Используемые в настоящее время методы диагностики инфекционных заболеваний направлены в основном на определение возбудителя заболевания и его антигенов либо на выявление иммунного ответа инфицированного организма на антигены возбудителя. К последнему типу относятся методы серодиагностики – определения специфических антител в крови. Несмотря на то, что современные аналитические методы обеспечивают крайне низкий предел обнаружения, в ряде случаев серодиагностический подход оказывается предпочтительным. Гуморальный иммунный ответ всегда сопровождается значительным повышением концентрации специфических антител в крови, делая сыворотку крови универсальным материалом для диагностики разнообразных инфекционных заболеваний [1].
Серодиагностический подход наиболее оправдан при первичных обследованиях, а поскольку для массового скрининга решающее значение имеет скорость получения результата, представляется перспективным сочетание серодиагностики с таким простым и экспрессным методом, как иммунохроматографический анализ (ИХА). Результат ИХА может быть получен за 10–15 мин непосредственно на месте отбора пробы, без дополнительного оборудования и привлечения высококвалифицированного персонала.
Существенным ограничением для применения иммунохроматографии в серодиагностике является необходимость без разделения реагентов выявлять специфические антитела на фоне многократного избытка неспецифических антител. В настоящей работе на примере тест-системы для определения специфических антител против липополисахарида (ЛПС) Brucella abortus рассматривается подход, позволяющий обойти данное ограничение.
1. Реагенты. В работе использовались кроличьи (RABIss) антитела против иммуноглобулинов крупного рогатого скота производства ООО «Имтек» (Россия), твин-20, азид натрия – «Sigma» (США), золотохлористоводородная кислота – «Fluka» (Германия), бычий сывороточный альбумин (БСА) – «MP Biomedicals» (США). Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия). Панель сывороток коров и липополисахарид Brucella abortus были предоставлены Национальным центром биотехнологии Республики Казахстан (Астана, Казахстан). Наличие или отсутствие противобруцеллезных антител в сыворотках было подтверждено методом иммуноферментного анализа. ЛПС получен методом водно-фенольной экстракции [7].
Все соли были аналитической или химической чистоты. Воду для приготовления растворов очищали на установке MilliQ («Millipore», США).
2. Иммуноферментная детекция специфических антител к ЛПС Br. abortus в сыворотках крупного рогатого скота. Сорбцию препарата ЛПС в лунках 96-луночного микропланшета «Greiner» (Германия) осуществляли в течение ночи при 4 °С из 100 мкл раствора с концентрацией 1 мкг/мл в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9,6. Микропланшет четырехкратно отмывали 50 мМ К-фосфатным буфером, рН 7,4, с 0,1 М NaCl и 0,05 % Тритона Х-100 (PBST), после чего в лунки вносили по 100 мкл сывороток, разбавленных PBST от 1:100 до 1:100,000 с шагом 2, и инкубировали 1 час при 37 °С. Затем микропланшет повторно отмывали, добавляли по 100 мкл раствора в PBST моноклональных антител против IgG крупного рогатого скота, меченных пероксидазой хрена (160 нг/мл), и инкубировали 1 час при 37 °С. После отмывки микропланшета (трижды PBST и один раз – дистиллированной водой) определяли пероксидазную активность связавшейся с носителем ферментной метки. Для этого в лунки микропланшета вносили по 100 мкл субстратного раствора АБТС (0,4 мг/мл) в 50 мМ Na-ацетатном буфере, рН 4,5, с 0,01% Н2О2, инкубировали 15 мин при комнатной температуре и измеряли оптическую плотность при 405 нм (ОП405).
3. Получение коллоидного золота [6]. К 97,5 мл воды добавляли 1,0 мл 1 %-ного раствора золотохлористоводородной кислоты. Смесь доводили до кипения и при перемешивании добавляли 1,5 мл 1 %-ного раствора цитрата натрия. Кипятили 30 мин, затем охлаждали до комнатной температуры.
4. Нанесение реагентов на иммунохроматографические мембраны. Конъюгат коллоидного золота с ЛПС наносили на стекловолоконную мембрану в разведении, соответствующем ОП520=2,0, в объеме 11 мкл на 1 см полосы с помощью диспенсера IsoFlow фирмы «Imagene Technology» (США).
Для формирования аналитической зоны использовали препарат ЛПС Br. abortus. На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата (1,0 мг/мл в дистиллированной воде).
5. Изготовление иммунохроматографических тест-систем [4, 5]. Полученные подложки и рабочие мембраны сушили на воздухе при 20–22 °C не менее 20 ч. Собирали мультимембранный композит, из которого получали полоски шириной 3,5 мм, используя автоматический гильотинный нарезчик Index Cutter-1 (“A-Point Technologies”, США). Тест-полоски помещали в пластиковые кассеты и герметично упаковывали в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги с силикагелем в качестве осушителя с помощью запаивателя с миниконвейером FR-900 (“Wenzhou dingli packing machinery”, Китай).
Традиционная схема иммунохроматографического анализа, применяемая для серодиагностики, предполагает взаимодействие всех антител, содержащихся в пробе, с конъюгатом коллоидного золота и реагента для связывания антител (обычно в качестве такового реагента используют антивидовые антитела, белок А Staphylococcus aureus или белок G Streptococcus spp.). После связывания части иммуноглобулинов в пробе конъюгат диффундирует по тест-полоске, и в аналитической зоне небольшая часть связанных иммуноглобулинов, специфичных к патогену, взаимодействует с иммобилизованным в аналитической зоне антигеном. Таким образом, сигнал ИХА (степень связывания окрашенной метки в аналитической зоне) в этом случае зависит не только от концентрации специфических антител, но и от общего содержания иммуноглобулинов в пробе, что не является диагностически значимым параметром и негативно сказывается на достоверности диагностики. Этот принцип лежит в основе разработанных на сегодняшний день ИХА тестов для серодиагностики бруцеллеза [2, 3].
В настоящей работе использован альтернативный подход, основанный на применении поливалентности антител. В данном формате ИХА коллоидное золото конъюгируется с тем же антигеном, который иммобилизован в аналитической зоне. Специфические антитела взаимодействуют разными валентностями с молекулами антигена, иммобилизованными на разных поверхностях: коллоидного золота и рабочей мембраны. В таком случае во взаимодействии принимают участие только специфические антитела.
В качестве антигена был использован ЛПС Br. abortus. Для определения предела обнаружения иммунохроматографических тестов использовали моноклональные антитела против ЛПС Brucella abortus. Чувствительность тестов составила 5 мкг/мл антител – как в буферном растворе, так и в сыворотке крупного рогатого скота, несмотря на то, что сыворотка содержит более 5 мг/мл общих иммуноглобулинов (рис. 1). Таким образом, предложенная тест-система позволяет выявлять менее 0,1 % специфических антител в пробе.
Рис. 1. Иммунохроматографическое выявление специфических антител (5 мкг/мл): А – в фосфатном буфере (pH 7,4); Б – в сыворотке крови крупного рогатого скота. АЗ – аналитическая зона, КЗ – контрольная зона
Разработанный тест был испытан на выборке из 39 коров, больных бруцеллезом. Данные иммунохроматографического тестирования сравнивали с данными иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве унифицированной характеристики количества специфических антител в сыворотке использовали величину ее разведения, которая на асимптотической кривой титрования в ИФА соответствует оптической плотности 0,7. Полученные результаты приведены в табл. 1. Как видим, данные, полученные двумя методами, хорошо согласуются друг с другом.
Таблица 1. Результаты тестирования сывороток коров методами ИФА и ИХА
источник
научная статья по теме РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ДЕТЕКЦИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА И КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Химия
Авторы работы:
Научный журнал:
Текст научной статьи на тему «РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ДЕТЕКЦИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА И КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА»
ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 6, с. 653-661
РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ДЕТЕКЦИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА И КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
© 2012 г. Н. А. Вызова*, А. В. Жердев*, С. З. Ескеидирова**, К. К. Балтии**, Г. Б. Унышева**, К. К. Муканов**, Е. М. Раманкулов**, Б. Б. Дзаитиев*
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071, e-mail: nbyzova@inbi.ras.ru **Национальный центр биотехнологии РК, Астана, Казахстан, 010000 Поступила в редакцию 16.04.2012 г.
Разработан экспресс-метод детекции поверхностного липополисахаридного антигена и клеток возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота, представляющий собой иммунохроматографический анализ в «сэндвич»-формате. Контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами инициирует движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимические взаимодействия и формирование окрашенных зон. Показано, что данный метод позволяет за 10 мин определять липополисахаридный антиген клеточной стенки возбудителя бруцеллеза в концентрациях до 10 нг/мл и клетки Brucella abortus в концентрациях до 106 кл./мл (5 х 104 кл. в пробе). Подтверждена специфичность иммунодетекции. Разработанная тест-система может быть использована при внелабораторной экспресс-диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота.
Во многих странах бруцеллез наносит значительный экономический ущерб, обусловленный заражением сельскохозяйственных животных и частыми случаями инфицирования людей [1, 2]. Высока актуальность этой проблемы, в частности, для России и Казахстана [3—6].
Одним из основных направлений в борьбе с бруцеллезом является своевременное выявление очагов инфекции, эффективность которого связана с достоверной, оперативной и информативной лабораторной диагностикой заболевания. Для диагностики бруцеллеза в настоящее время используют бактериологические, биологические, молекулярные и серологические методы, каждый из которых обладает своими достоинствами и ограничениями [7].
Бактериологический метод при положительном результате обеспечивает наиболее достоверную лабораторную диагностику бруцеллеза. Дополнительное преимущество метода заключается в возможности идентификации возбудителя до биовара, что позволяет установить источник инфекции и наметить наиболее эффективные противоэпидемические и профилактические мероприятия. Вместе с тем недостатками метода являются длительность получения результатов, трудоемкость и опасность для персонала, низкая производительность и другие факторы [7, 8].
Биологический метод основан на избирательном накоплении возбудителя бруцеллеза в организме восприимчивых к нему лабораторных животных при парентеральном введении исследуемого материала, в том числе загрязнен-
ного посторонней микрофлорой. Метод несколько более чувствителен, чем бактериологический, при работе с высоковирулентными штаммами бру-целл, но малопригоден при исследовании материала, содержащего возбудитель с ослабленной вирулентностью. В остальном биологический метод сохраняет недостатки бактериологического.
Для детекции и идентификации бруцелл и лабораторного подтверждения диагноза используют также метод полимеразной цепной реакции, позволяющий в течение 5—6 ч определить наличие специфической последовательности ДНК бруцелл в пробах [9]. К ограничениям метода следует отнести длительность, повышенные требования к условиям проведения лабораторного тестирования и квалификации персонала.
Серологические методы позволяют фиксировать наличие антигенсодержащего материала или антител к нему, не прибегая к изоляции болезнетворного агента. В отличие от бактериологического и биологического методов, достоверность которых вытекает из факта выделения бруцелл, серологические тесты представляют доказательства присутствия в исследуемом материале искомого агента на основе специфического взаимодействия антиген—антитело. Важным преимуществом этих методов перед первыми является возможность детекции не только корпускулярных, но и субкорпускулярных и растворимых антигенов (т.е. циркулирующих в организме или выводимых из него фрагментов возбудителя). К настоящему времени предложены и используются разнообразные серологические тесты, позволяю-
щие выявлять как антигены бруцелл, так и специфические антитела: реакция агглютинации [10, 11], реакция связывания комплемента [12], имму-нодиффузия [10], иммунофлуоресцентный анализ [13], иммуноэлектрофорез [14], радиоиммунный анализ [15], иммуноферментный анализ (ИФА) [16—18], дот-иммуноанализ [19]. Многообразие серологических методов обусловлено, главным образом, стремлением повысить их достоверность и информативность. Исходя из этого, обычно используют не один серологический тест, а несколько дополняющих друг друга тестов [20].
Выбор оптимального формата иммуноанализа основывается прежде всего на его экспрессности и пределе детекции. Исходя из этих критериев, несомненными преимуществами обладают активно разрабатываемые в последнее время имму-нохроматографические методы анализа [21]. При проведении иммунохроматографии контакт пробы с тест-полоской инициирует движение реагентов по мембранам тест-полоски и все происходящие при этом специфические реакции. Вызываемое окрашивание определенных зон тест-полоски позволяет сделать вывод о результатах тестирования, в том числе исходя из визуальной оценки интенсивности окрашивания. Таким образом, иммунохроматография обеспечивает возможность проведения быстрого (5—15 мин) и нетрудоемкого анализа, который может быть реализован непосредственно на месте отбора пробы [22]. Для документирования результатов иммуно-хроматографии и при необходимости их последующей количественной оценки могут быть дополнительно использованы различные портативные средства видеорегистрации — как специализированные устройства, так и серийные сканеры и мобильные телефоны [23, 24].
Цель исследования — разработка и характеристика экспрессного иммунохроматографическо-го анализа (ИХА) для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота (КРС), основанного на определении в биоматериале клеток возбудителя бруцеллеза Brucella abortus и его специфического антигена — липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки.
Реактивы. В работе применяли антитела козы (GAMIss), кролика (RAMIss) и овцы (SAMIss) против IgG мыши и антитела овцы (SARIss) против IgG кролика («Имтек», Россия), антитела козы (GAMI) против IgG мыши («Arista Biologicals», США), конъюгат антител быка против IgG мыши с пероксидазой («Медгамал», Россия), трис, Тритон Х-100, дигидрохлорид 3,3′,5,5′-тетраметил-бензидина, N-гидроксисукцинимидный эфир биотина, цитрат натрия, азид натрия, фетальную сыворотку КРС («Sigma», США), золотохлори-
стоводородную кислоту («Fluka», Германия), ди-метилсульфоксид (ДМСО), Твин-20, БСА («MP Biomedicals», Великобритания). Все вспомогательные реагенты (соли, кислоты, щелочи, органические растворители) были аналитической или химической чистоты.
Растворы для получения коллоидного золота (КЗ) и его конъюгатов готовили на деионизиро-ванной воде (18.2 Mfi cm при 25°С, система Simplicity, «Millipore», США).
ИФА проводили в 96-луночных прозрачных полистироловых микропланшетах Costar 9018 («Corning Costar», США). Для изготовления им-мунохроматографических тест-полосок использовали наборы mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающие рабочую мембрану, закрепленную на твердой основе, подложку для коллоидного конъюгата, мембрану для нанесения пробы, конечную адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку.
В работе также использовали коммерческий препарат единого бруцеллезного антигена Brucella abortus 19 производства НПО «Антиген» Алма-ты, Казахстан (концентрация клеток 1010 кл./мл).
Выращивание культуры клеток B. abortus 19.
Культуру клеток B. abortus 19 выращивали на эритрит-агаре при 37°С в течение 3—4 сут. Клетки смывали стерильным физиологическим раствором, рН 7.0—7.2, фильтровали и прогревали при 80°С в течение 1 ч для инактивации бруцелл. Для отделения бактериальной массы взвесь центрифугировали при 3000 g в течение 10—15 мин. На-досадочную жидкость отделяли, а осадок использовали для получения ЛПС клеточной стенки бруцелл.
Получение бактериальных препаратов. При характеристике специфичности тест-систем были использованы клетки B. suis, Yersinia enterocolitica O:9 R, O:9 S и 287, Francisella tularensis, Vibrio chol-erae Inaba, Salmonella enteritidisyena, S. typhimurium TA 100, Escherichia coli 565, E. coli 113-3, Shigella sonne, S. flexneri, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii в концентрациях 109—1010 кл./мл, подвергнутые термообработке при 80°С в течение 1 ч.
Выделение ЛПС антигена B. abortus. ЛПС бруцелл получали методом водно-фенольной экстракции. Инактивированную клеточную массу B. abortus 19 экстрагировали водно-фенольной смесью (объемное соотношение вода—фенол = 1 : 1) 15 мин при 70°С, после охлаждения центрифугировали при 1100 g в течение 1 ч. Отделяли феноль-ный слой, повторяли экстракцию в таком же режиме, объединяли фенольные фазы и диализова-ли их против воды. Содержание углеводов определяли фенольно-серным методом [25], а затем концентрировали препарат до 1 мг/мл. К полученному препарату антигена добавляли азид
натрия до конечной концентрации 0.1% и хранили при 2—4°С.
Получение моноклональных антител. Иммунизация включала 5 внутрибрюшинных инъекций препарата ЛПС B. abortus 54 мышам BALB/c (первая — в смеси с полным адъювантом Фрейнда и 4 последующих — в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7.4, с 0.1 М NaCl, ФБС). Дозы иммуногена на животное составляли 100 мкг. Титр специфических антител определяли методом ИФА. Для получения иммунных спленоцитов использовали мышей с максимальным титром.
Через 3 сут после последней иммунизации выделяли спленоциты и смешивали их с миеломными клетками линии X63-Ag-8.653. Селекцию гибридом проводили в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Для культивирования клеток использовали среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки плода КРС.
Начиная с 10 сут после слияния клеток, суп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.
ЖЕЛУДКОВ М.М., ЦИРЕЛЬСОН Л.Е. — 2010 г.
БЫЗОВА Н.А., ДЗАНТИЕВ Б.Б., ЖЕРДЕВ А.В., САДЫХОВ Э.Г., СВЕШНИКОВ П.Г. — 2015 г.
АТАБЕКОВ И.Г., БЛИНЦОВ А.Н., БЫЗОВА Н.А., ДЗАНТИЕВ Б.Б., ЖЕРДЕВ А.В., САФЕНКОВА И.В., ЧИРКОВ С.Н. — 2009 г.
БУРАКОВСКИЙ А.И., БЫЗОВА Н.А., ДЗАНТИЕВ Б.Б., ЖЕРДЕВ А.В., ЛУХВЕРЧИК Л.Н., ПИВЕНЬ Н.В. — 2013 г.
источник
Что представляет собой иммунохроматографический анализ (ИХА)? Разберемся подробнее в этом вопросе.
ИХА – иммунохимический способ анализа, который основан на методе тонкослойной хроматографии. Он включает реакцию между соответствующим антителом и антигеном в биологических материалах. Осуществляется посредством особых тест-полосок, тест-кассет или панелей. ИХА – это экспресс-тест.
Действие его основывается на том, что при погружении в биологическую жидкость (либо другой жидкий образец) теста она начинает двигаться вдоль полоски по методу тонкослойной хроматографии. Движутся вместе с ней нанесенные на нее специфические меченые антитела, которые связываются аффинно с анализируемым компонентом.
Различаются два формата анализа: прямой и конкурентный метод.
В формате сэндвичного (прямого) иммунохроматографического анализа крови используется конъюгат антитела-метки, который наносится для конъюгата на мембрану. Иммобилизованные антитела на полоске, обладающие конкретным аналитом, на контрольной линии – антитела антивидовые, специфические к антителам первичным.
При внесении образца, в котором содержится конъюгат (искомое вещество), на мембрану, связывается искомый компонент с конъюгатом Ат-метки. После этого сформированный иммунный комплекс проникает в тестовую зону, где происходит связь со специфическими антителами, и образуется «сэндвич» Ат- Аг-Ат-метка. Затем чрезмерное количество не связавшегося конъюгата соединяется на контрольной линии с антивидовыми антителами. Если на тест-полоске появляются две линии, то результат теста положительный. Если аналит отсутствует в образце, то связывается конъюгат с антивидовыми антителами лишь на контрольной линии, и образуется одна линия.
Прямой ИХА применяется для определения возбудителей инфекционных патологий, вирусов – высокомолекулярных соединений, включая разные гормоны, ВИЧ.
Способ конкурентного иммунохроматографического анализа применяется для установления низкомолекулярных соединений. Основан он на конкуренции иммобилизованного конъюгата аналит и аналита: носитель-белок за ограниченное число центров связывания периферических антител, которые содержатся в конъюгате Ат-метка. Когда наносится образец, содержащий аналит, то последний связывается на мембране с конъюгатом с конъюгатом Ат-метка. Иммунокомплекс в дальнейшем проходит через тестовую зону, в которой иммобилизуется конъюгат аналит, то есть белок-носитель.
С этим конъюгатом не может связаться иммунокомплекс из-за стерических сложностей: низкомолекулярные соединения чаще всего обладают одной антигенной детерминантой, таким образом, у иммуноглобулинов есть один центр связи с антигеном, который уже занят до этого аналитом. Иммунный комплекс впоследствии связывается антивидовыми иммуноглобулинами, которые находятся на контрольной линии. Если в тестовой области отсутствует окрашенная полоса и есть окраска в контрольной зоне, это говорит о том, что содержание определяемого компонента в исследуемом образце выше порогового значения для такого теста. Если в аналите отсутствует анализируемое вещество в образце, то происходит связь конъюгата Ат-метка с конъюгатом Аг: носитель-белок, иммобилизованный в области тестовой линии. Ат-метка свободный конъюгат попадает в сферу контрольной линии, где связывается с антивидовыми антителами. Если есть две окрашенные линии (контрольная и тестовая), то можно говорить об отрицательном результате теста.
Метод конкурентного ИХА применяется для определения низкомолекулярных соединений, включая тканевые экстракты.
Преимущество такого способа – легкость и быстрота использования, возможность применения неприборных методов ИХА с оценкой результата визуально. Не требуется дополнительное оборудование, и анализ может провести человек без медицинского образования в любое время.
В иммунохроматографическом анализе в качестве меток применяются разные частицы и вещества.
- Красители (частицы крашеного латекса, или наночастицы углерода, или коллоидного золота). Такой вариант позволяет визуально отслеживать результат или определить колориметрическим прибором. Применение красящих меток, которые присоединяются к носителю, позволяет делать мультианализ, где разноцветные линии соответствуют разным аналитам. Используемой меткой чаще всего выступают наночастицы золота коллоидного.
- Связанные ковалентно с латексными частицами биолюминесцентные, фосфоресцентные и флуоресцентные метки. Применяются лишь в приборных способах ИХА, в которых регистрируется результат особым ридером. Наиболее распространенными являются флуоресцентные метки.
- Парамагнитные метки, закрепленные на латексных частицах. Метод применяется в ИХА с использованием приборов, которые регистрируют силу магнитного поля.
- Липосомы, используемые в качестве носителей разных меток (электроактивных, ферментативных, флуоресцентных, красящих и т. д.) Это новое направление среди разновидностей анализа.
- Ферментные метки, применяемые по принципу ИФА. Регистрация реакции проводится посредством окрашивания субстратов. В итоге получается визуальный результат, либо считывается ридером.
Главными преимуществами применения метода иммунохроматографического анализа становятся:
- Удобство и простота – позволяет получить результат (первичное представление и анализ причины болезни) без специальных навыков и оборудования.
- Надежность – достоверность тестов достигает 99,8 %, каждый тест при этом имеет внутренний встроенный контроль.
- Анонимность – это особенно важно при определении болезней, передаваемых половым путем, прочих инфекционных болезней, а также установлении употребления наркотических веществ.
- Экономичность – приобрести тест может каждый, экономится время на проведение анализа.
- Независимость – не нуждается в предварительной консультации и рецепте врача.
Самой популярной услугой становится анализ мочи на наркотики посредством метода иммунохроматографического анализа. Это позволяет исследовать мочу на 14 видов нарковеществ.
Иммунохроматографический анализ на наркотики также считается экспресс-методом диагностики. Результат теста можно узнать спустя 15 минут. Для проведения данного исследования используют особые тест-полоски, которые пропитаны веществами-индикаторами. Если в моче имеются следы наркотического вещества, цвет полоски меняется. Основной недостаток такого анализа – невозможность определить, какова концентрация вещества и степень наркотического опьянения, таким образом, результаты иммунохроматографического анализа в качестве доказательства в суде использовать не получится.
Если на индикаторах появились две розовые полосы, то делается заключение, что в моче не содержится наркотик, или же его концентрация недостаточна для определения иммунохроматографическим методом. При возникновении одной розовой полосы можно говорить о наличии наркотического вещества: марихуаны, производных эфедрона, опиатов, производных барбитуровой кислоты, амфетаминов, кокаина, фенциклидина, бензодиазепинов, экстази.
Иммунохроматографический анализ (экспресс-тест) является эффективным средством диагностики, он позволяет визуально на протяжении нескольких минут выявить и оценить концентрацию антигенов, гормонов, антител и других диагностически важных компонентов в человеческом организме. Экспресс-тесты имеют высокую степень точности и чувствительности, обнаруживается более ста видов болезней, а также весь спектр наркотических веществ, и достоверность анализа очень высокая.
источник
Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.
Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.
Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.
Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО2.
БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.
АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.
Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека
Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.
Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).
Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.
Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.
С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.
Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.
Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.
Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.
Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.
Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.
Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.
источник
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Animals. Laboratory diagnostics of brucellosis. Serological methods
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г. N 99-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. N 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:
— реакция агглютинации с S — и R -бруцеллезными антигенами;
— пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);
— реакция связывания комплемента;
— реакция длительного связывания комплемента на холоде;
— реакция непрямой гемагглютинации;
— реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;
— реакция иммунодиффузии в геле агара с R -бруцеллезным антигеном;
— кольцевая реакция с молоком;
— иммуноферментный анализ;
— иммунохроматографический анализ.
Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.0.004-2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия
ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия
ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия
ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
— РА — реакция агглютинации;
— РСК — реакция связывания комплемента;
— РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;
— РДСК — реакция длительного связывания комплемента;
— РИД — реакция иммунодиффузии;
— ЛПС — липополисахаридный антиген;
— О-ПС — олигополисахаридный антиген;
— РНГА — реакция непрямой гемагглютинации;
— КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;
— ИФА — иммуноферментный анализ;
— ИХА — иммунохроматографический анализ;
— PKг-G — раствор конъюгата, конъюгированного с пероксидазой;
— ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с твином;
— РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;
— ТМБ-субстрат — тетраметилбензидин-субстрат;
— К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);
— К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.
4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности*, изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
________________
* Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008.
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0.004.
4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0,2) МПа и температуре (132±2)°С.
При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животных:
— pH-метр с точностью калибровки ±0,1 ед.pH при температуре от 20°С до 55°С;
— спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм, разрешением 1 нм и точностью ±2 нм;
— пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см по ГОСТ 29230;
— колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;
— центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000-3000 об/мин;
— автоклав лабораторный;
— термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С;
— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100°С;
— холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317;
— насос вакуумный;
— иглы препаровальные;
— штамп для формирования лунок в агаре;
— осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0-360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;
— чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;
— чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;
— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:
1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;
2) пипетка-капельница для дозирования антигена;
3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;
4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;
— пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);
— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;
— групповые дозаторы Флоринского;
— пробирки серологические Флоринского;
— микропипетки вместимостью от 0,1 до 0,5 см ;
— дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;
— наконечники для дозаторов вместимостью 0,2; 0,5; 1,0 см ;
— фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;
— бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;
— салфетки марлевые;
— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
— вода дистиллированная по ГОСТ 6709;
— кислота соляная по ГОСТ 3118 х.ч;
— фенол по ГОСТ 23519 — 5%-ный раствор;
— формалин по ГОСТ 1625 — 1%-ный и 10%-ный растворы;
— натрий хлористый по ГОСТ 4233;
— кислота борная по ГОСТ 18704 — 3%-ный раствор;
— натрия бихромат по ГОСТ 2651;
— калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;
— кислота серная по ГОСТ 4204;
— натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
— сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;
— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;
— кровь барана-донора;
— свинки морские массой 300-400 г;
— сыворотки крови животных;
— набор для ИФА, содержащий в своем составе:
1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella ;
7) флакон N 6 — ТМБ-субстрат;
8) флакон N 7 — стоп-реагент объемом 6 см ;
— тест-система для определения антител к ЛПС антигену В.abortus и В. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА, содержащая в своем составе компоненты:
1) К — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;
2) К — буферный раствор для разведения проб объемом 0,8 см ;
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных);
— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);
— роз бенгал антиген для РБП;
— антиген бруцеллезный для КР с молоком;
— 0,85%-ный раствор хлористого натрия;
— 0,85%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
— 5%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
— 10%-ный раствор хлористого натрия с 0,5% фенола;
— раствор хлорамина 5%-ный;
— взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
— молоко от здоровой коровы (буйволицы);
— набор для РИД, содержащий в своем составе:
1) О-ПС бруцеллезный антиген;
3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;
— набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:
1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;
2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
4) сыворотку негативную.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.
6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4°С-10°С. Через 20-24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3-4 ч и повторно через 10-12 ч).
6.1.2 Консервирование сывороток проводят:
— добавлением 0,05 см (1 капля) 5%-ного раствора фенола на 1 см сыворотки при тщательном перемешивании;
— сухой борной кислотой (3-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
— путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2°С до 8°С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут, замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.
6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10-15 см . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10%-ного раствора формалина на 5 см молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2-3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.
6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т.к. антиген обесцвечивается.
6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.
7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.
7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)
7.2.1 Сущность метода
Сущность метода заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.
7.2.2 Подготовка к исследованию
7.2.2.1 Приготовление 5%-ного раствора хлорамина
Для приготовления 5%-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.
Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним.
7.2.2.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.
Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.
Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18°С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.
7.2.3 Проведение исследования
7.2.3.2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0,03 см антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0,015 см антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.
Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.
В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 см 0,85%-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0,03 см роз бенгал антигена).
По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5%-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37°С-38°С и используют повторно.
7.2.4 Обработка результатов
Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.
Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).
При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА, или в ИХА.
7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком
Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров. Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.
КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.
Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.
7.3.1 Подготовка к исследованию
Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная. Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.
7.3.2 Проведение исследования
В пробирки вносят по 2 см молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0,1 см в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т.д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.
При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:
— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);
— смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0,1 см сыворотки на 2 см молока).
Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37°С-38°С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.
Результаты реакции учитывают визуально через 30-40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:
«+++» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;
«++» (два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;
«+» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет;
«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.
7.3.3 Обработка результатов
Все пробы молока с оценкой в «+++» (три креста) и «++» (два креста) считают положительными, «+» (один крест) — сомнительными.
При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР, исследуют на бруцеллез в РБП, или в РА и РСК (РДСК), или в РА и РИД, или в РНГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.
7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках
7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.
7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5%
В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5, 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С, и используют в течение 1 мес.
7.4.3 Проведение исследования
7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10%-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
7.4.3.2 Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в объеме 1 см :
— для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— для овец, коз, оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25, 1:50, 1:100 и 1:200;
— для собак с R -бруцеллезным антигеном ( B.canis ) — в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80.
Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.
7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:
— сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0,1 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25);
— сыворотки крови овец, коз и собак по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 5%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);
— сыворотку крови оленей и маралов по 0,2 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2,3 см фенолизированного 10%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12,5);
— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0,3 см вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 1,2 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);
— при исследовании с R -бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0,1 см вносят в пробирки, содержащие по 2,4 см фенолизированного 0,85%-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:25).
В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.
В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.
Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0,5 см исходного разведения сыворотки.
После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0,5 см переносят в пробирки четвертого ряда и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0,5 см жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.
7.4.3.4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0,5 см антигена в рабочем разведении 1:10 (1,0+9,0 см ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.
В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютинацию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают.
После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 16-20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях. Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского, или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0,02 и 0,01 см (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0,04 и 0,02 см при исследовании сывороток овец, коз, оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1,0 см антигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.
Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.
7.4.4 Обработка результатов
Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания, оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а жидкость остается прозрачной (100% агглютинации);
«+++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75% агглютинации);
«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50% агглютинации);
«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25% агглютинации);
«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME, 1:200 — 200 ME и т.д.).
Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75%, 50%, 25% и 0% просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно вносят 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 см антигена, разведенного 0,85%-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1,0 см в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75%, 50% и 25% просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см ).
Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.
7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец, коз, свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.
Сущность реакции состоит в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.
7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих антикомплементарными свойствами.
Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.
7.5.3 Подготовка к исследованию
7.5.3.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия
Для приготовления 1 дм раствора 8,5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6,8-7,2 ед.pH 5%-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0,85%-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.
20 — исходное разведение комплемента (1:20).
Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см (0,2·100), то к 0,6 см регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.
Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так, если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.
Эритроциты барана — 2,5%-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85%-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446 . Дефибринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата, растворенного в 10-20 см стерильного 0,85%-ного раствора хлористого натрия, на 100 см крови. Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10-14 сут.
Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2,5%-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37°С-38°С в течение 15-35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.
Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60°С-62°С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64°С-65°С, буйволов — 62°С-64°С, свиней — 58°С-60°С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63°С-64°С в течение 30 мин.
Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.
Таблица 1 — Проверка антикомплементарных и гемотоксических свойств компонентов реакций
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Комплемент в разведении 1:20
Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении
Антиген в рабочем разведении
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Водяная баня 10 мин при 37°С-38°С
Полная задержка гемолиза эритроцитов
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
7.5.4 Проведение исследования в РСК
При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).
Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:
— при массовом исследовании в одной пробирке к 0,05 см исследуемой сыворотки добавляют 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);
— при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0,1 см исследуемой сыворотки, добавляют 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0,5 см ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0,2 см во вторую пробирку и 0,1 см — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).
Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.
Сыворотку, 0,85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пипеточных дозаторов с наконечником.
Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
Таблица 2
При массовом исследовании
При исследовании в двух разведениях
пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)
пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)
Водяная баня 30 мин при 58°С-65°С
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
Примечание — Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки.
При постановке реакции ставят следующие контроли:
— негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);
— гемолитической системы (0,4 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;
— комплемента (0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз;
— антигена (0,2 см антигена в рабочем разведении, 0,2 см комплемента в рабочем разведении, 0,2 см 0,85%-ный раствор хлористого натрия и 0,4 см гемолитической системы) — полный гемолиз.
При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0,8 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, 0,2 см пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого, пятого и шестого рядов вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0,2 см в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0,2 см разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20, и так далее до шестого разведения 1:80. Из пробирок последнего ряда по 0,2 см разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0,2 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомплементарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.5.1 Подготовка к исследованию
Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 или 1:20 при титре 0,06-0,1 или в разведении 1:20-1:15 при титре 0,1-0,14.
Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.
Учет результатов титрования проводят немедленно после выемки штатива из водяной бани.
Таблица 3
Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С
Холодильник 16-18 ч при 2°С-6°С
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
7.5.5.2 Проведение исследования
Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4.
Таблица 4
При массовом исследовании
При исследовании в трех пробирках
пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)
пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Водяная баня 30 мин при 63°С-64°С
0,85%-ный раствор хлористого натрия
Антиген в рабочем раведении
Комплемент в рабочем разведении
Холодильник 2-6°С 16-18 ч и 20 мин при комнатной температуре
Гемолитическая система в рабочей дозе
Водяная баня 20 мин при 37°С-38°С
При постановке реакции ставят контроли:
— негативная и бруцеллезная сыворотки в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена;
— гемолитическая система в рабочей дозе без сыворотки, антигена и комплемента (0,6 см гемолитической системы и 0,6 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза;
— антиген с 0,85%-ным раствором хлористого натрия и гемолитической системой (0,2 см антигена в рабочем разведении; 0,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия и 0,6 см гемолитической системы) — полная задержка гемолиза.
7.5.6 Обработка результатов РСК и РДСК
Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках — через 3-4 ч, когда в контрольных пробах с бруцеллезной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками оставляют в холодильнике).
Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная, осадок 100% эритроцитов на дне пробирки;
«+++» (три креста) — гемолиз 25% эритроцитов, осадок 75% эритроцитов;
«++» (два креста) — гемолиз 50% эритроцитов, осадок 50% эритроцитов;
«+» (один крест) — гемолиз 75% эритроцитов, осадок 25% эритроцитов;
«-» (минус) — гемолиз 100% эритроцитов, осадок эритроцитов отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.
Степень гемолиза эритроцитов при необходимости определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из штатива выбирают пять пробирок с полным гемолизом, сливают их содержимое в одну и разводят по схеме, представленной в таблице 5.
Таблица 5
Процент гемолиза эритроцитов в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со шкалой.
Реакцию считают:
— положительной — при задержке гемолиза на два-четыре креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
— сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой в один крест в одном или двух разведениях сыворотки и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена);
— отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов в двух или трех пробирках.
7.6 Реакция иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном (О-ПС)
7.6.1 Сущность метода состоит в выявлении бруцеллезных антител, основанном на способности антител и антигена диффундировать в агаровом геле и при взаимодействии образовывать комплекс антиген-антитело, наблюдаемый в виде линии преципитации.
7.6.2 Приготовление 0,8%-ного агар-агара и подготовка чашек Петри
Для приготовления 200 см агара 17 г хлористого натрия и 1,6 г микробиологического агар-агара переносят в стеклянную колбу вместимостью 500 см , добавляют 200 см дистиллированной воды.
Колбу закрывают непромокаемым материалом (пергаментной бумагой, фольгой и т.п.) и помещают на водяную баню, которую также накрывают для предотвращения испарения воды при кипении водяной бани. Для полного расплавления агара колбу выдерживают в водяной бане в течение 35-45 мин с момента закипания воды. В чашки Петри, помещенные на горизонтальную поверхность, вносят по 14-18 см расплавленного агара. Чашки оставляют в течение 1 ч с приоткрытыми крышками. После застывания агара чашки Петри закрывают крышками и помещают в холодильник при температуре от 2°С до 8°С, хранят не более 5 сут.
При помощи штампа в геле агара делают отверстия (лунки). В каждой чашке прорезают не менее шести семилуночных розеток, каждая из которых состоит из семи лунок: одна лунка в центре диаметром 3 мм, остальные шесть лунок диаметром 5 мм по окружности, расстояние между центральной и периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют из лунок канюлей, соединенной с вакуумным или водоструйным насосом (или любым другим способом).
7.6.3 Проведение исследования
7.6.3.1 В РИД с О-ПС антигеном исследуют на бруцеллез сыворотку крови крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей с целью дифференциации животных, инфицированных от вакцинированных; для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе иерсиниями.
Для исследования используют сыворотки крови животных неконсервированные и консервированные. Не консервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 4°С до 8°С. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут; замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на бруцеллез не подлежат.
7.6.3.2 Реакцию иммунодиффузии проводят в чашках Петри. В центральную лунку вносят 0,02 см О-ПС антигена, а в периферические — по 0,04 см исследуемых сывороток крови.
На каждой чашке Петри ставят контроль с положительной бруцеллезной сывороткой (преципитирующей).
После внесения компонентов чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру (эксикатор) и выдерживают при температуре от 18°С до 26°С.
7.6.4 Обработка результатов
7.6.4.1 Учет результатов проводят визуально в косом проходящем свете с помощью осветителя через 24 и 48 ч после постановки реакции.
Линии преципитации между лунками с антигеном и исследуемой сывороткой, сформировавшиеся через 24 ч, свидетельствует о положительной реакции.
Сыворотки крови, давшие линию преципитации через 48 ч, подлежат повторному исследованию.
Линии преципитации, сформировавшиеся через 24 или 48 ч при повторном исследовании, свидетельствуют о положительной реакции.
При получении положительного результата в реакции иммунодиффузии, животное признают больным бруцеллезом.
7.6.4.2 Применение РИД с О-ПС антигеном при диагностике бруцеллеза
а) крупного рогатого скота в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых не применяли вакцины против бруцеллеза, исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
— для контроля эпизоотического состояния по бруцеллезу животных не ранее чем через 1,5 мес после вакцинации;
— для дифференциации положительных реакций, полученных в РА (не выше 200 ME) или (и) РСК (РДСК) не выше чем в разведении 1:10 по истечении 6 мес после введения вакцины;
3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых животных вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;
— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;
б) северных оленей в случаях:
1) в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых противобруцеллезные вакцины не применяют. Исследуют сыворотки крови животных, сомнительно или положительно реагирующие в РА и (или) РСК (РДСК);
3) в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, в которых вакцинируют против бруцеллеза агглютиногенными вакцинами:
— через 1,5 мес и далее один раз в месяц в течение 6 мес после иммунизации или реиммунизации с целью раннего выявления больных бруцеллезом животных;
— через 6 мес после иммунизации (реиммунизации) для оздоровления стада от бруцеллеза в комплексе мероприятий, предусмотренных по профилактике и борьбе с бруцеллезом;
1) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где противобруцеллезные вакцины не применяют:
— при исследовании сыворотки крови животных, сомнительно и положительно реагирующих в РА или (и) РСК (РДСК);
2) в благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах, где проводится иммунизация животных противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами:
— для дифференциальной диагностики бруцеллеза овец и коз не ранее чем через 5 мес, только после однократной их иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
— для дифференциации неспецифических реакций, обусловленных родственной с бруцеллами микрофлорой, в том числе и иерсиниями;
3) в неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота хозяйствах:
— с целью более раннего выявления больных бруцеллезом животных не ранее чем через 5 мес, только после однократной иммунизации противобруцеллезными агглютиногенными вакцинами;
— при снятии ограничений с неблагополучных по бруцеллезу хозяйств одновременно с РБП или РА, РСК (РДСК).
7.7 Реакция иммунодиффузии (РИД) с R -бруцеллезным антигеном при диагностике бруцеллеза собак, вызываемым B.canis
7.7.1 Подготовка к исследованию
7.7.1.1 Приготовление 0,85%-ного раствора хлористого натрия
В 1 дм дистиллированной воды растворяют соответственно 8,5 г хлористого натрия. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2°С до 20°С и используют в течение 1 мес.
7.7.1.2 Приготовление 0,8%-ного геля агара по 7.6.2
7.7.1.3 Пробы сыворотки крови от собак исследуют в РИД в свежем или консервированном виде.
7.7.2 Проведение исследования
Для постановки реакции иммунодиффузии используют биологические чашки Петри разного диаметра. Для исследования до четырех проб — диаметром 40 мм, для исследования 6-40 проб — диаметром 90 мм.
В центральную лунку геля вносят 0,02 см антигена, в периферические — по 0,04 см исследуемых проб сыворотки крови.
В каждой чашке ставят контроль антигена с негативной и R -бруцеллезной сывороткой для РИД.
Внутрь крышки каждой чашки вкладывают фильтровальной бумагу, вырезанную по размеру ее наружного диаметра, которую увлажняют фенолизированным 0,85%-ным раствором хлористого натрия. Чашку плотно прикрывают крышкой и оставляют при температуре от 18°С до 26°С.
7.7.3 Обработка результатов — по 7.6.4.
7.8 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
7.8.1 Сущность метода
Метод основан на выявлении бруцеллезным эритроцитарным антигеном специфических антител в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных вакцинами против бруцеллеза животных.
7.8.2 Подготовка к исследованию
7.8.2.2 Приготовление хромовой смеси
В фарфоровую чашку вместимостью 300-500 см помещают 5 г тонкоизмельченного в фарфоровой ступке двухромовокислого калия или 6 г бихромата натрия, добавляют 100 см концентрированной технической серной кислоты и осторожно нагревают на водяной бане до полного растворения двухромовокислого калия (бихромата натрия). Хромовую смесь хранят при комнатной температуре до момента изменения цвета с темно-оранжевого до темно-зеленого.
7.8.2.3 Подготовка планшетов
Планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 мин в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ершом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее 6 раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.
Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение одних суток, затем их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.
При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания хромовой смеси.
Реакцию ставят на 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Сыворотку бруцеллезную сухую регидратируют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором хлористого натрия.
7.8.3 Проведение исследования
Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сроки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.
Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследуют.
Реакцию ставят с использованием набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота для РНГА.
Реакцию проводят в объеме 0,55 см (0,5 см разведения сыворотки и 0,05 см антигена) в пробирках Флоринского.
При массовых исследованиях постановку реакции можно проводить с использованием исследуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания исследуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см вносят в лунки планшетов и добавляют в них по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
В каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см антигена в рабочем разведении.
Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 26°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.
Сыворотки от неиммунизированного или иммунизированного неагглютиногенными противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разведения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,4 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разведение 1:50 готовят путем внесения 0,1 см сыворотки в пробирку с 4,9 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия или по 0,05 см сыворотки и 2,45 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия, если используются пробирки вместимостью до 5 см .
Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное разведение 1:12,5 готовят путем внесения 0,2 см сыворотки в пробирки, содержащие 2,3 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
Одновременно с исследуемыми сыворотками аналогично готовят разведения контрольных сывороток: бруцеллезной и негативной.
Исследуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдерживают в водяной бане, нагретой до 60°С-62°С в течение 30 мин.
При получении положительного результата исследования сыворотки крови животных в одном разведении, для определения титра гемагглютининов в РНГА постановку реакции проводят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой сыворотки готовят заново.
Все сыворотки (исследуемые и контрольные) проверяют на отсутствие гемагглютинирующих свойств.
В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0,5 см и пятого ряда по 0,25 см 0,85%-ного раствора хлористого натрия.
В лунки первого ряда добавляют по 0,5 см , а в лунки пятого ряда по 0,25 см исследуемых и контрольных сывороток в исходном разведении. После смешивания путем пипетирования по 0,5 см разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго — в лунки третьего, из лунок третьего — в лунки четвертого, из лунок четвертого ряда по 0,5 см разведенных сывороток удаляют.
Во все лунки первых четырех рядов с разведенными сыворотками добавляют по 0,05 см антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и 0,85%-ного раствора хлористого натрия. В лунки пятого ряда вносят 0,05 см взвеси несенсибилизированных эритроцитов в рабочем разведении (один объем несенсибилизированных эритроцитов + один объем 0,85%-ного раствора хлористого натрия).
Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при температуре от 18°С до 24°С в течение 3-4 ч и проводят учет реакции.
Результат контроля на самоагглютинирующие свойства исследуемых и контрольных сывороток должен быть отрицательным.
Допускается постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведения исследуемых и контрольных сывороток крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при температуре от 2°С до 8°С и на следующий день исследуют.
После постановки реакции планшеты выдерживают в 1%-ном растворе хлорамина или другом антисептическом растворе 1,5-2,0 ч. Впоследствии их моют, как указано выше.
7.8.4 Обработка результатов
Реакции учитывают визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — 100%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде «зонтика»;
«+++» (три креста) — 75%-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хорошо выраженного «зонтика» меньшего диаметра, чем при оценке реакции на четыре креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов;
«++» (два креста) — 50%-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него;
«+» (один крест) — на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета;
«-» (минус) — эритроциты оседают в виде компактной «пуговки» или колечка.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация эритроцитов с оценкой четыре или три креста. Реакции с оценкой два креста («++»), один крест («+») и минус («-«) считают отрицательными.
7.9 Иммуноферментный анализ (ИФА)
Сущность метода заключается в выявлении в образце сыворотки крови животных иммуноглобулинов класса G к бактериям рода Brucella.
7.9.1 Подготовка к исследованию
7.9.1.2 Приготовление рабочего раствора ФСБ-Т
ФСБ-Т — концентрированный раствор буфера (флакон N 1) разводят в 25 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата в объеме 26 см переносят в мерную колбу и доводят объем до 650 см дистиллированной водой. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают. В случае использования одного или нескольких стрипов планшета в чистый флакон отбирают необходимое для данного исследования количество составных частей ФСБ-Т в соответствии с таблицей 6.
Таблица 6 — Разведения ФСБ-Т
источник