Набор для диагностики бруцеллеза овец

Copyright © 2008-2019, TenderGURU
Карта сайта. Календарь.
Все права защищены. Полное или частичное копирование запрещено.
При согласованном использовании материалов сайта TenderGURU.ru необходима гиперссылка на ресурс.
Электронная почта: info@tenderguru.ru
Многоканальный телефон 8-800-555-89-39
с любого телефона из любого региона для Вас звонок бесплатный!

Портал отображает информацию о закупках, публикуемых в сети интернет
и находящихся в открытом доступе, и предназначен для юрлиц и индивидуальных предпринимателей,
являющихся участниками размещения государственного и коммерческого заказа. Сайт использует Cookie, которые нужны для авторизации пользователя.
На сайте стоят счетчики Яндекс.Метрика, Google Analytics и LiveInternet,
которые нужны для статистики посещения ресурса.

Недавно мы открыли страницы соцсетях!
Присоединяйтесь и следите за новостями:

Наш новый канал в Telegram https://t.me/tenderguru_ru

источник

Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой Brucella ovis (инфекционный эпидидимит баранов)

Купить бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Цена на этот документ пока неизвестна. Нажмите кнопку «Купить» и сделайте заказ, и мы пришлем вам цену.

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

• Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
• Курьерская доставка (7 дней)
• Самовывоз из московского офиса
• Почта РФ

2 Взятие материала от животных и пересылка его для лабораторных исследований

3 Бактериологическая диагностика

4 Методы серологической диагностики инфекционного эпидимита баранов

5 Аллергический метод диагностики инфекционного эпидидимита

6 Клинический и патологоанатомический методы диагностики инфекционного эпидидимита баранов

Приложение 1. Методы окраски бруцелл вида овис

Приготовление питательных сред

Определение концетрации углекислого газа

Приложение 2. Приготовление растворов и титрование

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

ill м ок> тля м-дтл in пика И СЛ’Л» ил I ГУ ДОПОЮ КРАСНОЮ MIAMI МИ АКАД1МИХ I Jtl»(KOXO *ЯИ1 ШИММУ НАУК НМ! НМ и И III НИНА • И I» И I* I киГ О I Д I и I It и I

н/чУчно-иссягдоклк 11||Г1.ин niinnivi Bf.TtPMt 1АГИИ ЦОСЮЧИОИ С.ИЬИт ОМСКИИ Г ОСУ Л АГС МКННЫИ

ВтГ’ИНА1Ч1ЫИ ИИ с профилактической целью также в молодом возрасте (4-6 месяцев). Эта мора особенно полезна в зонах, где 4-5 лет назад или в настоящее время наряду с ИЭ регистрируется и бруцеллез, так как будут про-филактировагься сразу две инфекция.

ИНОЕКЦИОННОГО ОПИДИДИМИТА БАРАНОВ Рекомендации

Вздактор Б. В. Стрибук Художественный редактор В.Е.Сафронов Технический редактор Н.И.Анищенко Корректор T.U. Немцева

Подписано к печати 0?.12.6£>. 101 02360». Формат 84×108 1/32 Уел.печ.л. 0,63 , уч.-изд.л. 0,7. Тираж 500 экз.Заказ J&566.

Редшщио1шо—лолд1рафическое объединение СО ВАСХНИЛ,ротапринт 633128, Новосибирская область

Инфекционный эпидвдимит (ИЗ) бараков — недавно открытая разновидность бруцеллеза овец, вызывазмого особым видом бруцелд — (Brucella ovio ). Наиболее чувствительны к возбудителю бараны, у которое поражается главным образом придаток оеме»шико — эпидидимис.

Хах)актористика возбудителя. Возбудитель ИЭ по морфало-пы»

и многим свойствам сходен с другими видами бруцелл.

Это очень мелкие бактерии, имеющие длину 0,5-1,5 мкм и ширину 0,34),? ш. Спор не образуют, жгутиков не имеют, неподвижны, грамотрицателыш. По методу Козловского окра-tv. хя в красный цвет (непостоянно). Кулыурц, ллптель-•» • __г»«_ »чеся на питательных, средах, проявляют широкую . шиботь морфологии, окраски, антигенных, огглюти-иаоельних я других свойств.

Сущос^вуот мнение, что это сильно изменявшийся варл-aj(T (к -форма) возбудителя обычного бруцеллеза овец,утративший п процессе эволюции характерный для типичных ( :н!м>м) бруцелл поверхностный лавопочисахуридн.чй (ЛИС) amv.roH и б значительной стопины вирулентное тъ.

Исто’яIаки возбудителя и пути распространена. Осн о t лшм истом;ikkom Hj .ovIb являются больные бараны.

Наиболее частый путь заноса возбудителя в ранее ньлучиые хозяйства (формы, отары) — ввоз шн]ю1ировон1!их льготных, чаще всего молодых племенных баранов, лрисб)>е

тынных в неблагополучном хозяйство.

Наибольшую опасность в распрострононми ИО представ* .jt инфицированная спорма, полученная от больных бароног на племирсдирннтиях (станциях искусственного осеменения).

Iuiomi. спермы возбудитель ИЭ монет отдаляться m организмы с >?пчой, калом и другими экскрементами и инфицировать помпу, корм и воду, о т/mo предметы уходе за г.нвот-и|ям, кормушкь, подстилку и друзме ооъоиты ишшней среда. Зедшоики 1Д01ЮПНХ овец происходит но только половым, по и a r>iMQjiriPHfw нуг^м. >■ также через слизистые оболочки гчаз, ПО.: Г Вий милости к кожным покров

Наибольшее раопросгранение инфекции среди баранов наблюдается в период естественного осеменения, когда бараны используются для так называемого докрытая.

Привэдсм два наиболее типичных примера.

В колхозе им. Ленина Кыринского района бараны (производители я пробники) перед случкой были исследованы .дважды — в шоно и сентябре 1976 г. Оба раза серологические реакции были отрицательными. При исследовании после осеменения в ноябре 1976 г. выделен один баран-производитель с положительной РДСК* в феврале 1977 г. — уже 5 баронов.

В колхозе им. Лазо Приаргунского района бараны перед случкой также имели отрицательные реакции, После осеменена в январе 1977 г. обнаружены по одной положительной и сомнительной реакции в РДСК, а в марта 1977 г. положительные реакции были уже у 35 животных.

Из этих примеров видно, что существенную роль в распространении возбудителя играют овцематки, которые являются связующим свеном в передаче Br.ovic от больных баранов здоровым. При этом они заражают не только баранов_г но и молодняк.

Патогенез, симптомы и течение инфекции. Опыты пс заражению баранов разными дозами и различными по вирулентности ку»р.тучами br.ovis показали что возбудитель* попав в оргилизм. первоначально локализуется в лимфатических узлах, расположенных возле ворот инфекции (первичная регионарная стадия инфекции), затем лимфой и кровью разносится в отдаленчче лимфатические узлы и паренхиматозные органы (генерализованная стадия). После х^енераоизации наступает вторичная регионарная стадия инфекционного процесса.В этот-период вогбудитель обнаруживается, как правило, только в половых органах — в придатках л теле семенников и продета-еотельных железах.

При активно протекающем инфекционном процессе у живот ных через 7-Х? дней после заражения появляются в крови специфические антитела и через 30-45 дней начинает развиваться аллергическое состояние. Сроки развития и последовательность проявления серологических и аллергических реакций могут сильно варьировать. У части инфицированных животных (10-20#) и более иамунореакции могут временно или постоянно отсутствовать.

Обследование 2000 баранов из хозяйотв, неблагополучных по ИЗ, показало у них клинические признаки, свойственные хроническому твчешш инфекционного процессе. При пальпации часто обнаруживаются уплотнения (узлы) в придатках я теле семенников. Хвост придатка иногда бывает увеличен в 1,5-3 раза; нередко встречается атрофия семекиысов,тогда они, как правило, сильно уменьшены и почтя неподвижны.Увеличение размеров мошонки, свойственное острому воспалительному процессу, встречается редко. В этом случае кока мошонки напряжена и болезненна, тестякулы почти не прощупываются из-за отечности тканей и скапливающегося экссудата; у некоторых баранов на мошонке образуются гнойные озищи.

Овцематки и молодняк более устойчивы к заболеванию,чем взрослые бараны. У большинства овцематок инфекционный процесс протекает скрыто (латентно) без выраженных сероаллергических реакций и клинических признаков. Однако у 9-382 овцематок после заражения может развиваться ярко вирапенный инфекционный процесс, сопровождающийся появлением в сыворотке кротзя специфических антител в высоких титрах и развитием аллергического состояния, а в некоторых случаях абортами и ровдением слабых, нежизнеспособных ягнят. В производственных условиях массовые аборты, как правиле,но наблюдаются, но в отдельных отарах ь скотный период сбор-тируют до 15-202 овцематок. Единичные случаи абортов бывают почти во всех неблагополучных по ИЭ отара.

Важной особенностью возбудктеля, попавшего в оргаяяз,? овцематки, является его сравнительно быстрая ь -трансформация, то есть переход к н — в Ь-форму и, как следствие, потеря обычной антигенной специфичности. Поэтому почти у всех зараженных овцематок (91-992; РДСК со стандартным оьисным антигеном бывает стрнцоюльной. Сроки прсби-вания таких измененных форм в организме инфицированных животных не ограничиваются сезоном осеменения, а гораздо продолжительнее — до года и более. Некоторые овцематки остаются носителями их, пг Bce’i вероятности, в течение всо:: лет производственного испатьзования.

Молодняк инфицируется чаще прк внутриутробном развитии в оргышзые больной матери и в первые месяцы жизни при сосении инфицированного молока. Однако заболевание у

них развивается в большинстве случаев только при достижении половой зрелости. До случной камлании обычно никаких нп иммунологических, ни клянжчоских признаков болезни у них нет. Именно с таким молодняком, у которого инфекция протекает окрито (латентно), занооится, как правило, возбудитель болезни в благополучные хозяйства и стада.

Диагностика. Диагноз заболевания, вызванного Br.ovis, устанавливают на основании результатов клинических, серологических, аллергических и бактериологических исследований с учетом епизоотологических и патолого-анатомических данных.

Клиническое обследование животных. Клиническому обследованию в начале подвергают взрослых баранов, которые использовались для естественного осеменения овцематок. Цри осмотре обращают вниманий на их общее состояний и состояние наружных половых органов: семенников, придатков. Животных, у которых обнаружены патологические изменения(увеличение, уменьшение, уплотнение семенников и придатков), характерные для инфекционного зпидилимита, изолируют и затем от них берут кровь для оерологячоокого исследования. Одновременно кровь берут и от всей группы (отары) баранов, в которой обнаружены животные, подозреваете в заболевании инфекционным эпидидимитом.

При установлении диагноза на ИЭ все поголовье хозяйства (фермы) исследуют комплексно, включая серологический и клин:гческий методы.

Серологический метод основан на выявлении в сыворотке крови исследуемых животных специфических к Br.ovia антител, и поэтому он особенно эффективен в начальных стадиях инфекционного процесса, когда идет активный синтез иммуноглобулинов.

Изучение диагностической эффективности реакции длительного связывания комплекта (РДСК) показало, что эта реакция очень специфична и позволяет своевременно установить наличие и степень распространения инфекции в отарах. Вместе с этим был выявлен и ряд ее иедоотатков. Установлено, что позитивная РДСК в отдельный сроки после заражения может «выпадать», то есть показания ее но строго постоянны. При повторных исследованиях, црозеденных через Г-34) месяцев, позитивные реакции могут исчезать у

пятой части естественно инфицированных баранов. Отрицательную ТОК имеют до 15-2056 баранов, являющихся носителями. Br.ovie и имеющих клинически траленные признаки эпидидямита.

Особенно неудовлетворительные результаты РДСК дает при исследовании овцематок из неблагополучных по ИЭ отар и молодняка. Это связано, с одной стороны, с особенностями инфекционного процесса у этих групп овец, с другой — с изменчивостью антигенных свойств возбудителя. Иногда эффективность ИЮК пропорциональна чувствительности применяемого R -антигена.

В отдельных случаях при исследовании снБоротки крови овец неблагополучных только по ИЭ отар могут быть получены положительные результаты в РА и РСК оо стандартным бруцеллезным 3 -антигеном. Это отмечается там, где в ОКОТНЫЙ период было много абортов. У абортировавших овцематок РА обычно бывает положительной при разведении сыворотки 1:50-1:100 и с оценкой реакция в 2 и 3 креста. Следует учитывать и возможность получить положительные РДСК с овисным антигеном при исследования овец в отарах, благополучных по ИЭ, но неблагополучных по бруцеллезу. Она определяется очень близким антигенным родством бруцелл ввдов о via и meiitenaia и образованием среди последних R3- и я -форм клеток (колоний).

Учитывая возможность таких перекрестных положительных реакций, первичный диатаоэ на ИЭ необходимо подтверждать выделением культур возбудителя на питательных средах и идентификацией их по общепринятой схеме.

Аллергический метод также применим для диагностики ИЭ, Установлено, что у баранов, зараженных бруцаллаыи о via , развивается аллергическое состояние, которое можно выявить пальпебральной и внутрикожной пробами. Аллергическое состояние наблюдается у значительной частя баранов, не имеющих серологических и клинических признаков болезни. Аллергия у многих развивается во 2-3-й мвояц после заражения и сохраняется у некоторых животных в течение 2 лет.

Степень аллергазшш организма овец находится в прямой зависимости от свойств возбудителя: долее вирулентные культуры Сруцелл вида о vie вызывают, соответственно, я более выраженную реакцию.

В зависимости от активности течения и степени распространения инфекции аллергической пробой дополнительно к РДСК и клиническому обследованию выявляется от 2 до 29% инфицированных баранов. Эта проба эффективна и при исследовании овцематок. Вели в РДСК выявляются только единицы реагирующих положительно овцематок, то аллергической пробой — 6-385С от количества исследованных животных. Особенно хорошие результаты дает эта пробе в длительно существующих очагах, где преобладает хроническая форма инфекции.

При изыскании аллергенов, пригодных для практического приме но идя, были испытаны бруцеллин ВИЭВ, бруцеллизат. а также аллергены, изготовленные из Br.ovia , Лучшие результаты получены при использовании ввдоспецифического аллергена — бруцеллоовина. При этом установлено, что пальпебральная проба более пригодна для аллергической диагностики ИЗ, чем ваутрикожная, в области подхвостовой складки. Эффективность первой пробы по сравнению со второй выше в 2-S раз.

Удовлетворительные результаты были получены и с бру-целлином ШЭВ, на который реагировало 63-77/С всех животных имеющих серологические реакции и клинические признаки СЫфЭКЦПИ Br.ovie.

Применение пальпебральной пробы бруцеллином в неблагополучных по ИЭ хозяйствах позволяет иногда выделять в 1,5-2 раза больше инфицированных свец, чем РДСК и клиническим методом. Введение этого препарата и учет реакция осуществляются так же, как при диагностике бруцеллеза, вызванного бруцеллемя ВЧДа molitensis.

Ириченекне аллергической пробы, в том числе и бруцелл*-.-ном ВИЗЬ. на^бедое цслесообрсзно орк широком распространения ИЭ и в отарах- со см&саиной инфекцией СИЗ и бруцачлеэ), когда одновременно можно выявить лквотаых, зараженных Вг. ovig a Br.iaeliter.sis , а также при контрольных профилактических исследованиях овзц благополучных хозяйств зоны, надсдяцейсй под угрозой заноса везбудктеля ИЭ v. бруцеллезе

Аллергическую пробу пока можно применять только как до-полягтв-льный Диагностический тест при определении степени. Хяг>прострьнш»ия инфекции в хозяйство (отаре), а также при выгоре жавот.чых для диагностического убоя и бактериологического исследозапил.

Бактериологическая диагностика включает 3 основных этапа: бяптериоскопию мазков из патологического материала, выдел энив чистой культуры возбудителя на питательных средах я, при необходимости, постановку биологической пробы на лабораторных животных. Этот метод применим и для исследований прижизненной и посмертной диагностики ИЗ.Для бактериологического исследования от животного нужно брать в первую очередь пробы органов (2,0×2,5 см) и димфатичеокяе узлы, имеющие видимые патологические изменения. Для взятия материала проводят либо специальный у о ой животных, либо кастрацию я взятие от баранов только сегоякинов и придатков, имеющих выраженные патололгческке изменения. При хронически протекающей инфекции возбудитель в 7O-I0C# случаев находится именно в этих органах. Дня прижизненной диагностики у барвнов удобным объектом исследования является и эякулят (сперма). При убое баранов дополнительно берут предстательные жэлезы, лимфатические узлы (срашше, паховые, тазовые, брыжеечные, предлопаточные, заглоточные, средостенные), кусочяя селезенки, печени, легких и почки.

От овцематок для исследования берут абортированные плоды, плодные оболочки (плаценту) и зеделенкч из плодных путей, а при убое — взмеыэшше участки матки, вымени, селезенки, печени, легких, почни и лимфатические узлы.

Если в точение суток взятой материал невозможно доставить в лабораторию,его консервируют стэрилъным ЗС5?-ы раствором химически чистого глицерина (1:5). Црц отсутствии этого консерванта материал замораживают в бытовом холодильнике или (в зимнее время) при минусовой естественной TOimeiWType. Такой материал .

При бактериоскопия патологического магерзада н вросших культур нужно учитывать сильно в^рааюкиую склонность в г. о via к патяморфизм/ и сбразовзндю гетзроморфн?;х культур в виде крупных « малких ко»:коб, овоидов, токкях нитей, гигантских шаров к элепсоядоз размером 3-5×10-12 м.чм,удда-авннх* зорвнетчх палочек и других необычных ферм. 1с.кие культуры к баацдякотБС случаев тзряюг способность к характерней оку-оекз по методу Козловского. :* прн с крас ко по

]>зому принимают фиолетовый и темно-синий цвета. Измененные клетки бруцелл даже в одном мазке часто бывают разнородны по форме, размерам и окраоке, что связано с различной степенью дефектности их клеточной оболочки. Встречаются также культуры в виде классических L-форм со всеми присущими им свойствами. Восстановить типичную морфологию и окраску измененных культур в некоторых случаях удается лишь путем многократных пересевов на полужидкие и плотные сывороточные среды или пассирования через организм морской свинки.

Бруцеллы вида о vis очень слабо или совсем не растут на питательных средах, применяемых для культивирования других видов. Поэтому для их выращивания рекомендуется применять плотные и полужидкие агаровые среды с добавлением 10-20% сыворотки крупного рогатого скота или амино-иептида. Хорошие результаты дает сухая среда — эритрит агаре. Выращивание культур возбудителя проводят в гкси-каторе при концентрации углекислоты 10-15%, для создания которой можно исиользовать бикарбонат натрия и раствори соляной а серной кислот. На X л воздуха требуется 0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25%-го раствора серной кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия я 0,35 мл концентрированной соляной кислоты. Удовлетворительные результаты дает сжигание в зкоякаторе ватного тампона, пропитанного спиртом. При отсутствии эксикатора ватные пробки можно заливать парафином или заменять резиновыми пробками. Посевы выдергивают б термостате при 37

Серологическую идентификацию выделенных от овец культур бручол* вида о vis проводят обычно путем 2-кратного внутривенного введения 2-3 кроликам 2 мл взвеси этих культур в концентрации 3-4 млрд м.т. в I мл с интервалом 7-8 дней и последующего исследования гтериммунной сыворот ки в РДСК со стендартным овиеным антигеном. Сыворотку кровь исследуют через 1J-1? дней после повторного введения культуры. Появление положительных РДСК при исследования кроличьих оывороток с овясннм антигеном свидетельствует о принадлежиосте изучаемой культуру к возбудителю ИЭ.

Могут выделяться измененные варианты ьозоудателя, вызывающие з организме кроликов антитела, которые яелякггся гетерогенными и не улавливаются в РДСК биофзбричгнм R -ан-

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

Госстандарт Республики Казахстан

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.

5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:

— реакция агглютинации с S — и R -бруцеллезными антигенами;

— пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);

— реакция связывания комплемента;

— реакция длительного связывания комплемента на холоде;

— реакция непрямой гемагглютинации;

— реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;

— реакция иммунодиффузии в геле агара с R -бруцеллезным антигеном;

— кольцевая реакция с молоком;

— иммуноферментный анализ;

— иммунохроматографический анализ.

Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

— РА — реакция агглютинации;

— РСК — реакция связывания комплемента;

— РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;

— РДСК — реакция длительного связывания комплемента;

— РИД — реакция иммунодиффузии;

— ЛПС — липополисахаридный антиген;

— О-ПС — олигополисахаридный антиген;

— РНГА — реакция непрямой гемагглютинации;

— КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;

— ИФА — иммуноферментный анализ;

— ИХА — иммунохроматографический анализ;

— PKг-G — раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;

— ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с твином;

— РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;

— ТМБ-субстрат — тетраметилбензидин-субстрат;

— К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);

— К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.

4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности*, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
________________
* Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.

4.2.4 Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0,2) МПа и температуре (132±2)°С.

При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животных:

— pH-метр с точностью калибровки ±0,1 ед.pH при температуре от 20°С до 55°С;

— спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм, разрешением 1 нм и точностью ±2 нм;

— пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см по ГОСТ 29230;

— колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;

— центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000-3000 об/мин;

— автоклав лабораторный;

— термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С;

— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100°С;

— холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317;

— насос вакуумный;

— иглы препаровальные;

— штамп для формирования лунок в агаре;

— осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0-360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;

— чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;

— чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;

— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:

1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;

2) пипетка-капельница для дозирования антигена;

3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;

4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;

— пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);

— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;

— групповые дозаторы Флоринского;

— пробирки серологические Флоринского;

— микропипетки вместимостью от 0,1 до 0,5 см ;

— дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;

— наконечники для дозаторов вместимостью 0,2; 0,5; 1,0 см ;

— фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;

— бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

— салфетки марлевые;

— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;

— вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

— кислота соляная по ГОСТ 3118 х.ч;

— фенол по ГОСТ 23519 — 5%-ный раствор;

— формалин по ГОСТ 1625 — 1%-ный и 10%-ный растворы;

— натрий хлористый по ГОСТ 4233;

— кислота борная по ГОСТ 18704 — 3%-ный раствор;

— натрия бихромат по ГОСТ 2651;

— калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;

— кислота серная по ГОСТ 4204;

— натрия гидроокись по ГОСТ 4328;

— сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;

— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;

— кровь барана-донора;

— свинки морские массой 300-400 г;

— сыворотки крови животных;

— набор для ИФА, содержащий в своем составе:

1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella ;

7) флакон N 6 — ТМБ-субстрат;

8) флакон N 7 — стоп-реагент объемом 6 см ;

— тест-система для определения антител к ЛПС антигену В.abortus и В. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА, содержащая в своем составе компоненты:

1) К — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;

2) К — буферный раствор для разведения проб объемом 0,8 см ;

— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);

— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);

— роз бенгал антиген для РБП;

— антиген бруцеллезный для КР с молоком;

— 0,85%-ный раствор хлористого натрия;

— 0,85%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— 5%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— 10%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;

— раствор хлорамина 5%-ный;

— взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

— молоко от здоровой коровы (буйволицы);

— набор для РИД, содержащий в своем составе:

1) О-ПС бруцеллезный антиген;

3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;

— набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:

1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;

2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;

4) сыворотку негативную.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.

6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4°С-10°С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).

6.1.2 Консервирование сывороток проводят:

— добавлением 0,05 см (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 см сыворотки при тщательном перемешивании;

— сухой борной кислотой (3-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;

— путем однократного замораживания.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2°С до 8°С.

Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.

6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10-15 см . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 см молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.

6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.

6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.

6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.

7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.

7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)

7.2.1 Сущность метода

Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.

7.2.2 Подготовка к исследованию

7.2.2.1 Приготовление 5%-ного раствора хлорамина

Для приготовления 5%-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.

Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.

7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.

Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.

Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.

7.2.3 Проведение исследования

7.2.3.2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0,03 см антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0,015 см антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 см 0,85%-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0,03 см роз бенгал антигена).

По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5%-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37°С-38°С и используют повторно.

7.2.4 Обработка результатов

Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).

При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА, или в ИХА.

7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком

Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.

КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.

7.3.1 Подготовка к исследованию

Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.

7.3.2 Проведение исследования

В пробирки вносят по 2 см молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0,1 см в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т.д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.

При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:

— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

— смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см сыворотки на 2 см молока).

Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37°С-38°С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:

«+++» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;

«++» (два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;

«+» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;

«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.

7.3.3 Обработка результатов

Все пробы молока с оценкой в «+++» (три креста) и «++» (два креста) считают положительными, «+» (один крест) — сомнительными.

При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.

Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР, исследуют на бруцеллез в РБП, или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.

7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках

7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.

7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5%

В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5, 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С, и используют в течение 1 мес.

7.4.3 Проведение исследования

7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

7.4.3.2 Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в объеме 1 см :

— для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— для овец, коз, оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;

— для собак с R -бруцеллезным антигеном ( B.canis ) — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;

— для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.

Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.

7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:

— сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0,1 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25);

— сыворотки крови овец, коз и собак по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 5%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);

— сыворотку крови оленей и маралов по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 10%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);

— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0,3 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 1,2 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);

— при исследовании с R -бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0,1 см вносят в пробирки, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25).

В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.

В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.

Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,5 см исходного разведения сыворотки.

После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0,5 см переносят в пробирки четвертого ряда и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 см жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.

7.4.3.4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 см антигена в рабочем разведении 1:10 (1,0+9,0 см ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.

После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.

В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютинацию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.

После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.

7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях. Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского, или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0,02 и 0,01 см (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 см при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1,0 см антигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.

При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.

Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.

7.4.4 Обработка результатов

Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);

«+++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75% агглютинации);

«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50% агглютинации);

«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);

«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME, 1:200 — 200 ME и т.д.).

Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75%, 50%, 25% и 0% просветления жидкости.

В четыре пробирки последовательно вносят 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 см антигена, разведенного 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1,0 см в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75%, 50% и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.

При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.

В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см ).

Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.

7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.

Сущность реакции состоит в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.

7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих антикомплементарными свойствами.

Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.

7.5.3 Подготовка к исследованию

7.5.3.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия

Для приготовления 1 дм раствора 8,5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6,8-7,2 ед.pH 5%-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0,85%-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.

20 — исходное разведение комплемента (1:20).

Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см (0,2·100), то к 0,6 см регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.

Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.

Эритроциты барана — 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85%-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446 . Дефибринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата, растворенного в 10-20 см стерильного 0,85%-ного раствора хлористого натрия, на 100 см крови. Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10-14 сут.

Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37°С-38°С в течение 15-35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.

Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60°С-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64°С-65°С, буйволов — 62°С-64°С, свиней — 58°С-60°С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63°С-64°С в течение 30 мин.

Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1 — Проверка антикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Комплемент в разведении 1:20

Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении

Антиген в рабочем разведении

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 10 мин при 37°С-38°С

Полная задержка гемолиза эритроцитов

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

7.5.4 Проведение исследования в РСК

При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).

Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:

— при массовом исследовании в одной пробирке к 0,05 см исследуемой сыворотки добавляют 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);

— при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1 см исследуемой сыворотки, добавляют 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0,5 см ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0,2 см во вторую пробирку и 0,1 см — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).

Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.

Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пипеточных дозаторов с наконечником.

Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

Таблица 2

При массовом исследовании

При исследовании в двух разведениях

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

Водяная баня 30 мин при 58°С-65°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

Примечание — Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.

При постановке реакции ставят следующие контроли:

— негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);

— гемолитической системы (0,4 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— комплемента (0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз;

— антигена (0,2 см антигена в рабочем разведении, 0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,2 см 0,85%-ный раствор хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз.

При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0,8 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, 0,2 см пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого, пятого и шестого рядов вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0,2 см в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0,2 см разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20, и так далее до шестого разведения 1:80. Из пробирок последнего ряда по 0,2 см разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомплементарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.

7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)

7.5.5.1 Подготовка к исследованию

Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06-0,1 или в разведении 1:20-1:15 при титре 0,1-0,14.

Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.

Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.

Таблица 3

Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С

Холодильник 16-18 ч при 2°С-6°С

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

7.5.5.2 Проведение исследования

Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.

Таблица 4

При массовом исследовании

При исследовании в трех пробирках

пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)

пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С

0,85%-ный раствор хлористого натрия

Антиген в рабочем раведении

Комплемент в рабочем разведении

Холодильник 2-6°С 16-18 ч и 20 мин при комнатной температуре

Гемолитическая система в рабочей дозе

Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С

При постановке реакции ставят контроли:

— негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;

— гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0,6 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;

— антиген с 0,85%-ным раствором хлористого натрия и гемолитической системой (0,2 см антигена в рабочем разведении; 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,6 см гемолитической системы) — полная задержка гемолиза.

7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках — через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;

«+++» (три креста) — гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;

«++» (два креста) — гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;

«+» (один крест) — гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;

«-» (минус) — гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.

Таблица 5

Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.

Реакцию считают:

— положительной — при задержке гемолиза на два-четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);

— отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.

7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном (О-ПС)

7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антител и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.

7.6.2 Приготовление 0,8%-ного агар-агара и подготовка чашек Петри

Для приготовления 200 см агара 17 г хлористого натрия и 1,6 г микробиологического агар-агара переносят в стеклянную колбу вместимостью 500 см , добавляют 200 см дистиллированной воды.

Колбу закрывают непромокаемым материалом (пергаментной бумагой, фольгой и т.п.) и помещают на водяную баню, которую также накрывают для предотвращения испарения воды при кипении водяной бани. Для полного расплавления агара колбу выдерживают в водяной бане в течение 35-45 мин с момента закипания воды. В чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность, вносят по 14-18 см расплавленного агара. Чашки оставляют в течение 1 ч с приоткрытыми крышками. После застывания агара чашки Петри закрывают крышками и помещают в холодильник при температуре от 2°С до 8°С, хранят не более 5 сут.

При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм, остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).

7.6.3 Проведение исследования

7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных; для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.

Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4°С до 8°С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.

7.6.3.2 Реакцию иммунодиффузии проводят в чашках Петри. В центральную лунку вносят 0,02 см О-ПС антигена, а в периферические — по 0,04 см исследуемых сывороток крови.

На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (преципитирующей).

После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18°С до 26°С.

7.6.4 Обработка результатов

7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.

Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.

Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат повторному исследованию.

Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.

При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.

7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза

а) крупного рогатого скота в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза, исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;

— для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

б) северных оленей в случаях:

1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллезные вакцины не применяют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);

3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:

— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;

— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;

1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:

— при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);

2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:

— для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес, только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

— для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями;

3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:

— с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес, только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;

— при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА, РСК (РДСК).

7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с R -бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза собак, вызываемым B.canis

7.7.1 Подготовка к исследованию

7.7.1.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия

В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5 г хлористого натрия. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С и используют в течение 1 мес.

7.7.1.2 Приготовление 0,8%-ного геля агара по 7.6.2

7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.

7.7.2 Проведение исследования

Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб — диаметром 40 мм, для исследования 6-40 проб — диаметром 90 мм.

В центральную лунку геля вносят 0,02 см антигена, в периферические — по 0,04 см исследуемых проб сыворотки крови.

В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R -бруцеллезной сывороткой для РИД.

Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18°С до 26°С.

7.7.3 Обработка результатов — по 7.6.4.

7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

7.8.1 Сущность метода

Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.

7.8.2 Подготовка к исследованию

7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси

В фарфоровую чашку вместимостью 300-500 см помещают 5 г тонкоизмельченного в фарфоровой ступке двухромовокислого калия или 6 г бихромата натрия, добавляют 100 см концентрированной технической серной кислоты и осторожно нагревают на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (бихромата натрия). Хромовую смесь хранят при комнатной температуре до момента изменения цвета с темно-оранжевого до темно-зеленого.

7.8.2.3 Подготовка планшетов

Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.

Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.

При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.

Реакцию ставят на 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую регидратируют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором хлористого натрия.

7.8.3 Проведение исследования

Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.

Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.

Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.

Реакцию проводят в объеме 0,55 см (0,5 см разведения сыворотки и 0,05 см антигена) в пробирках Флоринского.

При массовых исследованиях постановку реакции можно проводить с использованием исследуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания исследуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см вносят в лунки планшетов и добавляют в них по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

В каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см антигена в рабочем разведении.

Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 26°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.

Сыворотки от неиммунизированного или иммунизированного неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разведения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разведение 1:50 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирку с 4,9 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия или по 0,05 см сыворотки и 2,45 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, если используются пробирки вместимостью до 5 см .

Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное разведение 1:12,5 готовят путем внесения 0,2 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,3 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.

Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до 60°С-62°С в течение 30 мин.

При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении, для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.

Все сыворотки (исследуемые и контрольные) проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.

В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0,5 см и пятого ряда по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.

В лунки первого ряда добавляют по 0,5 см , а в лунки пятого ряда по 0,25 см исследуемых и контрольных сывороток в исходном разведении. После смешивания путем пипетирования по 0,5 см разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго — в лунки третьего, из лунок третьего — в лунки четвертого, из лунок четвертого ряда по 0,5 см разведенных сывороток удаляют.

Во все лунки первых четырех рядов с разведенными сыворотками добавляют по 0,05 см антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и 0,85%-ного раствора хлористого натрия. В лунки пятого ряда вносят 0,05 см взвеси несенсибилизированных эритроцитов в рабочем разведении (один объем несенсибилизированных эритроцитов + один объем 0,85%-ного раствора хлористого натрия).

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 24°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.

Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.

Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2°С до 8°С и на следующий день исследуют.

После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1,5-2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.

7.8.4 Обработка результатов

Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:

«++++» (четыре креста) — 100%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде «зонтика»;

«+++» (три креста) — 75%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов;

«++» (два креста) — 50%-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него;

«+» (один крест) — на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета;

«-» (минус) — эритроциты оседают в виде компактной «пуговки» или колечка.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста («++»), один крест («+») и минус («-«) считают отрицательными.

7.9 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Сущность метода заключается в выявлении в образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.

7.9.1 Подготовка к исследованию

7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т

ФСБ-Т — концентрированный раствор буфера (флакон N 1) разводят в 25 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата в объеме 26 см переносят в мерную колбу и доводят объем до 650 см дистиллированной водой. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают. В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отбирают необходимое для данного исследования количество составных частей ФСБ-Т в соответствии с таблицей 6.

Таблица 6 — Разведения ФСБ-Т

источник