мин.

Результаты учитывают через 30 мин, 1 ч и через 24 ч при комнатной температуре.

При наличии диссоциации наступает выраженная агглютинация клеток бруцелл с формированием осадка, тогда как суспензия недиссоциированной культуры бруцелл в S -форме остается гомогенной.

9.2.3 Окраска колоний по Уайт-Вилсону

Двухсуточную агаровую культуру бруцелл по 9.1.1 разводят физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы она по мутности соответствовала 10 ЕД оптического стандарта мутности. Полученную суспензию в объеме 3 см смешивают с 2 см физиологического раствора и делают десятикратные разведения до 10 , используя для каждого разведения отдельную пипетку, и высевают по 0,1 см на четыре-шесть чашек Петри с МППГГА. Поверхность агара в чашках равномерно орошают посевным материалом, выдерживают на горизонтальной поверхности стола в течение 20-30 мин и инкубируют при температуре 37°С-38°С агаром вверх в течение 4-5 сут.

Окраску колоний проводят рабочим раствором кристаллического фиолетового, приготовленного по 7.2.1.1 в разведении 1:2000. В чашку Петри с изолированными колониями бруцелл пастеровской пипеткой с грушей вносят осторожно без напора рабочий раствор кристалвиолета. Через 30 с раствор краски удаляют с помощью пипетки с грушей, сливая в дезинфицирующую жидкость (3%-ный раствор фенола или 5%-ный раствор хлорамина). Колонии просматривают под бинокулярной лупой.

Колонии бруцелл в R -форме (диссоциированные) имеют равномерно окрашенный широкий периферический ободок синего или фиолетового цвета и менее интенсивно окрашенную поверхность такого же цвета, иногда с исчерченностью.

Колонии бруцелл в S -форме имеют тонкий периферический ободок, окрашенный в синий или фиолетовый цвет. Центральная часть колоний светло-желтого цвета (не окрашивается).

9.3.1.1 Подготовка к исследованию

В качестве реактива применяют насыщенный водный раствор уксуснокислого свинца (30 г свинца растворяют в 100 см дистиллированной воды), которым пропитывают полоски фильтровальной бумаги размером 1 8 см. Пропитанные полоски фильтровальной бумаги высушивают при температуре 18°С-20°С в течение 20 мин.

Срок хранения пропитанных полосок фильтровальной бумаги в банке из темного стекла с притертой пробкой — не более 2 мес.

9.3.1.2 Проведение исследования

Двухсуточную взвесь культуры бруцелл по 9.1.1 в физиологическом растворе концентрацией 2 10 /см микробных клеток по оптическому стандарту мутности на 10 ЕД засевают в пробирку бактериологической петлей на скошенную поверхность печеночного агара по 8.2.4. Полоску фильтровальной бумаги зажимают между пробиркой и ватной пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался поверхности питательной среды.

Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.

Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 6 сут.

9.3.1.3 Учет результатов

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего конца полоски, которое измеряют в миллиметрах.

Результаты учитывают через каждые 2 сут в течение 6 сут. При каждом учете тест-полоску заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода полученные три значения суммируют.

Суммарное значение почернения тест-полосок, свидетельствующее о продуцировании сероводорода, составляет для культур:

— B. suis (биовар 1) — 12-20 мм;

— B. abortus (биовар 1) — 5-7 мм;

— B. neotomae — 5-8 мм.

Культура B. melitensis (биовар 1), как правило, не образует сероводорода или вызывает только слабо выраженное почернение тест-полоски. Культуры B. ovis и B. canis сероводород не продуцируют.

9.3.2 Определение редуцирующей активности в отношении красок

9.3.2.1 Подготовка к исследованию

Для приготовления исходных растворов фуксина и тионина в разведении 1:1000 во флаконах вместимостью 200 см смешивают 0,1 г краски, 20 см 96%-ного этилового спирта и 80 см дистиллированной воды.

Срок хранения исходных растворов фуксина и тионина в темном месте — не более 6-10 мес.

Для приготовления питательной среды МППГГА с красками к 100 см охлажденного до температуры 50°С-60°С агара с соблюдением правил асептики добавляют 2 см исходного раствора краски для получения разведения 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20-25 см в чашки Петри и подсушивают при комнатной температуре, не открывая чашки.

Срок хранения среды с красками в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С — не более 10-15 сут.

Обесцвеченные среды для тестирования не используют.

9.3.2.2 Проведение исследования

Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы испытуемых культур проводят бактериологической петлей из взвеси, содержащей 2 млрд/см микробных клеток, на среду МППГГА с фуксином и тионином по 9.4.2.1 и на среду МППГГА без добавления красок (контроль). Одну петлю взвеси засевают путем нанесения пяти отдельных штрихов на поверхность агара. На одну чашку Петри можно одновременно засевать четыре-шесть культур, предварительно разделив чашку Петри на четыре-шесть секторов.

Чашки с посевами переворачивают агаром вверх и выдерживают в термостате при температуре 37°С-38°С в течение 3 сут.

9.3.2.3 Учет результатов

Учет результатов проводят через трое суток инкубации по следующей схеме:

— выраженный рост культуры во всех штрихах «++++»;

— выраженный рост в первых двух и более слабый в последующих штрихах «+++»;

— умеренно выраженный рост в первых двух штрихах и слабый или отсутствие роста в остальных штрихах «++»;

— слабый сплошной рост или отдельные колонии в первых двух штрихах «+».

9.3.3 Реакция агглютинации с монорецепторными A и M бруцеллезными сыворотками

9.3.3.1 Проведение испытания

Для проведения РА монорецепторные A и M бруцеллезные сыворотки разводят последовательно двукратно, получая соотношения 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80 в объеме 0,5 см . В качестве антигена используют взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе в концентрации 2 млрд/см микробных клеток по оптическому стандарту мутности.

Антиген добавляют по 0,5 см во все пробирки таким образом, разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).

Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-8 ч, а затем в течение 1 ч при комнатной температуре.

9.3.3.2 Учет результатов

Положительная РА в разведении сыворотки 1:20 с оценкой не менее чем на два креста позволяет отнести культуру бруцеллы к виду B. abortus или B. melitensis .

9.3.4 Определение чувствительности культур бруцелл к фагу Tb

Бруцеллезный фаг Tb избирательно лизирует бруцеллы вида B. abortus , находящиеся в S -форме.

9.3.4.1 Подготовка к исследованию

Для определения чувствительности бруцелл к лизису бактериофагом используют два его разведения: 1 10 корпускул/см и 1 10 корпускул/см . Разведения бактериофага готовят путем десятикратных разведений исходной культуры в физиологическом растворе.

9.3.4.2 Проведение исследования

Для исследования используют МППГГА в чашках Петри с концентрацией агара 1,5%-1,8%. Среду и взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с концентрацией 1 млрд/см микробных клеток по ОСО мутности на 10Е подсушивают при комнатной температуре в течение 18-20 ч.

Взвесь культуры бруцелл подсушивают при комнатной температуре в течение 18- 20 ч в объеме 0,4-0,5 см наносят на поверхность МППГГА в чашках Петри и тщательно распределяют по его поверхности. Избыток посевного материала удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки Петри подсушивают в течение 1 ч при температуре 37°С-38°С до полного впитывания в агар посевного материала. После чего на поверхность питательной среды в два разных места наносят пастеровской пипеткой по одной капле 0,05 см бактериофага каждого разведения. Чашки наклоняют, чтобы капли бактериофага стекли по поверхности питательной среды двумя дорожками. Контролем являются посевы культуры бруцелл на среде без внесения бактериофага. Посевы помещают в термостат агаром вверх и инкубируют в течение четырех-пяти суток при температуре 37°С-38°С.

9.3.4.3 Учет результатов

Результаты исследования учитывают в крестах:

— полный лизис культуры на месте нанесения фага (или линии стекания) «++++»;

— лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки (участок лизиса) в виде сот «+++»;

— резко ослабленный рост культуры бруцелл и небольшое количество бляшек «++»;

— очень слабый лизис культуры бруцелл «+»;

— отсутствие лизиса культуры бруцелл «-«.

За положительный результат чувствительности к лизису фагом принимают лизис культуры бруцелл не менее чем на два креста.

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella приведены в приложении А.

10.1 Подготовка к исследованию

Для постановки биологической пробы используют морских свинок (не менее двух животных), не реагирующих на бруцеллез при серологическом исследовании в пробирочной РА. Пробы сыворотки крови от животных в разведении 1:5 не должны агглютинировать S -бруцеллезный антиген.

10.2 Проведение исследования

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 см .

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в фарфоровой ступке со стерильным песком или гомогенизируют и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке подкожно в объеме 1 см .

Содержимое гигром, бурс вводят морским свинкам подкожно в объеме 0,2-0,3 см . При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2-3 см материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

Через 15, 25 и 40 сут после заражения у морских свинок берут кровь в объеме 1-2 см из ушной вены путем надреза или из сердца путем пункции и готовят сыворотку, которую исследуют в РА в пробирках в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически (раздел 8). Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку с бульоном и две пробирки с агаром из паховых, подчелюстных, заглоточных, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (два высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют по 8.3.8.

10.3 Учет результатов

При отрицательной РА у морских свинок биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бактериологическое исследование не проводят.

При выделении культуры бруцелл на питательных средах биологическое исследование прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают.

Результат исследования на бруцеллез считают положительным при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, даже если из исходного материала культура бруцелл не выделена.

11.1 Молекулярно-генетическое исследование на бруцеллез проводят в полимеразной цепной реакции (ПЦР), руководствуясь инструкциями по применению конкретных тест-систем.

11.2 Молекулярно-генетическое исследование методом ПЦР проводят в случае аборта и (или) при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и (или) сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами из хозяйств, благополучных по данному заболеванию и для идентификации культур бруцелл (изолятов), выделенных при исследовании патологического материала.

11.3 Для исследования в ПЦР используют тот же патологический материал, что и для бактериологической диагностики.

________________
* В бумажном оригинале слово «Brucella» в наименовании приложения А выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.

А.1 Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella приведены в таблице А.1.

Таблица А.1

источник