Набор для диагностики бруцеллеза животных в реакции иммунодиффузии
НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ инструкция по применению
НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Набор предназначен для исследования 50 проб сыворотки крови собак в реакции агглютинации (РА) и реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД).
— антиген R-бруцеллезный для РА — гомогенная взвесь бруцелл в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, инактивированных нагреванием и фенолом. Представляет собой жидкость непрозрачную, серо-белого цвета; при хранении допускается просветление жидкости с образованием осадка микробных клеток, который легко гомогенизируется при встряхивании.
— сыворотка R-бруцеллезная для РА — гипериммунная сыворотка крови кроликов, консервированная борной кислотой. Представляет собой жидкость светло-желтого цвета, прозрачную, слегка опалесцирующую.
— антиген R-бруцеллезный для РИД — ультразвуковой дезинтеграт бруцелл в фосфатно-буферном растворе, консервированный формалином. Представляет собой бесцветную жидкость, прозрачную, слегка опалесцирующую.
— сыворотка R-бруцеллезная для РИД — гипериммунная сыворотка крови кроликов, консервированная борной кислотой. Представляет собой жидкость светло-желтого цвета, прозрачную или слегка опалесцирующую.
— сыворотка негативная — сыворотка крови кроликов или крупного рогатого скота, консервированная борной кислотой. Представляет собой жидкость светло-желтого цвета, прозрачную или слегка опалесцирующую.
Вспомогательные вещества: натрия хлорид, агар.
Компоненты набора расфасованы в стеклянные флаконы вместимостью 10 и 20 мл, укупоренные резиновыми пробками, укрепленными металлическими колпачками: — антиген R-бруцеллезный для РА по 9 мл — 4 фл.; — сыворотка R-бруцеллезная для РА по 1 мл — 1 фл.; — антиген R-бруцеллезный для РИД по 3 мл — 1 фл.; — антиген R-бруцеллезный для РИД по 2.5 мл — 1 фл.; — сыворотка негативная по 6 мл — 1 фл.; — натрия хлорид по 12 г — 1 фл.; — агар по 12 г — 1 фл. На флаконы наклеены этикетки с указанием организации-производителя, наименования компонента, количества компонента во флаконе (мл, г), рабочего разведения антигена для РА, титра R — бруцеллезной сыворотки в РА, окончания срока годности (мес., год). Компоненты набора упакованы в картонные коробки с перегородками, обеспечивающими их целостность.
На коробки наклеены этикетки с указанием организации-производителя, ее товарного знака, адреса и телефона, наименований набора и входящих в него компонентов, количества (г), рабочего разведения антигена для РА, титра R-бруцеллезной сыворотки для РА, номера серии набора, даты изготовления (мес., год), срока годности (мес.), условий хранения, регистрационного номера, штрихового года (при наличии), знака соответствия, обозначения настоящего стандарта, надписи «Для животных». В каждую коробку вложена инструкция по применению набора.
Свидетельство о регистрации № ПВР-1-9.9/02606 от 30.08.10
Препарат для диагностики бруцеллеза собак.
R-бруцеллезные антигены для реакции агглютинации (РА) и реакции иммунодиффузии (РИД) взаимодействуют соответственно с бруцеллезными R-агглютининами и R-преципитинами, представленными иммуноглобулинами классов М и G и содержащимися в сыворотке крови собак, инфицированных культурами Вrucella canis, с формированием агглютината и преципитата.
Показания к применению препарата НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Исследование в РА и РИД сыворотки крови:
— всех племенных собак перед плановой вязкой;
— всех племенных собак с 2-месячного возраста, в течение не более 30 дней перед участием в выставках, продажей, ввозом и вывозом из страны;
— собак, контактировавших с больными бруцеллезом животными;
— собак с нарушением функции органов воспроизводства и опорно-двигательного аппарата;
— сук в случае аборта, рождения мертвого или нежизнеспособного приплода.
Получение сыворотки крови
Кровь по 7-10 мл берут у собак из поверхностных вен (головной предплечья или латеральной подколенной голени) стерильными инъекционными иглами без шприца в сухие стерильные пробирки. Пробирки с кровью нумеруют, составляют их опись и выдерживают при температуре 37-38°С в течение 30 мин или при комнатной температуре в течение 1.5-2 ч. Свернувшуюся кровь отделяют от стенок пробирки стальной спицей и выдерживают при 4-10°С в течение 3-4 ч. Сыворотку крови с эритроцитами сливают в сухие пробирки, выдерживают при 4-10°С в течение 10-12 ч, отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие пробирки.
При взятии крови необходимо соблюдать меры, предупреждающие возможную контаминацию бруцеллами объектов внешней среды.
Сыворотку крови исследуют в свежем виде или консервированную из расчета:
Не консервированная сыворотка пригодна для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии ее хранения при 4-10°С, консервированная — в течение 30 сут, замороженная — в течение 3 сут после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие и гемолизированные сыворотки исследованию не подлежат.
Постановка реакции агглютинации
Реакцию ставят в объеме 1.0 мл. Сыворотку крови собак исследуют в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400 (конечные разведения после внесения антигена). Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0.05 мл сыворотки в пробирки с 1.2 мл 0.5%-ного фенолизированного физиологического раствора (или 0.1 мл сыворотки + 2.4 мл физиологического раствора). Одновременно с испытуемыми сыворотками готовят аналогичные разведения R-бруцеллезной и негативной сыворотки. Для приготовления разведений сыворотки крови в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0.5 мл фенолизированного физиологического раствора. Из пробирок первого ряда по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:25 переносят в пробирки второго и третьего ряда. После пипетирования по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:50 из пробирок третьего ряда переносят в пробирки 4 ряда, после выполнения аналогичной операции по 0.5 мл сыворотки в разведении 1:100 из пробирок четвертого ряда переносят в пробирки 5 ряда. После пипетирования по 0.5 мл сыворотки из пробирок 5 ряда удаляют.
Антиген в рабочем разведении 1:10 в 0.5%-ном фенолизированном физиологическом растворе вносят во все пробирки с приготовленными разведениями сыворотки, за исключением пробирок первого ряда.
В отдельную пробирку вносят 0.5 мл физиологического раствора и 0.5 мл антигена в рабочем разведении (контроль антигена на спонтанную агглютинацию).
Штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов реакции и помещают в термостат при температуре 37-38°С на 16-18 ч, затем выдерживают при комнатной температуре 1 ч и проводят учет реакции.
Допускается постановка реакции в двух разведениях 1:50 и 1:100. При получении положительного результата в РА, проводят исследование таких сывороток в четырех разведениях 1:50,1:100,1:200 и 1:400. Одновременно в таких же разведениях ставят контроль с негативной и R-бруцеллезной сыворотками для РА, а также контроль антигена.
Результаты реакции агглютинации в каждой пробирке учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки и во взвеси после встряхивания пробирки. Следует учитывать, что агглютинат, сформировавшийся при взаимодействии R-бруцеллезного антигена с гомологичными антителами контрольной бруцеллезной сыворотки или сыворотки крови больного животного, легко разбивается при резком встряхивании пробирки с компонентами реакции. Поэтому, при учете результатов реакции в руку одновременно берут 2-4 пробирки и, слегка, постукивая по каждой из них пальцем другой руки, в области дна, поднимают агглютинат.
Реакцию оценивают в крестах:
++++ (4 креста) — полное просветление жидкости при наличии хорошо выраженного осадка в виде «зонтика» на дне пробирки. При легком встряхивании «зонтик» разбивается на крупные хлопья, жидкость остается прозрачной, 100%-ная агглютинация антигена;
+++ (3 креста) — полное просветление жидкости, «зонтик» на дне пробирки хорошо выражен. При встряхивании осадок разбивается на мелкие хлопья, жидкость слегка опалесцирует, 75%-ная агглютинация антигена;
++ (2 креста) — частичное просветление жидкости, «зонтик» выражен. При легком встряхивании «зонтик» разбивается на мелкие хлопья, со дна пробирки поднимается небольшое количество не связавшегося антигена. Жидкость опалесцирует, 50%-ная агглютинация антигена.
+ (1 крест) — частичное просветление жидкости, осадок в виде «зонтика» слабо выражен; при встряхивании жидкость остается мутной с небольшим количеством мелких хлопьев, 25%-ная агглютинация антигена;
— (минус) — отсутствие или частичное просветление жидкости. Осадок антигена в виде «зонтика» отсутствует или в небольшом количестве лежит на дне пробирки в виде «пуговицы». При встряхивании — поднимается в виде «косички», легко разбивается, образуя гомогенную взвесь, 0%-ная агглютинация антигена.
Постановка реакции иммунодиффузии
Приготовление 0.85%-ного раствора хлорида натрия.
Навеску хлорида натрия растворяют в необходимом количестве дистиллированной воды (например, 0.85 г хлорида натрия растворяют в 100 мл).
Приготовление 0.8%-ного раствора агара .
Навеску агара переносят в колбу с 0.85%-ным раствором хлорида натрия и помещают в кипящую водяную баню (например, 0.8 г агара вносят в колбу с 100 мл физиологического раствора). Расплавленный агар фильтруют через вату и разливают в чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность. В полистироловые для однократного применения чашки Петри диаметром 40 мм вносят по 3.0-3.5 мл, в аналогичные или стеклянные чашки Петри диаметром 90 мм — 20-25 мл. После затвердения геля, в нем с помощью штампа, которым комплектуется «Тест-система для диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД с О-ПС антигеном» (ООО НПЦ «Ветбиотест») или идентичного, пробивают лунки: центральную — диаметром 3 мм и 6 лунок по окружности — диаметром 5 мм. Агаровый гель из лунок удаляют с помощью препаровальной иглы или вакуумного (водоструйного) насоса.
Оставшийся агар хранят при температуре 2-10°С в течение 14 сут.
Пробы сыворотки крови от собак, предназначенные для исследования в РИД, отбирают, консервируют и хранят тем же способом и в тех же условиях, что для исследования в РА.
Для постановки реакции иммунодиффузии используют чашки Петри разного размера. Для исследования до 4 проб — диаметром 40 мм, для исследования 5-40 проб — диаметром 90 мм.
В центральную лунку геля агара вносят 20 мкл антигена, в периферические — по 40 мкл исследуемых проб сыворотки крови.
В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R-бруцеллезной сывороткой для РИД.
Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют 0.5%-ным фенолизированным физиологическим раствором. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при 18-24°С.
Учет результатов реакции проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя ОИ-19 или аналогичного через 24 и 48 ч после постановки реакции.
Линия преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшаяся через 24 или 48 ч, свидетельствует о положительной реакции.
Диагностическая оценка результатов исследования
При титре РА не ниже 1:100 с оценкой 2 креста и выше и (или) при положительной РИД собак считают больными бруцеллезом, вызываемым Вrucella canis.
При титре РА 1:50 с оценкой 2 креста и выше и отрицательной РИД собак считают сомнительно реагирующими на бруцеллез и исследуют повторно через 15 и 30 дней в РА и РИД с R-бруцеллезными антигенами.
В случае получения двух подряд сомнительных результатов в РА с интервалом не менее 30 дней при отрицательных результатах тестирования в РИД, заболевание животных бруцеллезом исключают.
При работе с Набором следует соблюдать правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с лекарственными средствами для животных.
Компоненты набора во флаконах без маркировки, с трещинами, нарушением укупорки, содержащие посторонние примеси, плесень и не разбивающиеся при встряхивании конгломераты, с истекшим сроком годности, подвергшиеся замораживанию выбраковывают, обеззараживают путем кипячения в течение 15 мин и утилизируют.
Условия хранения НАБОР КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК, ВЫЗЫВАЕМОГО BRUCELLA CANIS, В РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ И ИММУНОДИФФУЗИИ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ
Набор следует хранить в сухом, темном, недоступном для детей месте при температуре от 2° до 10°С.
источник
Бруцеллез (Brucellosis) Скляров О.Д. ФГУ «Всероссийский государственный бюджетный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и. — презентация
Презентация была опубликована 5 лет назад пользователемНина Сусарина
Презентация на тему: » Бруцеллез (Brucellosis) Скляров О.Д. ФГУ «Всероссийский государственный бюджетный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и.» — Транскрипт:
1 Бруцеллез (Brucellosis) Скляров О.Д. ФГУ «Всероссийский государственный бюджетный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») Тел. 8 (499)
2 ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
3 WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH and RUSSIA Название реакции/теста Международное / Русское Продолжительность постановки Оценка результата 1. Indirect ELISA Непрямой ИФА Подготовка плашек требует 18-часовой инкубации. Сама постановка – 6-7 ч. Предписанный для международной торговли подтверждающий тест. Но: при исследовании вакцинированного скота – более скрининговый, чем подтверждающий. 2. Competitive ELISA Конкурентный ИФА Инкубация плашек – 18 ч. Сама постановка – 6-7 ч. Предписанный для международной торговли подтверждающий тест. 3. Rose bengal test Роз бенгал тест Несколько мин.Предписанный для международной торговли скрининговый тест, как для благополучных, так и для неблагополучных стад. 4. Buffered plate agglutination test (PBAT) Реакция агглютинации на стекле с забуференным Аг Несколько мин.Предписанный для международной торговли скрининговый тест. 5. Complement fixation test (CFT) Реакция связывания комплемента 6-7 ч.Предписанный для международной торговли подтверждающий тест.
4 Название реакции/теста МеждународноеРусское Продолжительность постановки Оценка результата 6. Fluorescence polarization assay (FPA) Реакция поляризацонной флюоресценции Неск. минут.Как для скрининга, так и для подтверждения диагноза. В 2004 г. была предложена в качестве предписанного подтверждающего теста. 7. Milk iELISA ИФА с молоком 6-7 ч.Скрининговый. Особенно подходит для крупных стад. 8. Milk ring test (MRT) КР с молоком Чуть больше 1 чСкрининговый тест. Для небольших стад. 9. Serum agglutination test (SAT) Реакция агглютинации Около сутокВ настоящее время не является ни предписанной, ни альтернативной реакцией 10 Native hapten and poly B tests Нативный гаптен и поли В тесты Альтернативные подтверждающие тесты. 11. Brucellin skin test* Аллергическая проба ч.Альтернативный иммунологический тест. Используется в невакцинированных стадах. Подтверждает специфичность других серологических реакций.
5 Название реакции или метода Вид животных Интерпретация результата 1. Реакция агглютинации (РА) с S-антигеном Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, лошади, верблюды, олени, маралы, собаки, другие виды животных Подтверждающий диагноз 2. РА с R-антигеномСобакиПодтверждающий диагноз 3. Реакция связывания комплемента / реакция длительного связывания комплемента с S-антигеном (РСК/РДСК) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, лошади, верблюды, олени, маралы, собаки, свиньи, другие виды животных Подтверждающий диагноз РСК с R-антигеномКрупный рогатый скот Подтверждающий диагноз (дифференциальный) 4. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы Подтверждающий диагноз (альтернативный) 5. Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) Крупный рогатый скот, овцыПодтверждающий диагноз (альтернативный) 6. Конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, мелкий рогатый скот, свиньи, собаки Подтверждающий диагноз (дифференциальный ) Диагностические реакции (методы) на бруцеллез, применяемые в РФ
6 7. Иммунохроматографический (ИХА) Крупный рогатый скот, овцыПодтверждающий диагноз (альтернативный) 8. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном (РИД) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, олени, маралы Подтверждающий диагноз (дифференциальный) 9. РИД с R-антигеномСобакиПодтверждающий диагноз 10. Роз бенгал проба (РБП)Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, свиньи, лошади, верблюды, олени, маралы Ориентировочный 11. Кольцевая реакция с молоком (КР) Крупный рогатый скотОриентировочный 12. Аллергическое исследованиеСвиньи Ориентировочный 13. Полимерная цепная реакция (ПЦР) Животные всех видов Подтверждающий диагноз
7 Название диагностического средства Название реакции или метода Интерпретация результата 1.Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК (ОАО «ПЗБ») Реакция агглютинации (РА) Подтверждающий диагноз Реакция связывания комплемента Подтверждающий (для международной торговли) 2. Набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) (ООО «Ветмедсервис») Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) Подтверждающий (альтернативный) 3. Набор для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота иммуноферментным методом (ФГУП «Курская биофабрика) Непрямой ммуноферментный анализ (ИФА) Подтверждающий (альтернативный) 4. Набора для выявления антител к антигену S-LPS Brucella abortus и Brucella melitensis иммуноферментным методом«Бруцелла-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим) Конкурентный иммуноферментный анализ Подтверждающий (альтернативный) 5. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в роз бенгал пробе (ОАО «ПЗБ») Роз бенгал проба (РБП) (экспресс- тест) Ориентировочный 6. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции с молоком (ОАО «ПЗБ») Кольцевая реакция с молоком (КР) Ориентировочный 7. Тест-система для диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД (ООО НПЦ «ВетБиоТест») Реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном Подтверждающий (дифференциальный) Средства и методы диагностики бруцеллеза, зарегистрированные в РФ
8 Набор для диагностики и дифференциальной диагностики бруцеллеза животных иммуноферментным методом (ФГУП Курская биофабрика») Конкурентный иммуноферментный анализ Подтверждающий (дифференциальный) 9. Набор для выявления иммуноферментным методом собак и других плотоядных, инфицированных B.canis (ФГУП «Курская биофабрика») Конкурентный иммуноферментный анализ Подтверждающий (альтернативный) 10. Набор для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B.canis, в реакции агглютинации и реакции иммунодиффузии (ООО «Агровет) РА и РИДПодтверждающий 11. Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B. abortus 82 (ФГБУ «ФЦТРБ») РСКПодтверждающий (дифференциальный) 12. «Иммунохроматографическая тест-системы для определения антител к ЛПС антигену B. abortus и B. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец» — ФГУП «Курская биофабрика» ИммунохорматографияПодтверждающий 13. «Набор диагностический для выявления индивидуальных специфических антител класса G к бактериям рода Brucella в сыворотке (плазме) крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом» — «Сиббиотест» (г. Новосибирск)* Конкурентный иммуноферментный анализ Подтверждающий 14. Тест-система «Бру-ком» для выявления возбудителя бруцеллеза животных методом полимеразной цепной реакции ОО«ИнтерЛабСервис») Полимерная цепная реакция (ПЦР)Подтверждающий 15. Бруцеллин ВИЭВ (ФГУП «Щелковский биокомбинат») Аллергическое исследованиеОриентировочный
9 Дата исследования Лаборатория Результат методматериалкол-вополсомотрПримечание ВалуйскаяРСКсыворотка первичное ВалуйскаяРСКсыворотка87-1 подтверждены результаты исследований от г БМВЛРСКсыворотка72-5 исследованы положительные пробы крови в РСК от Валуйской лаборатории БМВЛПЦРсыворотка70-7ПЦР ВГНКИРСКсыворотка22— подтверждены результаты исследований БМВЛ от БМВЛРСКсыворотка повторное National Vet. Res. Institute, Poland, gorod Pulawy РСК ин. сыворотка РА ин. сыворотка ИФА ин.асыворот ка ВалуйскаяРСКсыворотки повторное 2 Примечания. БМВЛ — ФГБУ «Белгородская МВЛ»; Валуйская — ОГБУ «Валуйская СББЖ» ин.сыворотки — инактивированные сыворотки Результаты исследования на бруцеллез 637 голов свиней, ввезенных на территорию Российской Федерации Чехии
10 п/п Инв. Пол, год рожден ия Результат исследования РБП РА МЕ/м л РСК РИД РНГА ИФАПЦР Бак. исследование 1*2* «Бру-ком» «Интеркол» молокол.у. молоко, л.у корова 2007 пол. 200 пол. 1/10 отр. пол отр. пол теленок 2013 отр. н.и. Результат серологического исследования на бруцеллез крупного рогатого скота, принадлежащих ООО «Аврора» с. Сабуровщино Бабынинского района Калужской области Примечание: — 1* — Набор для диагностики и дифференциальной диагностики бруцеллеза животных иммуноферментным методом (ФГУП «Курская биофабрика»); 2* — «Набор диагностический для выявления индивидуальных специфических антител класса G к бактериям рода Brucella в сыворотке (плазме) крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом» — «Сиббиотест» (г. Новосибирск); л.у. – лимфатические узлы; н.и. – не исследовали. Выделена культура Yersinia enterocolitica с/в 09
11 Актуальные задачи в плане совершенствования диагностики бруцеллеза животных 1. Разработка высокоспецифичных антигенов для серологической диагностики бруцеллеза; 2. Сокращение периода между вакцинаций и проведением диагностических исследований вакцинированных животных: — Тест-система для диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД (ООО НПЦ «ВетБиоТест») — к.р.с. — через 1,5 мес.; — м.р.с. через 5 мес. — (только после однократного введения вакцины); — Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B. abortus 82 (ФГБУ «ФЦТРБ») — 3 мес. к.р.с. 3. Сравнительный анализ репрезентативных данных серологических исследований крупного и мелкого рогатого скота в разных реакциях.
12 4. Необходимо изменить критерии, определяющие заболевание бруцеллезом животных всех видов. Так, животных следует считать больными, при: — выделении вирулентной культуры бруцелл; — положительном результате биопробы у невакцинированных животных; — положительном результате ПЦР у невакцинированных животных, подтвержденном положительными результатами исследования хотя бы в одной из серологических реакций (РСК, РНГА, ИФА, РИД); — положительном результате РИД, подтвержденной положительными результатами исследований хотя бы в одной из других серологических реакций (РСК, РНГА, ИФА); — увеличении титра антител вдвое и выше при повторном серологическом исследовании через суток. 5. Единичные положительные результаты серологического исследования животных без клинических проявлений болезни, неиммунизированных или иммунизированных против бруцеллеза неагглютиногенными или слабоагглютиногенными вакцинами, полученные впервые в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, независимо от титра антител в РА, РСК, РНГА следует интепретировать, как «сомнительные».
13 С целью уточнения диагноза необходимо: — исследование этих же образцов сыворотки в других серологических реакциях, а также в ПЦР — на бруцеллез и иерсиниоз; — повторное серологическое исследование данных животных через 15 и 30 суток. 6. Максимально широко использовать способ полной замены поголовья неблагополучного по бруцеллезу пункта здоровыми животными, в частности: — во всех случаях установления диагноза на бруцеллез в благополучных областях, краях, республиках; — в случаях инфицирования крупного рогатого скота, свиней, лошадей B.melitensis; — в неблагополучных областях, краях, республиках при установлении бруцеллеза животных в хозяйствах благополучных районов, не проводящих иммунизацию скота против бруцеллеза; — во всех случаях острого течения бруцеллеза, сопровождающегося массовыми абортами; — в случаях, если оздоровление хозяйств, проводимое с применением или без применения противобруцеллезных вакцин, не достигается в течение 3-х лет.
14 п/п Инв. ном. РАРСКРПБИФА 0,244 РНГА 1: КРПЦР/бак.исследованиеПЦР «Энтеркол » кровьмолокоЛ.узлы, Внутр. органы , /- +10/ , /- Не иссл , /—/-+3/ , /-+/-Не иссл , /-+/-+12/ , /- Не иссл , /- Не иссл , /- -/ , /- Не иссл , /- +1/ , /- +8/ , /-Н.л.Не иссл , /-Н.л.+3/ , /-Н.л.Не иссл.- Всего: положительно /-10/-(6) ,4 % / (5) ,3 % — Результаты исследования на бруцеллез и иерсиниоз образцов сыворотки крови (14), молока (11), лимфатических узлов и внутренних органов (96) от коров из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства
15 Кожные пробы на бруцеллин Альтернативным иммунологическим тестом является кожная проба на бруцеллин, которая может использоваться для скрининга невакцинированных стад, при использовании очищенного (свободного от гЛПС) и стандартизированного антигенного препарата (напр. бруцеллин INRA). Обязательно следует использовать стандартизированный, препарат бруцеллина, который не содержит антигена гладкого липополисахарида, поскольку может вызвать неспецифические воспалительные реакции или повлиять на последующие серологические тесты. Кожные пробы на бруцеллин имеют высокую специфичность, такую, что серологически отрицательные невакцинированные животные, которые являются положительно реагирующими при проведении теста на бруцеллин, должны считаться зараженными животными. Так же, результаты этого теста могут содействовать интерпретации серологических реакций, даже являющихся ложно положительными серологическими результатами из-за заражения перекрестно-реагирующими бактериями, особенно в зонах, свободных от бруцеллеза. Однако, не у всех зараженных животных наблюдается реакция, поэтому собственно этот тест не может быть рекомендован в качестве единственного диагностического теста для международной торговли. Хотя внутрикожная реакция на бруцеллин является наиболее специфичным тестом при бруцеллезе (у невакцинированных животных), диагноз не должен ставиться только на основе положительных внутрикожных реакций, наблюдаемых у нескольких животных в стаде, он должен подтверждаться надежным серологическим тестом.
16 СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
17 ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА, ВЫПУСКАЕМЫЕ И ПРИМЕНЯЕМЫЕ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (для иммунизации крупного рогатого скота) вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла абортус 82 живая сухая; вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая; вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B.abortus 75/79-АВ живая сухая. (для иммунизации мелкого рогатого скота) вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая; вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis REV-1 живая сухая.
18 Сегодня не представляется возможным использовать для профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота вакцину из штамма B.abortus 19 вместо наиболее широко применяемой вакцины из штамма B.abortus 82. Также нельзя переоценивать значимость специфической профилактики бруцеллеза животных. В первую очередь по причине относительной иммуногенной активности всех известных в мире бруцеллезных вакцин, в том числе и вакцины из штамма RB-51. Равно как нельзя сразу отказаться от применения вакцин на эндемичных по бруцеллезу территориях. Во-первых, потому что при относительно небольшой дозе возбудителя и умеренной его вирулентности вакцинированные животные успешно противостоят инфицированию. Во-вторых, в случае периодической иммунизации животных, абортов бруцеллезной этиологии, как правило, не наблюдают или их меньше, что имеет важнейшее эпидемическое значение.
19 Актуальные задачи в плане совершенствования специфической профилактики бруцеллеза животных 1. Широкое применение новых препаратов зарегистрированных в РФ в 2013 г.: — «Антигена из штамма Brucella abortus R-1096 для выявления латентных форм бруцеллеза у крупного рогатого скота» — ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» Антиген предназначен для: — провокации S-бруцеллезных антител у инфицированных бруцеллами животных с латентной или скрытой формой болезни с целью выявления и удаления их стада; — сенсибилизации неиммунизированного против бруцеллеза крупного рогатого скота в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах или в благополучных хозяйствах, угрожаемых по заносу возбудителя инфекции, перед иммунизацией вакциной из штамма B. abortus 82 с целью профилактики, вызываемых ею абортов; — ежегодного в течение 2-3 лет введения коровам, иммунизированным вакциной из штамма В. аbortus 82 с целью поддержания перманентного иммунитета без поствакцинальной серопозитивности.
20 Антиген вводят коровам, ранее не иммунизированным против бруцеллеза и (или) иммунизированным в возрасте 3-6 месяцев противобруцеллезными вакцинами из штаммов B. abortus 19 и 82 и реиммунизированным через 10 месяцев вакциной из штамма B.abortus 82. В неблагополучных по бруцеллезу и угрожаемых по заносу возбудителя хозяйствах антиген применяют, соответственно, сразу после установления диагноза или при подозрении на заболевание животных. Перед введением антигена проводят серологическое исследование животных на бруцеллез в РА и РСК или РА и РИД или в РНГА или в других серологических реакциях. Всех больных животных сдают на убой. После введения антигена проводят серологическое исследование животных в тех же реакциях через 15 и 30 дней. Больных животных сдают на убой, оставшихся — иммунизируют вакциной из штамма В. аbortus 82. Первое серологическое исследование животных проводят через 1,5 месяца после введения вакцины в РИД с О-ПС антигеном и через 3 месяца в РА и РСК с S-бруцеллезным антигеном (единым для РА, РСК и РДСК) и в РСК с R- бруцеллезным антигеном ВНИВИ.
21 — «Антигена БИВ для выявления скрытых форм бруцеллеза у крупного рогатого скота» — ФГУП «Щелковский биокомбинат» Антиген предназначен для: — выявления скрытых форм бруцеллеза у крупного рогатого скота в хозяйствах всех форм собственности неблагополучных и угрожаемых по заносу возбудителя, в которых не проводится специфическая профилактика болезни. Антиген вводят крупному рогатому скоту, начиная с 3-х месячного возраста. Перед применением антигена животных исследуют на бруцеллез в РА и РСК или РНГА, или ИФА. В хозяйствах неблагополучных по бруцеллезу на убой сдают положительно и сомнительно реагирующих животных; в угрожаемых — положительно реагирующих. Антиген вводят животным не более 4 раз в год с интервалом 3 месяца. Через 15 и 30 суток животных исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК) или РНГА, или ИФА и далее через каждые 30 суток до получения двух подряд отрицательных результатов. Всех животных положительно и сомнительно реагирующих на бруцеллез сдают на убой.
22 2. Возобновления производства и внедрение в практику инактивированной адъювант-вакцина из штамма B.abortus КВ 17/100 против бруцеллеза крупного рогатого скота или аналогичной.
23 Однако даже в случае реализации всех вышеизложенных предложений искоренение бруцеллеза в РФ будет невозможно без решения следующих проблем: — отсутствия в большинстве субъектов РФ мясокомбинатов и боен, выполняющих убой больных бруцеллезом животных (обусловливает несвоевременный убой и прочее); — компенсации владельцам убытка, неизбежного при изъятии больных животных, в первую очередь, в условиях отгонного животноводства; — несанкционированного перемещения животных на территории страны; — торговли вакцинированными животными из субъектов неблагополучных по бруцеллезу, в субъекты благополучные, в которых вакцины не применяют; — не применения экономических санкций к субъектам неблагополучным по бруцеллезу;
24 — ненадлежащего проведения организационно-хозяйственных мероприятий при бруцеллезе: — без наложения ограничений на неблагополучные по бруцеллезу хозяйства; — введения нетелей и ярок в стада и отары взрослых животных; — концентрация поголовья в хозяйствах молочного направления деятельности; — продолжительное, более 3 лет, применение способа оздоровления путем периодических исследований и вакцинации в стадах, в которых реагировало при серологическом исследовании на бруцеллез более 15 % поголовья.
источник
1.1. Бруцеллез — инфекционная, хронически протекающая болезнь животных.
Возбудитель — бактерии из рода бруцелла, в который входят шесть самостоятельных видов: мелитензис (овец и коз), абортус (крупного рогатого скота), суис (свиней), канис (собак), овис (баранов и овец) и неотома (кустарниковых крыс).
Микроорганизмы первых четырех видов вызывают бруцеллез животных, а пятого вида — инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ).
От животных, больных бруцеллезом, могут заражаться люди, для которых наиболее опасен возбудитель бруцеллеза овец и коз.
1.2. Диагноз на бруцеллез у животных ставят на основании результатов бактериологического, серологического, молекулярно-генетического и аллергического исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни, руководствуясь при этом санитарными и ветеринарными правилами по профилактике и борьбе с заразными болезнями, общими для человека и животных.
1.2.1. При установлении диагноза на бруцеллез необходимо учитывать следующее:
— различные виды возбудителя являются патогенными, в основном, для животных соответствующего вида. Бруцеллы видов мелитензис, абортус и суис могут мигрировать на животных других видов;
— клинические признаки бруцеллеза у животных не характерны. Наиболее часто клиническое проявление болезни у маточного поголовья — аборт, у свиноматок наблюдается мумификация плодов.
При абортах отмечается утолщение плодовых оболочек, образование на них фибринозных или гнойных хлопьев. Бруцеллез сопровождается нередко поражением суставов (артриты), синовиальной системы (тендовагиниты, бурситы), половой системы (у самок — эндометрит, вагинит, у самцов — орхит, эпидидимит);
— патологоанатомическая картина при бруцеллезе не имеет характерных особенностей, позволяющих использовать их для диагностики этой болезни. Только у свиней на слизистой оболочке матки иногда находят желтовато-гнойные или казеозные узелки величиной с просяное зерно, так называемый «милиарный бруцеллез матки»;
— у баранов, больных бруцеллезом, в семенниках и придатках обнаруживают некротические или гнойные очаги различной величины; отмечают заполнение полости мошонки серозно-гнойным транссудатом, разрастание фиброзной ткани, сращение придатка с семенником и общей влагалищной оболочкой, иногда атрофию семенников.
1.3. Диагностика бруцеллеза включает лабораторные (бактериологическое, серологическое и молекулярно-генетическое) исследования материала и аллергическое исследование свиней в хозяйствах.
Плановые серологические исследования являются основным методом выявления больных и подозрительных по заболеванию животных.
Бактериологическую диагностику проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание. Одновременно проводят серологическое исследование сывороток крови этих животных.
Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) проводят в случае аборта и при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, из хозяйств, благополучных по данному заболеванию.
1.4. При взятии проб крови, молока и патологического материала, а также проведении лабораторных исследований необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.
2.1. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.
2.2. Для бактериологического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от свиноматок берут не менее трех плодов) или селезенку, печень, желудок плода с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.
Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут кровь, молоко, содержимое гигром (бурситов) и абсцессов. При диагностическом убое — дополнительно селезенку, печень, подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые лимфатические узлы и половые органы. Жидкий материал берут в стерильную посуду (пробирки, банки).
При взятии содержимого гигром, бурс в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.
У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.
Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, молоко консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртоводного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней.
2.2.1. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет) и в этот же день направляют в лабораторию. От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для серологического исследования на бруцеллез. Если в течение 24 — 30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4 — 5 раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.
2.3. Для серологического исследования в лабораторию направляют кровь (сыворотку крови) и молоко.
2.3.1. Кровь у животных берут из яремной вены (у свиней — из яремной, ушной или хвостовой; у собак — головной предплечья или латеральной подколенной голени; у лисиц и песцов — из бедренной вены; у норок — путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста в стерильные пробирки по 5 — 7 мл (от пушных зверей по 1 — 2 мл). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 — 10 °С. Через 20 — 24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3 — 4 ч и повторно через 10 — 12 ч).
Консервирование сывороток проводят:
— добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора фенола на каждый миллилитр сыворотки при тщательном перемешивании;
— сухой борной кислотой (2 — 4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
— путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут. со дня взятия крови при условии хранения их при 4 — 8 °С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут.; замороженные сыворотки — в течение 3 сут. после однократного оттаивания.
Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
2.3.2. Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут сборную из каждой доли вымени одного удоя в одну стерильную пробирку в количестве 10 — 15 мл. При этом, если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и проч.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
Молоко исследуют свежее (охлажденное до 4 — 10 °С или неохлажденное) или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 мл молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2 — 3 сут. Перед исследованием молоко необходимо тщательно перемешать для равномерного распределения сливок.
При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
2.4. На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ установленной формы.
3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и прочие), вызывающих подозрение на данное заболевание.
3.2. Бруцеллы обнаруживают бактериоскопией мазков из патологического материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.
3.3. Бактериоскопическое исследование
Из доставленного на исследование патологического материала делают по два мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек. Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.
Мазки, фиксированные над пламенем горелки, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шину (см. Прил. N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину в красный цвет.
3.4. Бактериологическое исследование
3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночный глюкозо-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА), печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар, сывороточно-декстрозный агар, печеночно-сывороточный агар и печеночно-аминопептидный агар, (см. Прил. N 1, п. 2) и другие питательные среды, предназначенные для этой цели.
3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии протирают тампонами, смоченными 5%-ным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.
Из печени и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой из органов (место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.
Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10 пробирок агара.
При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.
Из плодовых оболочек и плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).
Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3%-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5%-ного спиртоводного раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 12,5 мг на 100 мл среды и др.
Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.
Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом или другими консервантами, высевают на среды без бактериостатических веществ.
3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.
При исследовании материала от крупного рогатого скота половину
засеянных пробирок и чашек культивируют в обычных условиях, другую
— в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%)
в СО -инкубаторе или эксикаторе (микроанаэростате). Аналогичные
условия можно создать в пробирках, закрытых резиновыми пробками
Перед парафинированием пробирки закрывают ватными пробками, пронося последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1,0 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.
Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:
— заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;
— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);
— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора. Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический метод (см. Прил. N 1, п. 3).
3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 24 — 48 ч. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, обезвреживают путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.
В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 сут. визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.
При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.
При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.
В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.
При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов, и делают пересев на чашки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же, как и высевы из патологического материала.
Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов — по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шину), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл.
Для постановки пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие компоненты: испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), 0,5%-ный фенолизированный физиологический раствор рН 7,0 — 7,2.
Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного на этикетке коробки. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.
Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли: R- и S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным R-бруцеллезным антигеном и с роз бенгал антигеном.
Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:
++++ (4 креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;
Следует иметь ввиду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно; агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S- бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем 3 креста, а с гетерологичными — отсутствует.
Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на 2 креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест посева.
Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными и тинкториальными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации с R- и S- бруцеллезными сыворотками в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, признают бруцеллами.
Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов и бруцеллеза собак, вызванного B. canis, постоянно агглютинируется только R — бруцеллезной сывороткой.
3.5. Биологическое исследование
3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 — 400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием в РА сыворотки крови в разведении 1:5 с отрицательным результатом.
3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для бактериологического исследования.
Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 мл.
Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке в объеме 1 мл.
Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в объеме 0,2 — 0,3 мл. При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.
Пробы молока центрифугируют 30 мин. при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.
3.5.3. На 15, 25 и 40-е сут. после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2 мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции. Сыворотку крови исследуют в пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.
При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку бульона и две пробирки агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.
При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бакисследование не проводят.
3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают без бакисследования.
3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.
При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез. При сохранении патматериала или возможности взятия нового (кровь, молоко, моча и др.) исследование проводят методом полимеразной цепной реакции. По ее результатам делают заключение о заболевании животных бруцеллезом.
— бактериологического — до 1 мес.;
3.8. В ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атм. в течение 1 ч.
3.9. При необходимости определения вида бруцелл выделенные от животных культуры направляют в республиканские, краевые, областные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй группы.
4.1. Серологическая диагностика бруцеллеза заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации (РА) в пробирках, реакции связывания комплемента (РСК), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК), реакции иммунодиффузии с 0-полисахаридным антигеном (РИД), пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба — РБП) и в молоке коров — кольцевой реакции (КР) и других реакциях, утвержденных в установленном порядке.
4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации (РА) в пробирках
4.2.1. Реакцию агглютинации в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная биопредприятием или полученная в лаборатории;
— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 6);
— 0,5%-ный фенолизированный раствор хлорида натрия. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют фенолизированный физиологический раствор хлорида натрия (0,85%-ный); при исследовании крови овец и коз — 5%-ный и оленей (маралов) — фенолизированный 10%-ный раствор хлорида натрия (см. Прил. N 2, п. 1).
4.2.3. Постановка реакции агглютинации
Реакцию агглютинации проводят в серологических пробирках в объеме 1 мл в четырех разведениях:
— при исследовании сывороток крови овец, коз, оленей (маралов) и собак — 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
— крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— пушных зверей и морских свинок — 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях.
Компоненты реакции вносят индивидуальными мерными пипетками (дозаторами) или групповыми дозаторами Флоринского.
Для исследования каждой испытуемой сыворотки крови требуется 5 пробирок. В пробирках первого ряда делают исходное разведение. Для этого сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов берут в дозе 0,1 мл, вносят в пробирку, добавляют к ней 2,4 мл соответствующего раствора хлорида натрия, смешивают и получают разведение сыворотки 1:25. Сыворотку крови овец, коз, оленей (маралов) и собак берут в дозе 0,2 мл и добавляют 2,3 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:12,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 мл и добавляют 1,2 мл соответствующего раствора хлорида натрия (разведение 1:5). Таким образом делают исходное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду).
После приготовления исходного разведения сывороток в первом ряду в пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 мл соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского или индивидуальных пипеток-дозаторов переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 мл исходного разведения сывороток (1:25; 1:12,5 или 1:5). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают, по 0,5 мл этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда и так же из пробирок четвертого ряда — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 мл жидкости удаляют. Таким образом делают последовательные двукратные разведения сывороток.
После этого в каждую пробирку второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 мл антигена, предварительно разведенного 1:10 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается и, в зависимости от вида исследуемых животных, будет составлять 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400; 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200 или 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
В пробирки первого ряда бруцеллезный антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
При массовых исследованиях сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с грушей) или групповыми дозаторами Флоринского в две пробирки в дозах 0,02 и 0,01 мл (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 мл при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл антигена, разведенного соответствующим раствором хлорида натрия 1:20. При этом разведения сывороток будут соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При постановке реакции агглютинации одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативной и позитивной бруцеллезной сыворотками в таких же разведениях.
После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при 37 — 38 °С на 16 — 20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
4.2.4. Учет реакции агглютинации. Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:
++++ (4 креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
+++ (3 креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» (75% агглютинации);
+ (1 крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);
— (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на 2 креста (++), что соответствует количеству международных единиц (МЕ) антител в 1 мл сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 МЕ, 1:200 — 200 МЕ и т.д.).
Для более объективной оценки результатов РА в крестах готовят стандарты мутности, соответствующие 75, 50, 25 и 0% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно наливают 1, 2, 3 и 4 мл антигена, разведенного 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 3, 2 и 1 мл физиологического раствора. В четвертую пробирку раствор не добавляют. После встряхивания пробирок из каждой из них переносят по 0,5 мл в серологические пробирки и добавляют по 0,5 мл физиологического раствора. Полученные стандарты соответствуют 75, 50 и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Стандарты мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на 2 креста (++) в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
4.2.5. Диагностическая оценка реакции агглютинации
Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сывороткой крови крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), верблюдов и лошадей, не иммунизированных или иммунизированных неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), содержащей 200 МЕ антител и выше; овец и коз — 100 МЕ и выше; оленей (маралов) и собак — 50 МЕ и выше; пушных зверей и морских свинок — 10 МЕ и выше.
При выявлении среди не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, а также иммунизированных неагглютиногенными вакцинами крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей, животных, реагирующих только в РА с содержанием антител 50 — 100 МЕ, а среди овец, коз, оленей (маралов), собак — 25 МЕ, считают сомнительно реагирующими и исследуют повторно через 15 — 30 сут. При повышении титров заболевание считают установленным. При сохранении титров на прежнем уровне проводят дополнительные исследования по дифференциации, согласно утвержденным методам.
При выявлении в стадах крупного рогатого скота, ранее иммунизированного против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами (см. Прил. N 2, п. 7), животных, реагирующих только в РА с содержанием не выше 200 МЕ антител и РСК в разведении сыворотки крови не выше 1:10, их повторно исследуют через 15 — 30 сут. в РА, РСК и РИД. При повышении содержания антител в исследуемых сыворотках в РА и (или) РСК или положительной РИД заболевание считают установленным.
При выявлении в неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, ранее не иммунизированных или иммунизированных противобруцеллезными вакцинами, животных, положительно реагирующих в РА с содержанием 100 МЕ антител и выше, признают больными. Реакцию считают сомнительной при содержании 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительного результата животных признают больными бруцеллезом.
При исследовании в РА неиммунизированных баранов-производителей, козлов, пробников и ярок, содержащихся в благополучных по бруцеллезу отарах, где овцы (козы) иммунизированы против бруцеллеза, реакцию считают положительной, а заболевание установленным при содержании в сыворотке крови животных 100 МЕ антител и выше. Реакцию считают сомнительной при наличии 50 МЕ антител. Сыворотки крови от таких животных через 15 — 30 сут. исследуют повторно. При получении вновь сомнительных результатов животных признают здоровыми, а отару — благополучной по бруцеллезу.
В заключении лаборатории о результатах исследования должна быть сообщена диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой 2 — 4 креста — «положительная» 200 МЕ; титр сыворотки 1:100 с оценкой 2 — 4 креста — «сомнительная» 100 МЕ).
Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток, серию антигена, срок его годности, а также титр позитивной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.
4.3. Постановка и учет реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК)
4.3.1. Реакцию связывания комплемента применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.
Реакцию длительного связывания комплемента, как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез сывороток крови животных.
4.3.2. Компоненты реакции и их подготовка к работе:
— испытуемые сыворотки крови (см. п. 2.3.1);
— позитивная бруцеллезная сыворотка, изготовленная биопредприятием или полученная от больного бруцеллезом животного;
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных из опыта или консервированная), изготовленная на биопредприятии или полученная в лаборатории.
Испытуемые и контрольные (позитивную и негативную) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции: для РСК — при 60 — 62 °С в течение 30 мин. (сыворотки крови ослов и мулов — 64 — 65, буйволов — 62 — 64, свиней — 58 — 60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 — 64 °С в течение 30 мин.;
— антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК в рабочем титре, указанном биопредприятием-изготовителем (см. Прил. N 2, п. 6);
— комплемент — сыворотка крови морской свинки, лиофильно высушенная, биофабричного изготовления или нативная (свежая или консервированная добавлением 2 — 4% борной кислоты).
Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором, как указано на этикетке коробки. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. В каждую ампулу (флакон) вносят физиологический раствор и, не встряхивая, помещают в холодильник на 20 — 30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания ампул (флаконов), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при 4 — 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования растворенный или нативный комплемент разводят физиологическим раствором 1:20, а остальной — хранят в холодильнике для постановки главного опыта. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки главного опыта;
— гемолитическая сыворотка (гемолизин) — сыворотка крови кролика, гипериммунизированного эритроцитами барана, — для РСК и РДСК в удвоенном титре. Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности (см. Прил. N 2, п. 5);
— эритроциты барана — 2,5%-ная от осадка взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе для РСК и РДСК (см. Прил. N 2, п. 3).
Для приготовления гемолитической системы взвесь эритроцитов и раствор гемолизина в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 — 38 °С в течение 15 — 20 мин. при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолизина вливают во взвесь эритроцитов;
— физиологический раствор — 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде с рН 6,8 — 7,2 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. Прил. N 2, п. 2). Последний в обязательном порядке готовят в случае использования нативного комплемента (свежей или консервированной сыворотки крови морской свинки).
Рабочие разведения всех компонентов для РСК или РДСК готовят перед постановкой реакции и при необходимости проверяют их на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:
