Ифа при бруцеллезе животных

Бруцеллез (лихорадка мальтийская, средиземноморская, гибралтарская, кипрская, ундулирующая, тифомалярийная, болезнь Банга) – инфекционное заболевание из группы бактериальных зоонозов, возбудителем которого являются микроорганизмы рода Brucella. Патогенными для человека являются В. melitensis, Br. abortus, Br. suis. Инфицирование человека происходит преимущественно алиментарным путем, реже контактным или аэрогенным. Представляет собой системное инфекционно-аллергическое заболевание со склонностью к хроническому рецидивирующему течению с преимущественным поражением опорно-двигательной, нервной и мочеполовой систем организма. В зависимости от клинической картины выделяют острую, подострую, хроническую и резидуальную форму бруцеллеза. Наиболее чувствительным в настоящее время является иммуноферментный анализ (ИФА), который рекомендуют в качестве экспресс-метода при массовых обследованиях.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Бруцеллез — зоонозная инфекция, характеризующаяся полиорганным поражением и склонностью к хронизации. Значимым патогенетическим компонентом бруцеллеза является аллергическая реактивность. Передача бруцелл происходит в основном пищевым и водным путем, наиболее часто через молоко и мясо зараженных животных. У скотоводов может реализоваться воздушный и контактный путь передачи бруцеллеза. Диагноз устанавливается при выявлении возбудителя в крови, пунктате лимфатического узла или цереброспинальной жидкости.

Заболевание вызывается неподвижными полиморфными грамположительными микроорганизмами рода Brucella. Вид бруцелл, вызывающих инфекцию, оказывает влияние на тяжесть течения, наиболее тяжело протекает бруцеллез, обусловленный заражением Brucella melitensis. Бруцеллы высокоинвазивны, размножаются внутри клеток организма хозяина, но способны сохранять активность и вне клетки. В окружающей среде устойчивы, сохраняются в воде более двух месяцев, три месяца — в сыром мясе (30 дней — в засоленном), около двух месяцев — в брынзе и до четырех — в шерсти животных. Губительно для бруцелл кипячение, нагревание до 60 °С убивает их через 30 минут.

Резервуаром бруцеллеза являются животные, источником заражения для человека преимущественно являются козы, овцы, коровы и свиньи. В некоторых случаях возможна передача от лошадей, верблюдов, некоторых других животных. Выделение возбудителя больными животными происходит с испражнениями (кал, моча), молоком, амниотической жидкостью. Передача инфекции осуществляется преимущественно фекально-оральным механизмом, чаще всего пищевым и водным путем, в некоторых случаях возможна реализация контактно-бытового (при внедрении возбудителя через микротравмы кожи и слизистых оболочек) и аэрогенного (при вдыхании инфицированной пыли) пути.

Значительную эпидемиологическую опасность представляют собой молоко, полученное от больных животных, и молочные продукты (брынза, кумыс, сыры), мясо, изделия из животного сырья (шерсть, кожа). Животные загрязняют испражнениями почву, воду, корм, что также может способствовать заражению человека непищевым путем. Контактно-бытовой и воздушно-пылевой пути реализуются при уходе за животными и обработке животного сырья.

При бруцеллезе у беременных существует вероятность внутриутробной передачи инфекции, кроме того, возможна постнатальная передача при лактации. Люди обладают высокой восприимчивостью к бруцеллезу, после перенесения инфекции в течение 6-9 месяцев сохраняется иммунитет. Повторное инфицирование бруцеллами отмечается в 2-7 % случаев.

Инкубационный период бруцеллеза в среднем составляет 1-4 недели, но при формировании латентного носительства удлиняется до 2-3 месяцев. Острый бруцеллез обычно развивается быстро, у пожилых лиц начало может быть постепенным (в этом случае больные отмечают продромальные явления в виде общего недомогания, бессонницы, разбитости, артралгий и миалгий с постепенным нарастанием интоксикации на протяжении нескольких дней). Температура тела резко поднимается, сильный озноб чередуется с потом, развивается интоксикация, чаще всего умеренная, несмотря на выраженную температурную реакцию.

Хронический бруцеллез протекает волнообразно, с проявлением симптоматики полиорганных поражений. При этом симптомы общей инфекционной интоксикации обычно выражены умеренно, температура редко превышает субфебрильные значения. Промежутки между обострениями заболевания могут продолжаться 1-2 месяца. В случае формирования нового инфекционного очага внутри организма общее состояние ухудшается. Симптоматика хронического бруцеллеза зависит от преимущественного поражения той или иной функциональной системы возбудителем и выраженности аллергического компонента.

Достаточным для подтверждения диагноза является определение антигенов бруцелл и антител к ним в крови пациента при помощи серологических методов. Исследованию подвергается обычно сыворотка крови, но возможно обнаружение антигенов и в спинномозговой жидкости. Положительный результат серологического исследования не менее чем в 3-4 различных тестах, с характерной соответствующей динамикой показателей, является достаточным основанием для подтверждения этиологии заболевания. Начиная с 20-25-го дня болезни и в течение длительного периода (несколько лет) после выздоровления отмечается положительная реакция на кожную пробу Бюрне (подкожное введение бруцеллина).

Серологические методы также могут быть полезны для дифференцировки острой и хронической формы бруцеллеза. С этой целью может выполняться определение отдельных классов иммуноглобулинов.

Для чего используется исследование?

• Для выявления инфекции (острой и хронической).

Когда назначается исследование?

• При симптомах бруцеллеза (остросептической формы): высокая температура 39-40 °С и выше, озноб, потливость, слабость, миалгия, артралгия, артрит;
• при обследовании пациентов с изолированным поражением мочеполовой системы и суставов при наличии в анамнезе указаний на употребление сырого козьего молока, особенно в эндемичных по бруцеллезу районах, и профессиональных особенностей (ветеринары, работники молочной и мясной промышленности);
• при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для вакцинации против бруцеллезной инфекции;
• дифференциальная диагностика с гриппом, брюшным тифом, малярией, инфекционным мононуклеозом, лептоспирозом, лимфогранулематозом, ревматоидным полиартритом.

Референсные значения: антитела не обнаружены.

Коэффициент позитивности (КП):

1,1 – положительный результат (антитела обнаружены).

КП – концентрация специфических антител в единице объема. Чем выше КП пробы, тем выше концентрация антител.

• отсутствие инфекции;
• слабая иммунная реакция пациента;
• низкий уровень антител.

• острая инфекция;
• рецидив заболевания;
• хроническая форма инфекции.

В случае получения сомнительного результата рекомендуется повторить исследование через 10-14 дней. При повторном результате «Сомнительно» результат следует рассматривать как отрицательный.

В случае заражения бактерией Brucella сначала появляются антитела IgM, затем через некоторое время антитела IgG. Диагноз «острый бруцеллез» подтверждается выявлением антител при острой симптоматике заболевания, совместным выявлением антител IgG, IgA, IgM или только IgM. Если было применено лечение, в течение 2-4 месяцев концентрация IgG, как правило, значительно уменьшается.

В случае хронического бруцеллеза особое значение имеют антитела IgG и IgA. Они свидетельствуют также о давно перенесенном заражении.

Наличие IgA, IgG при отсутствии IgM говорит о хронической инфекции или реинфекции бруцеллой.

[40-063] Клинический и биохимический анализы крови — основные показатели [07-056] Сифилис RPR (антикардиолипиновый тест/микрореакция преципитации), титр

источник

В настоящее время в совершенствовании серологической диагностики заразных болезней широко используются методы, основанные на использовании ИФА. Это и понятно: ИФА является высокочувствительным тестом, позволяющим за короткое время исследовать большое количество образцов сыворотки крови. Однако высокая чувствительность теста, в первую очередь, требует применения в нем антигена, специфичного для возбудителя. Иначе, высокая чувствительность ИФА идет во вред его диагностической ценности, показывая ложноположительные результаты вследствие наличия у возбудителя и некоторых микроорганизмов общих антигенных детерминант.

Бруцеллез животных остается одной из главных проблем ветеринарии Казахстана. В ИФА-наборах, используемых в последнее время для серологической диагностики инфекции, в качестве антигена выступают липополисахариды (ЛПС) молекулы бруцелл. Известно, что ЛПС Brucella практически единтичны аналогичному антигену, полученному из Yersinia enterocolitica 0:9, и имеют гомологичные эпитопы с многими грамотрицательными микроорганизмами на которые в организме животных имеются антитела. Кроме того, иммунной системе вакцинированного организма более доступны ЛПС, расположенные поверхностно, и поэтому антитела в основном вырабатываются на детерминанты полисахаридной молекулы. В этой связи, нет сомнений в том, что использование данного антигена в ИФА приводит к необоснованному убою определенного поголовья здоровых животных, выработавших антитела в результате иммунизирующей субинфекции или вакцинации.

В НИИ биотехнологии КазАТУ им. С.Сейфуллина (А.К.Булашев и соавт.) проведена работа по определению диагностической ценности белков внешней мембраны (БВМ) Brucella abortus 19. Выбор данного антигена основан на следующих положениях. Во-первых, грамотрицательные микроорганизмы, хотя и имеют большие сходства между собой по ЛПС, существенно различаются по антигенам БВМ. Во-вторых, в иммунизированном организме вакцинные штаммы задерживаются, как правило, в течение короткого времени (1-3 мес.). Поэтому для иммунной системы вакцинированных животных более доступны ЛПС, расположенные на поверхности клетки, чем белковые антигены «замаскированные» сложным комплексом поверхностной структуры. В этой связи привитый организм успевает вырабатывать антитела в основном на ЛПС. В организме инфицированного животного происходит длительная персистенция бруцелл, сопровождающаяся реакцией иммунной системы на возбудителя болезни, пытающегося локализоваться в излюбленных им органах. Это приводит к накоплению в тканях большого количества продуктов распада бруцелл, среди которых имеются и БВМ, которые ранее были не доступными для иммунной системы.

Тест-система ИФА для выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, разработанная сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина, основана на использовании БВМ бруцелл. Как показали результаты исследований, тест оказался более специфичным, нежели общеизвестные серологические реакций. Постановка ИФА проводилась в двух вариантах. В непрямом ИФА БВМ были иммобилизированы к твердой фазе неспецифически, а в «сэндвич» варианте – посредством моноклональных антител (МКА), имеющих специфичность к эпитопу белка с молекулярной массой 50 кД. Сравнивая диагностическую значимость двух методов постановки ИФА, исследователи предпочтение отдают «сэндвич» варианту. Во-первых, в последнем случае белковый антиген, в составе которого имеется эпитоп моноклональных антител, фиксируется к твердой фазе специфически. При этом другие белковые компоненты БВМ бруцелл удаляются в процессе отмывки лунки планшеты. Таким образом, в ходе постановки «сэндвич» ИФА первые антитела осуществляют отбор антигенов, свойственных для бруцелл из состава БВМ бруцелл. Это, безусловно, повышает специфичность данного теста. Разработчик имеет научно-техническую документацию и опытные образцы иммуноферментного диагностикума (зарегистрирован в Государственном реестре ветеринарных препаратов за №РК-ВП-2-0126-04 от 27.01.2004.). Авторские права защищены патентом РК №14230 «Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза» (Бюл.№4, опубл.15.04.2008.). Высокая специфичность белковых антигенов Leptospira, серогруппы Hebdomadis была отмечена нами при серологической ИФА-диагностике крупного рогатого скота на лептоспироз в сравнении с другими иммунологическими методами. (А.К.Булашев, 2005). Диагностикум существенно превосходил по чувствительности и специфичности реакцию микроагглютинации и лизиса (РМАЛ) и на 6% больше выявлял серопозитивных животных, чем его зарубежный аналог «IФА-лептоспiроз-ВРХ» (М.А.Куйбагаров, 2006).В литературе имеются сообщения о перспективности использования БВМ в диагностике других инфекционных болезней. Например, на основе БВМ Yersinia pseudotuberculosis сконструирован псевдотуберкулезный видоспецифический антигенный полимерный диагностикум для объемной реакции агглютинации. При этом чувствительность диагностикума составлял 100%, специфичность – 85,7-89,5% (Д.И.Симакова и др., 2011).

Большую практическую значимость имеют и методы детекции антигенов возбудителей инфекционных болезней, предложенные учеными КазАТУ им.С.Сейфуллина. Так, диагностический набор, основой которого являются МКА штаммов гибридом БАМА и БИМА, позволяет обнаруживать Brucella abortus в патматериале, а именно в паренхиматозных органах и лимфатических узлах, а также в содержимом желудка аборт-плодов (А.К.Булашев, 1992). МКА упомянутых штаммов были использованы Н.А.Бызовой и соавт. (2011) для разработки экспрессных иммунохроматографических тестов (ИХТ) для детекции антигенов Brucella abortus и антител против данного патогена. Тесты для определения антигена Brucella abortus позволяют в течение 10-15 мин выявлять в биоматериале ЛПС в концентрациях до 5 нг/мл., единый стандартный бруцеллезный антиген до 1 млн.кл/мл. Результаты серологический исследований с помощью ИХТ полностью совпали с данными ИФА.

Экспресс-тест на основе МКА был апробирован нами и для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале. Установлено, что «dot» ИФА с использованием антител к Mycobacterium bovis как в «сэндвич», так и в прямом варианте по чувствительности и специфичности, и, естественно, по времени проведения (3,5-4 часа) существенно превосходит классические методы исследований (микроскопический, бактериологический) и сопоставим с ПЦР-диагностикой. Данный тест, в отличие от других использованных, давал возможность дифференцировать Mycobacterium bovis от других видов, включая представителей атипичных микобактерий (А.К.Булашев и соавт., 2010; 2011). Заслуживает внимания и иммуноферментный диагностикум, предназначенный для серологического обследования крупного рогатого скота на туберкулез (A.K.Bulashev, 2003). По результатам апробации у всех животных, показавших позитивные результаты одновременно по ИФА и аллергической пробе, в легких и лимфатических узлах выявлены поражения, характерные для туберкулеза, тогда как у коров, реагировавших только на ППД-туберкулин, видимые изменения во внутренних органах не обнаруживались.

В связи с неблагополучной эпизоотической ситуацией по сибирской язве, ящуру и бешенства ветеринарная служба Казахстана нуждается в эффективных экспресс-тестах для мониторинга санитарного состояния объектов внешней среды. Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина и Национального центра биотехнологии РК (НЦБ РК) разработан высокоспецифичный метод индикации возбудителя B.anthracis в почве, основанный на использовании двух видов МКА в «dot» ИФА на нитроцеллюлозной бумаге (А.К.Булашев и соавт., 2005). Чувствительность теста составляла 4 500 м.кл./мл. Кроме того, его можно использовать для обнаружения сибиреязвенных бацилл и в других объектах внешней среды (вода, корма), а также в сырье животного происхождения.

Учеными двух названных научных учреждений были созданы 3 штамма-продуцента МКА к вирусу ящура и 4 гибридомы, синтезирующие антитела к вирусу бешенства и предложены методы ИФА для лабораторной диагностики упомянутых вирусных болезней (А.К.Булашев и соавт., 2005). Тест-система для идентификации антигенов вируса бешенства методом ИФА разработана и НИИ проблем биологической безопасности РК (Е.С.Жилин и соавт.,2011) . В результате проведенных исследований в 13 из 15 исследованных полевых материалах (мозг и слюна), отобранных от коров, овец, лис и корсаков, имеющих клинические признаки заболевания бешенством, выявлен антиген вируса бешенства. Полученные результаты были подтверждены испытанием аналогичной панели проб полевых материалов с использованием коммерческого ИФА-набора для диагностики бешенства (Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г.Казань). НЦБ РК и НИИ Физико-химической медицины (г.Москва) получен штамм-продуцент E.coli рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. ИФА на основе упомянутого антигена, обладая высокой специфичностью, выявляла антитела в сыворотке крови больных коров в разведении 1:320 (К.Н.Мукантаев и соавт., 2011).

Одним из многообещающих подходов повышения специфичности ИФА является использование в этом тесте антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. «внутренних образов» исходного антигена. При этом, однажды полученные моноклональные антитела к специфичному эпитопу определенного возбудителя могут быть использованы для получения моноклональных АИАТ, которые в последующем заменят исходный антиген и исключают тем самым необходимость работы персонала патогенными микроорганизмами. АИАТ способны имитировать любые, в том числе слабоиммуногенные и слабоантигенные детерминанты гаптенов, полисахаридов, липидов, зачастую выделяемых в деградированной форме и, следовательно, лишенных части эпитопов, присущих нативной молекуле, или же сохраняющих высокую токсичность за счет особенностей экстракции. АИАТ, выступающие в роли белкового «заменителя» определенного бактериального антигена, позволяют устранять подобные препятствия и эффективно презентировать атоксичные детерминанты клеткам иммунной системы. Именно поэтому АИАТ в настоящее время успешно применяются многими исследователями в качестве «суррогата» антигена или его отдельных детерминант для индукции протективного иммунного ответа против бактериальных ЛПС, токсинов, ряда внутриклеточных паразитов – возбудителей малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, бактериальных и вирусных инфекций и т.д. Бесспорным преимуществом подобного подхода является отсутствие необходимости предварительного выделения изучаемой субстанции. Абсолютная специфичность МКА, использованных для получения АИАТ, предопределяет их гомологию исходному антигену.

Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина были получены АИАТ к идиотипу Ат2-бета моноклональных антител, направленных на поли-Б антиген бруцелл (С.Г.Оспанова и соавт, 2009). Одним из критериев характеристики АИАТ как Ат2-бета по сообщениям ряда авторов, является способность их взаимодействовать с ксеногенными антисыворотками, специфичными к исходному антигену, так как только этот идиотип, несущий «внутренний образ» антигена, могут связывать специфические антитела. Поэтому изучалось взаимодействие моноклональных АИАТ с кроличьей поликлональной моноспецифической антисывороткой и поликлональной позитивной сывороткой крупного рогатого скота в ИФА. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммами гибридом, проявляли активность по отношению к указанным ксеногенным сывороткам в титрах от 1:1600-1:3200. Одним из значимых свойств Ат2-бета является их способность индуцировать синтез гомологичных антител третьего порядка (анти-АИАТ), направленных против исходного антигена. Для этой цели были проведены серии иммунизаций линейных мышей препаратами АИАТ. Сыворотки мышей исследовали в непрямом ИФА на наличие антител третьего порядка, способных взаимодействовать с исходным поли-Б антигеном бруцелл. Как показали результаты, полученные АИАТ при введении в организм животных способны стимулировать синтез антител третьего порядка (Ат3), направленных против исходного антигена. Таким образом, исследователями доказана возможность применения АИАТ в качестве антигена при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез в ИФА.

Феномен антиидиотипии в диагностике кровепаразитарных болезней (пироплазмозов, анаплазмозов, нутталиозов, трипаносомозов) изучалась и Г.С. Шабдарбаевой и соавт. (2009). Ими установлено, что АИАТ к антигенам различных кровепаразитов, полученные в результате двукратной иммунизации лабораторных животных – кроликов, достаточно информативны, специфичны и их вполне можно использовать в качестве диагностикумов в таких серологических тестах, как РНГА и ИФА.

Иммуноферментный анализ с использованием F(ab)2-фрагментов антиидиотипических антител вместо нативных антигенов был предложен Б.Б. Гнеденко и соавт. (2006). Ими проведено определение сывороточного содержания аутоантител к трем группам белков в норме и у пациентов с шизофренией с помощью стандартных методов и тест-систем с иммобилизованными F(ab)2-фрагментами АИАТ. Уровни аутоантител ко всем белкам у пациентов с шизофренией были выше, чем в группе контроля.

Е.С.Жилин и соавт. (2011) испытали поликлональные антиидиотипические иммуноглобулины и их конъюгаты с пероксидазой хрена в ИФА для выявления антирабических антител в сыворотках животных. В результате испытаний регистрировали положительные результаты со специфическими сыворотками в независимости от вида продуцентов антирабических антител при отрицательных результатах с нормальными и гетерологичными сыворотками. Чувствительность тест-системы в 2-4 раза превышала непрямой и конкурентный вариант ИФА.

Представляют большой интерес работы, посвященные проблемам адаптации ИФА тестов условиям практики за счет удлинения срока годности иммуноферментного конъюгата. При этом изучается возможность использования иммобилизованных ферментов, искусственно связанных с нерастворимым носителем и при этом сохраняющих свои свойства. Иммобилизованные ферменты в тысячи раз стабильнее свободных. Все это обеспечивает высокую экономичность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные препараты. Одним из существенных факторов, сдерживающих широкое использование ИФА на производстве, является непродолжительный срок годности иммуноферментного конъюгата (6-12 мес. при надлежащем хранении в холодильнике). А.С.Геогджаян и соавт. (2011) получили иммобилизованные ферменты и применили их в разработке диагностических тест-систем для выявления возбудителей инфекционных болезней. Технология получения иммобилизованного иммунопероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: активация пероксидазы хрена; включение фермента в липосомы (или иммобилизация на алюмосиликате); иммобилизация полученных препаратов с иммуноглобулинами; очистка от не связавшихся компонентов, лиофилизация и контроль. В качестве носителя необходимо было выбрать такой, который бы не препятствовал проникновению к нему субстрата и не лишал фермент подвижности, необходимой для выполнения присущей ему функции. Иммобилизованный в липосомах материал оказывается защищенным липидной мембраной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности. Исследователями определены оптимальные условия получения высокостабильных и специфичных иммобилизованных иммунопероксидазных конъюгатов при использовании в качестве носителей липосом и алюмосиликата. Показана перспективность иммобилизации носителей с ферментом и иммуноглобулинами. Иммунопероксидазные конъюгаты апробированы при ИФА на гомо- и гетерологичных штаммах возбудителей туляремии и лептоспироза. Срок годности разработанных препаратов увеличивается до 5 лет для липосомных и до 3 лет для алюмосиликатных иммунопероксидазных конъюгатов без снижения чувствительности и специфичности.

Заслуживают внимания практиков и методы диагностики инфекционных болезней, основанные на иммунохроматографии. Так, Н.А.Бызовой и соавт. (2010) предложена иммунохроматографическая детекция клеток Mycobacterium tuberculosis. Разработаны конкурентный и «сэндвич» варианты иммунохроматографического анализа, в которых контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами непосредственно инициируют движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимическое взаимодействие и формирование визуально детектируемых окрашенных зон. Показано, что и конкурентный, и «сэндвич» варианты метода позволяют определять клетки возбудителя туберкулеза в концентрации до 10 тыс. кл./мл (50-100 кл. в пробе). Преимуществом «сэндвич» анализа является возможность качественной визуальной диагностики, когда окрашивание аналитической зоны независимо от его интенсивности свидетельствует о положительном результате анализа.

Жердев и соавт. (2010) разработали иммунохроматографический способ определения антител к возбудителю туберкулеза. Для детекции антител используют два антигенных реагента – иммобилизованный в аналитической зоне тест-полоски антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген, конъюгированный с частицами коллоидного золота. Благодаря наличию у антител как минимум двух антигенсвязывающих сайтов при контакте тест-полоски с пробой в аналитической зоне происходит формирование иммунных комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена, содержащихся в пробе антител к антигену Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена возбудителя с частицами коллоидного золота. Комплексы определяют визуально или с использованием оптического детектора.

ИФА, особенно его точечный («dot») вариант, достаточно широко используют в диагностике таких паразитарных заболеваний, как амебиозы, бабезиозы, фасциолезы, лейшманиозы, гиподерматоз, эхинококкоз и токсоплазмоз. Эта реакция имеет очевидные преимущества перед другими иммуноферментными тестами, прежде всего, в возможности проведения большого числа анализов при значительно меньших объемах исследуемого образца, расходуемых реактивов, материалов и иммунореагентов. Антитела или антигены в иммунодоте наносятся в минимальных количествах на ограниченный участок полимерного листового материала, обладающего в 80-120 раз большей сорбционной емкостью на единицу площади, чем носители с гладкой поверхностью, используемых в панельных тестах. С другой стороны, при проведении иммунодота можно обойтись без электрооборудования, что немаловажно в период массовых исследований в полевых условиях. В.Г.Бережко и соавт. (2009) испытали точечный ИФА в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза свиней. Специфичность иммунодота при первой инвазии составила 97,4%. Наибольшее количество ложноположительных ответов регистрировали у свиней с естественной инвазией E.granulosis . По мнению авторов, с одной стороны, такой результат можно объяснить наличием общих для трихинелл и эхинококков белковых эпитопов, а с другой – он мог быть спровоцирован различными заболеваниями печени, при которых ложноположительные ответы наблюдают на антигены самых различных возбудителей. Специфичность иммунодота при эхинококкозе составила 68%. Основная причина ложноположительных результатов с сыворотками крови свиней, инвазированных C.tenuicollis , — близкое антигенное родство этого паразита с E.granulosis доказано иммунохимическим методом.

В течение последних трех лет (2009-2011 гг) НИР ученых-биотехнологов нашего университета была направлена на совершенствование методов диагностики заразных болезней животных, таких как лейкоз, эхинококкоз и описторхоз. Выбор названных болезней является неслучайным. Анализ эпизоотической ситуации показывает, что лейкоз крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах с высокоразвитым молочным животноводством. Инфекция наносит большой урон селекции и племенной работе, сокращает сроки эксплуатации животных, снижает молочную продуктивность, качества молока и мяса. По данным ветеринарной отчетности племенных хозяйствах Казахстана доля скота, положительно реагирующего на лейкоз доходит в среднем до 6%. Оздоровительные мероприятия основаны на своевременном выявлении и изоляции из стада инфицированных животных. Однако РИД и ИФА, наиболее чаще используемые для этой цели, не всегда дают объективные результаты. Первый тест имеет низкую специфичность, а второй из-за своей высокой чувствительности могут давать ложноположительные реакции в случае использования недостаточно очищенного антигена вируса.

В этой связи перед нами была поставлена задача разработать тест-систему ИФА, позволяющей по ходу анализа избавляться от нежелательных компонентов вируссодержащего материала, и тем самым способствующей сенсибилизации твердой фазы антигенами, специфичными для возбудителя лейкоза. С целью придания тест-системе такого селективного свойства, т.е. свойства отделять специфичный антиген от балластных веществ, были испытаны МКА — один из популярных на сегодняшний «инструментов» иммунологов.

Продуцентами МКА явились штаммы культивируемых клеток мышей, полученные нами методом гибридомной техники. Создание штаммов-продуцентов с желаемыми свойствами — дело не из легких, но, как показывает мировая практика, однажды полученные штаммы, позволяют с лихвой окупить все расходы, предоставляя исследователям весьма ценные препараты — однородные антитела со строгой специфичностью.

Иммунизацию линейных мышей проводили гликопротеидным gp51 и полипептидным p24 антигенами вируса лейкоза. В результате слияния иммунных спленоцитов с миеломными клетками получены 3 штамма гибридных клеток, синтезирующих МКА к полипептидному антигену и 6 штамма гибридом, продуцирующие антитела к гликопротеидному антигену вируса.МКА, полученные в результате культивирования штамма-продуцента в брюшной полости сингенных мышей, характеризовались высокой активностью и аффинностью по отношению к исходным антигенам.В наших исследованиях МКА были испытаны в качестве лиганды для фиксации вирусспецифического антигена к твердой фазе при постановке «сэндвич» ИФА.

Лунки планшет сначала сенсибилизировали МКА, пассировали активные центры полистирола, затем вносили вируссодержащий материал. При этом антитела избирательно связывались с теми антигенами, которые в своем составе имели специфичные для них эпитопы. Отмыв лунки планшет от не связавшихся компонентов, вносили образцы сыворотки крови или молока коров. При наличии в исследуемых пробах противовирусных антител, последние связываются с другими эпитопами антигена, фиксированного к твердой фазе посредством антител, образуя иммунный комплекс. Этот комплекс выявляли с помощью антибычьего конъюгата. В результате многочисленных опытов нами были определены оптимальные параметры и условия постановки ИФА для диагностики лейкоза.

По своей диагностической ценности наш метод не уступал коммерческим ИФА тест-системам. Итоги исследований легли в основу лабораторного регламента изготовления и применения компонентов диагностического набора. Метод скрининга поголовья крупного рогатого скота на маркеры вируса лейкоза на основе выявления интегрированного генома возбудителя в крови был разработан сотрудниками НЦБ РК (Е.Б.Евтыхова и соавт., 2011). Образцы выделенной из крови ДНК были протестированы на наличие провируса методом мультиплексной ПЦР с использованием смеси праймеров нацеленных на ген env и на фрагмент гена актина (внутренний контроль амплификации). Детекцию амплификаторов осуществляли электрофорезом в 2%-геле агарозы. Учеными этой же научной организации (К.К.Муканов и соавт., 2011) разработана ИФА на основе рекомбинантного р24 антигена вируса для серологической диагностики лейкоза.

Среди паразитарных болезней животных наибольшую тревогу вызывает эхинококкоз, так как эта болезнь наносит не только экономический, но и социальный ущерб. Люди заражаются при непосредственном контакте с собаками – пораженными половозрелыми эхинококками Echinococcus granulosis, а также при поедании овощей и плодов, загрязненных яйцами гельминта. При этой инвазиив печени, реже в легких и других органах промежуточных хозяев (с.х.животные и человек) образуются множественные кистозные образования, содержащие личинки паразита.Лечение больных животных не разработано. В редких случаях отмечается самовыздоровление животных с образованием обызвествленных эхинококковых пузырков. По клинической картине диагностировать болезнь весьма трудно. Иногда используют серологические реакций, основанные на обнаружении антител в сыворотке крови животных, такие как реакция сколекспреципитация, непрямая гемагглютинация, РДСК, а также аллергический метод. Однако, ни один из них не нашел применения в ветеринарной практике в силу низкой специфичности. Это и понятно – в этих тестах используется сложнейшая смесь антигенов гельминта. Одним словом, для искоренения болезни нужны достоверные методы диагностики, позволяющие своевременно выявлять и выбраковывать больных животных с последующей утилизацией зараженных органов под контролем ветеринарных специалистов.

В своей работе мы использовали четыре вида антигена: содержимое эхинококкового пузыря, протосколексы (продукт герминативной оболочки, свободно плавающий в полости капсулы), стенка пузыря и экскреторно-секреторный антиген (ЭС-АГ), выделяемый протосколексами в питательную среду в результате моделирования инвазии in vitro. Все антигены в РИД и ИФА активно взаимодействовали с антителами сывороток крови, полученных от животных с эхинококкозными поражениями. Для дальнейшей работы мы отобрали ЭС-АГ по следующим соображениям. Во-первых, белковый состав продукта жизнедеятельности эхинококка, культивируемого в искусственной питательной среде, намного проще, чем у других видов антигенов, во-вторых, методику получения антигена в условиях in vitro можно стандартизировать, и, в третьих, в случае выздоровления животных с образованием обызвествленных пузырков, естественно, прекращается иммунный ответ организма на метаболиты паразита.

Протосколексы были получены из эхинококковых пузырей животных во время убоя. ЭС-АГ гельминта выделяли в результате культивирования протосколексов в жидкой питательной среде. Антиген состоял из 11 белковых фракций с молекулярными массами в диапазоне 19-63 кД. Методом гибридомной техники были получены штаммы клеток, продуцирующие антитела к детерминанте экскреторного белка с молекулярной массой 21 кД, и изучены их свойства.

Принцип обнаружения сывороточных антител, специфичных к эхинококкам, был основан на применении МКА в качестве первых антител в «сэндвич» ИФА. Эти антитела избирательно взаимодействуя с ЭС-АГ способствовали сенсибилизации твердой фазы метаболитами гельминта. Как показали результаты производственного испытания, во всех случаях обнаружения паталогоанатомических изменений, характерных для эхинококкоза, выявлялись и специфические антитела в образцах сыворотки крови.

Результатылабораторного и производственного испытания были использованы в разработке нормативно-технической документации на диагностическую тест-систему. Опытная партия диагностикума передана в МСХ для регистрации в государственном реестре ветеринарных препаратов.

ИФА, основанный на использовании в качестве антигенов — продуктов жизнедеятельности гельминта, был испытан нами для иммунодиагностики и другой инвазионной болезни — описторхоза — широко распространенного природно-очагового паразитарного заболевания человека, вызываемое гельминтом Opisthorchis felineus.

Гельминт локализируется в желчных протоках печени, желчном пузыре и поджелудочной железе. Заражение человека и плотоядных животных — окончательных хозяев данного паразита, происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками гельминта рыб семейства карповых. Болезнь протекает хронически, без выраженных клинических признаков, не всегда в образцах фекалия пациентов, больных описторхозом, обнаруживаются яйца гельминта. Предложен аллергический метод, который, как и другие тесты, основанные на повышенной чувствительности замедленного типа, часто дает фальшрезультаты.

Для извлечения ЭС-АГ описторхиса сначала выделяли метацеркарий из поверхностных и глубоких спинных мышц рыб, обитающих в водоемах бассейна озера Тенгиз и реки Иртыш. Надо отметить, что степень зараженности рыб была довольно высокой, и у отдельных видов она достигала 26%. Затем заражали лабораторных животных (собак, кроликов и хомяков) метацеркариями. По истечении 60 суток животных забивали, изолировали половозрелые гельминтыи культивировали их в неполной среде Игла для накопления метаболитов.

Методом гибридомной техники получены два штамма-продуцента, МКА которых показали высокую активность по отношению к исходному антигену.

При разработке метода ИФА-диагностики описторхоза нами определялась возможность использования МКАкакв качествеагента,фиксирующего антиген описторхиса к твердой фазе, так и в роли антител, вступающих в реакцию с циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК) сыворотки крови, состоящими из молекул специфического иммуноглобулина и антигена. По данным литературы, на поздних стадиях болезни антитела, активные центры которых заняты антигенами паразита, не выявляются в серологических реакциях. Такие иммунные комплексы могут быть определены другими антителами, специфичными к свободным эпитопам антигена.

Предлагаемые тест-системы апробировались на образцах сыворотки крови людей, заведомо больных описторхозом в сравнении с коммерческой тест-системой Описторх-IgG-ИФА АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Оба варианта ИФА дали вполне сопоставимые результаты как между собой, так и со сравниваемым аналогом.

Экспертиза продуктов животного происхождения на наличие в них остаточного количества антибиотиков или других биологически активных веществ становится одной из важных задач практической ветеринарии в связи с вхождением Казахстана в Таможенный союз и предстоящим вступлением его в ВТО. Присутствие контаминантов вызывают у людей аллергические реакции, дисбактериоз и другие патологии. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд методов. Наиболее широкое применение нашел микробиологический метод. Несмотря на относительную надежность, метод имеет ряд существенных недостатков. К ним относят низкий уровень чувствительности и воспроизводимости результатов, необходимость постоянной поддержки в лаборатории штаммов тест-микробов. В странах ЕС, США и Японии иммуноферментный анализ является рекомендованным методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в продуктах животного происхождения.

Получение антител к антибиотикам является трудновыполнимой задачей, поскольку по своей химической природе они являются гаптенами и не вызывают иммунный ответ. В этой связи в наших исследованиях антибиотики сшивались с высокомолекулярными носителями (БСА, овальбумин). Эти конъюгаты и служили антигеном в гибридомной технике. Осуществив семь слияний иммунных спленоцитов с миеломной линией клеток, нам удалось получить 3 штамма–продуцента антител к гидроксильной группе молекулы стрептомицина, и по 2 штамма, синтезирующие иммуноглобулины к антигенным детерминантам хлорамфеникола (левомицетина) и окситетрациклина.

Метод, предлагаемый нами дляопределенияостаточного количестваантибиотиков, основан на конкуренции свободного антибиотика, содержащегося в исследуемой пробе и антибиотика, иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за активные центры антител. Диагностическая ценность тест-системы для определения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции апробирована на пробах молока и мяса в сравнении с коммерческими аналогами.Результаты испытания свидетельствуют о возможности использования ее для экспресс-обнаружения антибиотиков в продуктах питания. Таким образом, ИФА имеет все основания для того, чтобы занять свою достойную нишу в лабораторной практике ветеринарии.

Контрольные вопросы:1. Расскажите об основных результатах научной работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина в области совершенствования диагностики инфекционных болезней животных; 2. Основные итоги работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина по совершенствованию методов диагностики инвазионных болезней; 3. Чем объясняется перспективность применения антиидиотипических антител в иммунодиагностике инфекционных болезней?

Дата добавления: 2018-03-01 ; просмотров: 573 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

В статье дана сравнительная оценка диагностической ценности серологических реакций при бруцеллезе животных. Были исследованы две группы животных: крупный рогатый скот и овцы. В результате исследований выяснено, что ИФА более ценный диагностический метод в сравнении с РА и РСК.

Бруцеллез–хроническая инфекционная болезнь, протекающая часто с обострениями и выраженными клиническими признаками, проявляющимися в виде абортов, задержания последов, эндометритов, орхитов, эпидидимитов, расстройств воспроизводительной способности животных, поражения опорно-двигательного аппарата[1].

Бруцеллезом болеют животные всех видов. Резервуаром и переносчиком возбудителя бруцеллеза могут быть многие представители дикой фауны. Благодаря этому бруцеллез получил широкое распространение.

Ликвидация бруцеллеза представляет собой мировую проблему для медицинского и ветеринарного здравоохранения. В борьбе с бруцеллезом большое значение имеет диагностика, в частности иммунологические методы.

Для проведения массовых профилактических и диагностических обследований скота на бруцеллез широко используют РА, РСК и РДСК. Кроме этих реакций, применяют пластинчатую РА с роз-бенгал-антигеном (роз бенгал проба — РБП) и кольцевую реакцию (КР) с молоком коров.

На ранних стадиях бруцеллезного процесса наиболее чувствительна РА. Агглютинины в сыворотке крови больных животных в низких титрах можно выявить уже с 10—15-го дня, а затем в течение 1—3 мес после инфицирования. В более поздние сроки диагностическая ценность РА снижается [2].

Однако показатели РА весьма нестабильны, особенно в период беременности, а также могут не выявлять до 45% зараженных животных [3].

РСК и РДСК по времени выявления зараженных животных несколько отстают от показаний РА у крупного рогатого скота, но являются более ценными и чувствительными при диагностике бруцеллеза у овец. Обе реакции стабильны, специфичны и существенно дополняют показания РА [2].

В последнее время для диагностики бруцеллеза стали также широко применять иммуноферментный анализ, который к настоящему времени прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. С его помощью можно проводить как массовое обследование стад, так и поставить окончательный диагноз у конкретного животного.

Главные преимущества ИФА перед традиционными иммунологическими тестами: высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, воспроизводимость, стандартизация основных ингредиентов анализа, возможность исследования сильно загрязненных образцов, биологических жидкостей и экстрактов, возможность автоматизации всех этапов постановки и учета реакции [4].

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях лабораторной диагностики, и в настоящее время, согласно стандартам МЭБ (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004), ИФА, наряду с традиционными методами, является узаконенным методом диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота [5].

ИФА является более чувствительным методом в сравнении с РА и РСК, а также выявляет антитела в более ранние сроки [3].

Материалы и методы исследований

Нами была изучена иммунологическая активность различных клеточных структур (капсула, клеточная стенка, дезинтеграт, цитоплазма) бруцелл и целых клеток в РСК и ИФА. В результате исследований было выяснено, что активность дезинтеграта выше по сравнению с другими антигенами.

В крестьянском хозяйстве «Арай» Карасайского района Алматинской области были взяты пробы крови крупного рогатого скота (35 голов) и овец (43 головы). Их исследовали в РА, РСК и ИФА со стандартными и полученными нами антигенами.

Для получения антигенов были использованы бруцеллы вида abortus штамма 19, выращенные на эририт агаре, смытые физиологическим раствором натрия хлорида.

При получении цельных клеток бактериальную массу подвергли встряхиванию на шуттель-аппарате в течение 3-х ч с последующим центрифугированием при 5 000 об./мин в течение 1 ч для отделения капсульного вещества. Осадок (цельные клетки) ресуспендировали в физиологическом растворе натрия хлорида и использовали в качестве антигена для постановки РА.

Часть полученного осадка дезинтегрировали посредством ультразвука. Дезинтеграт очистили от неразрушенных клеток центрифугированием при 6 000 об./мин в течение 1 ч, вследствие чего последние выпали в осадок. Полученный дезинтеграт использовали в качестве антигена для постановки РСК и ИФА.

Результаты исследований

В РА стандартный и опытный антигены, по существу, являются аналогами, т. е. взвесью цельных бруцелльных клеток. При исследовании сыворотки крови животных этот антиген выявил 9 положительно реагирующих животных.

При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота в РСК со стандартным антигеном было получено 12 положительных и 1 сомнительный результат, а с антигеном из дезинтеграта 25 положительных и 7 сомнительных. Следовательно в РСК антиген из дезинтеграта проявляет большую активность, чем антиген из цельных клеток.

При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота с помощью ИФА было выявлено вдвое большее количество положительно реагирующих животных в сравнении с РСК со стандартным антигеном, в то время как РСК с антигеном из дезинтеграта дала весьма схожие с ИФА результаты.

ИФА со стандартным антигеном дал два сомнительных результата. Антиген из дезинтеграта позволил разрешить эту проблему. В этом тесте один сомнительный случай дал положительный результат, а другой – отрицательный. В остальных случаях оба антигена в ИФА дали идентичные результаты. Однако показатели оптической плотности в положительных случаях были выше в анализе с антигеном из дезинтеграта, что свидетельствует о его большей активности.

При исследовании сывороток крови овец в ИФА опытным антигеном было выявлено 9 положительно реагирующих овец, в то время как стандартный антиген выявил лишь 4.

Из данных таблицы видно, что опытный антиген выявляет в ИФА больше положительно реагирующих на бруцеллез животных, чем существующий, а также позволяет разрешать сомнительные случаи. Следовательно, активность и специфичность опытного антигена превышают таковые существующего.

Результаты исследований показали, что РА и РСК со стандартным единым антигеном при исследовании сыворотки крови животных выявляют приблизительно одинаковое количество положительно реагирующих животных. Однако диагностическая ценность РСК может быть существенно улучшена, если в качестве антигена использовать клеточный дезинтеграт. Тот же вывод можно сделать относительно ИФА. В целом можно сказать, что ИФА значительно более ценный диагностический метод в сравнении с РА и РСК при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез.

источник

Весь контент iLive проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.

У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.

Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.

В норме антитела к возбудителю бруцеллёза в крови отсутствуют. Диагностический титр при реакции агглютинации — 1:160 и выше.

Возбудители бруцеллёза — бруцеллы, мелкие неподвижные грамотрицательные бактерии. При постановке диагноза бруцеллёза полученные клинико-эпидемиологические данные необходимо подтверждать лабораторно. С этой целью используют бактериологический и серологический методы исследования. При остром бруцеллёзе положительный результат исследования гемокультуры получают в 10-30% случаев (в 62-90%, если возбудитель — Brucella melitensis, в 5-15%, если — Brucella abortus). Культура ликвора бывает положительной у 45% пациентов с менингитом. При посевах крови, костного мозга, мочи культуру бруцелл можно получить через 5-10 сут, а в части случаев — через 20-30 сут. В связи с этим для диагностики бруцеллёза широкое распространение получили серологические методы.

Самым надёжным серологическим тестом определения антител к возбудителю бруцеллёза в сыворотке крои служит стандартный тест пробирочной агглютинации (реакция Райта), с помощью него определяют содержание антител, реагирующих главным образом с липополисахаридными антигенами бруцелл. Увеличение титров антител в 4 раза и более в пробах сыворотки крови, полученных с интервалом 1-4 нед, позволяет идентифицировать этиологический фактор заболевания. У большинства больных титры специфических антител повышаются на 3-5-й день от начала заболевания. Достоверным считают титр антител не менее 1:160 с последующим его нарастанием. Повышенный титр антител выявляют у 97% больных в первые 3 нед заболевания. Наиболее высокий титр антител отмечают обычно через 1-2 мес от начала заболевания, в дальнейшем он начинает быстро снижаться. Стандартный тест пробирочной агглютинации выявляет антитела к B. abortus, B. suis, B. melitensis, но не к B. canis. Повышенный титр антител может сохраняться у 5-7% пациентов в течение 2 лет после перенесённой инфекции. Поэтому реакцию Райта нельзя использовать для дифференциальной диагностики бруцеллёза с другими инфекционными заболеваниями при наличии в анамнезе бруцеллёза в течение 2 последних лет. Причиной ложноположительных результатов могут быть проведение кожной пробы на бруцеллёз, вакцинация против холеры, а также инфекции, вызванные холерным вибрионом, иерсиниями, Francisella tularensis. В части случаев возможны ложноотрицательные результаты реакции агглютинации у больных бруцеллёзом, что объясняется эффектом прозоны, или так называемым блокированием антител. При хронических локализованных формах бруцеллёза титры могут быть отрицательными или ниже 1:160. На фоне проводимого лечения титры антител класса IgG быстро снижаются и в течение года приближаются к нулю. При рецидивах уровень антител IgG снова повышается. Наличие однократного повышения титра антител IgG более 1:160 — надёжное объективное указание на текущую или недавно перенесённую инфекцию. После лечения и выписки больного из стационара рекомендуют проведение серологических исследований в течение первого года через 1, 2, 3, 6, 9 и 12 мес, а в течение второго года — ежеквартально.

РПГА более чувствительна и специфична для обнаружения бруцеллёзных антител в сыворотке крови. Нередко гемагглютинины выявляют в тех случаях, когда реакция агглютинации даёт отрицательный или сомнительный результат.

РСК позволяет выявлять комплементсвязывающие антитела к бруцеллам, появляющиеся в крови позже агглютининов. Максимальные титры антител в РСК регистрируют к 4-му месяцу заболевания, в дальнейшем их титр снижается, но в небольшом количестве их обнаруживают в течение 1 года. Существенных преимуществ РСК по сравнению с реакцией агглютинации не имеет.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]

источник

РЦРЗ (Республиканский центр развития здравоохранения МЗ РК)
Версия: Клинические протоколы МЗ РК — 2015

Острый бруцеллез – зоонозное инфекционно-аллергическое заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, протекает по типу токсико-бактериемиемической инфекции, характеризуется ремиттирующей лихорадкой с ознобами и потами, полимикролимфаденопатией, гепато/гепатоспленомегалией, полиартронейромиалгиями с длительностью заболевания до 3 месяцев.

Подострый бруцеллез – следующая за острым бруцеллезом стадия болезни, с длительностью от 3 до 6 месяцев, характеризуется появлением очагового поражения органов и систем инфекционно-аллергического и септико-метастатического характера на фоне клинических проявлений бактериемической инфекции (лихорадка, ознобы, поты, лимфаденопатия, гепатоспленомегалия) с длительностью заболевания от 3 до 6 месяцев.
При развитии острого бруцеллеза на сенсибилизированном фоне (в эндемичном регионе) отмечается раннее вовлечение в патологический процесс (в сроке до 3 месяцев) преимущественно опорно-двигательной, нервной, половой и других систем с развитием воспалительного процесса инфекционно-аллергического и септико-метастатического характера[2].
Бруцеллѐз человека – это системная инфекция, вовлекающая в патологический процесс многие органы и ткани.

Дата разработки протокола: 2015 год.

Категория пациентов: дети, взрослые, в том числе беременные.

Пользователи протокола: инфекционисты, терапевты, врачи общей практики, врачи/фельдшеры скорой и неотложной медицинской помощи, акушер-гинекологи, невропатологи, урологи, ревматологи, врачи клинической лабораторной диагностики, клинические фармакологи, организаторы здравоохранения.

Примечание: в данном протоколе используются следующие классы рекомендаций и уровни доказательств:

Классы рекомендаций:
Класс I – польза и эффективность диагностического метода или лечебного воздействия доказана и и/или общепризнаны
Класс II – противоречивые данные и/или расхождение мнений по поводу пользы/эффективности лечения
Класс IIа – имеющиеся данные свидетельствуют о пользе/эффективности лечебного воздействия
Класс IIb – польза / эффективность менее убедительны
Класс III – имеющиеся данные или общее мнение свидетельствует о том, что лечение неполезно/ неэффективно и в некоторых случаях может быть вредным

— Ведущие специалисты в сфере ВРТ из Казахстана, СНГ, США, Европы, Великобритании, Израиля и Японии
— Симпозиумы, дискуссии, мастер-классы по актуальным проблемам

Степень тяжести и стадия компенсации инфекционного процесса Органопатология (очаговые проявления) Латентный бруцеллез (субклиническая форма, положительно реагирующие по серо- и/или аллергическим реакциям) — — Острый бруцеллез (длительность болезни до 3 месяцев) Опорно-двигательный аппарат: артрит, пери- и параартрит, сакроилеит, остеоартрит, артроз, спондилоартрит, спондилит, спондилодисцит, спондилез, бурсит, тендовагинит, фиброзит, периостит, перихондрит, остеохондроз и т.д.
Нервная система
ЦНС: менингит, энцефалит, миелит, васкулит сосудов головного мозга, вертебро-базилярная недостаточность, гипертензионный, диэнцефальный, гипоталамический синдромы и т.д.
ПНС: неврит, радикулит, плексит, солярит, корешковый синдром и т.д.
ВНС: вегето-сосудистая дистония, метеочувствительность, нарушения микроцикуляции, атония кишечника и т.д.
Психобруцеллез: астеноневротический синдром, депрессивный синдром, галлюциноз и т.д.
Органы чувств: невриты зрительного и слухового нерва, увеонейрохориоретинит и т.д.
ССС: миокардит, перикардит, эндокардит, нарушения ритма и проводимости, миокардиодистрофия, флебит,тромбофлебит и т.д.
Половая система: орхит, орхоэпидидимит, сальпингооофорит, нарушения менструального цикла, бесплодие и т.д.
Мочевыделительная система: гломерулонефрит и др.
Дыхательная система: бронхит, пневмония – редко.
Пищеварительная система: гепатит, холецистит, гастрит – редко Подострый бруцеллез (длительность болезни от 3 до 6 месяцев) Хронический бруцеллез (длительность болезни свыше 6 мес.):
Первично-хронический бруцеллез (отсутствие острой фазы при хроническом течении болезни);
Вторично-хронический бруцеллез (следующая после острого и\или подострого бруцеллеза стадия болезни) Остаточные явления перенесенного бруцеллеза (наличие дегенеративно-дистрофических изменений в тканях при отсутствии в организме возбудителя) — Повторный бруцеллез (с указанием формы):
суперинфекция – повторное заражение на фоне продолжающегося инфекционного процесса;
реинфекция – повторное заражение после завершения предшествующего инфекционного процесса

II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

Перечень основных и дополнительных диагностических мероприятий [1,2]

Основные (обязательные) диагностические обследования, проводимые на амбулаторном уровне:

Минимальный перечень обследования, который необходимо провести при направлении на плановую госпитализацию: согласно внутреннему регламенту стационара с учетом действующего приказа уполномоченного органа в области здравоохранения.

Основные (обязательные) диагностические обследования, проводимые на стационарном уровне:

• УЗИ органов брюшной полости (гепатоспленомегалия).

Диагностические мероприятия, проводимые на этапе скорой медицинской помощи: не проводится.

Диагностические критерии [1,2,3]

• эпидемиологическая связь с известной вспышкой бруцеллеза или подтвержденным случаем бруцеллеза у людей.

• боли, отек, гиперемия, местная гипертермия яичек и его придатков (одно-или двухстороннее);

• отсутствует резидуальная форма (остаточные явления бруцеллеза).

повышение уровня аминотрансфераз, билирубина за счет прямого (гепатит бруцеллезной этиологии — редко);
анализ СМЖ: повышенное давление, прозрачная, лимфоцитарный плеоцитоз (серозный менингит бруцеллезной этиологии).

Выделение культуры BrucellaSpp. (из крови).
Для получения культуры бруцелл из крови используется бифазный метод Castaneda, при котором значительно уменьшается риск лабораторного заражения. Учитывая трудности доставки посевов крови больных из отдаленных сельских районов в бактериологическую лабораторию, рекомендуется использовать транспортную среду, которая представляет собой герметично закрытые стерильные флаконы объѐмом 20 мл с жидкой питательной средой, являющейся средой накопления. Количество бруцелл, находящихся в крови больного при посеве, через 5-7 суток увеличивается в 9 раз. Использование транспортной среды дало ряд преимуществ: значительно упрощена доставка образцов крови; обеспечена еѐ безопасность; сохранена стерильность посевов; в 3 раза повысился объѐм бактериологической диагностики в ранние сроки болезни, в 2 раза сократился срок выделения культур. В итоге высеваемость культур бруцелл достигла 60-70% .Обычно культуры бруцелл из крови положительны до 4-го дня инкубации, большинство культур крови — между 7 и 21, и только 2% — после 27-го дня. Поэтому, посевы необходимо инкубировать по крайней мере 45 дней до того, как выдать отрицательный результат. Гемокультура чаще выделялась от больных в период бактериемии. Частота положительных результатов обычно коррелирует с остротой процесса и высокими титрами серологических реакций. Однако нередки случаи выделения гемокультуры от больных с нормальной температурой и отрицательными серологическими реакциями.

Положительная реакция Райта 1:200 и выше, или реакция Райта

Дифференциальный диагноз

Дифференциальная диагностика: полиморфизм клиники бруцеллеза, а также стереотипность ответной реакции организма при ряде инфекционных болезней, особенно на первоначальном этапе развития инфекционного процесса, затрудняют клиническую диагностику. Необходимо дифференцировать от заболеваний, сопровождающихся длительной лихорадкой. Характерная выраженность клинических симптомов (высокой температуры тела) при относительно удовлетворительном самочувствии. Необходимо обязательно учитывать эпидемиологические данные и верифицировать диагноз лабораторными исследованиями.

Алгоритм дифференциальной диагностики острого бруцеллеза [1]

Диагностический алгоритм острого бруцеллеза

Стандартное определение случая острого бруцеллеза [5]

Предположительный случай: Острое заболевание, сопровождающееся лихорадкой со значительными дневными перепадами, продолжающейся более 5 дней и характеризующееся как минимум 4-мя из следующих признаков:

• положительный результат реакции агглютинации;

Получить консультацию по медтуризму

Получить консультацию по медтуризму

Этапность лечения обусловлена длительностью антибактериальной терапии, продолжительность которого должна быть не менее 6 недель (45 дней). Количество антибактериальных препаратов, эффективных в отношении бруцелл ограничено в связи с внутриклеточной локализацией возбудителя. В связи с этим, необходимо адекватная антибактериальная терапия с соблюдением схемы и сроков лечения для предупреждения развития резистентности возбудителя. Бруцеллы медленно растут на питательных средах, результат бактериологического исследования и определение чувствительности выделенных штаммов к антибактериальным препаратам выдается через 45 дней [2]. Поэтому данные по чувствительности бруцелл к антибиотикам можно использовать при втором курсе лечения (по показаниям).
Таким образом, рекомендуется комбинация 2 антибактериальных препаратов, эффективных в отношении бруцелл с продолжительностью лечения не менее 45 дней.

Немедикаментозное лечение [2]:
Режим – полупостельный, при развитии менингита/менингоэнцефалита бруцеллезной этиологии — постельный.
Диетотерапия. Стол №13 на весь лихорадочный период с последующим переводом на Стол №15.

Медикаментозное лечение

Стандартная схема лечения Альтернативная схема лечения 1 Альтернативная схема лечения 2 Триметоприм-сульфаметоксазол (ТМП-СМТ) СД 6- 8 мг/кг массы тела/сут по ТМП в 2 приема peros 45 дней + рифампицин 8- 10 мг/кг массы тела/ сутки-в 2-3 приема peros 45 дней стрептомицин15-20 мг/кг массы тела/сут.в 2- 3 приѐма в\м (максимальная суточная доза для детей – 0,5 г,
для подростков — 1 г)– 14 дней +рифампицин* СД8 -10 мг/кг массы тела/ сутки в 2- 3 приѐма peros 45 дней 8-18 лет стрептомицин 15-20 мг/кг массы тела/сут.в 2- 3 приѐма в\м (максимальная суточная доза для детей – 0,5 г,
для подростков – 1 г)– 14 дней +рифампицин* СД8 -10 мг/кг массы тела/ сутки в 2- 3 приѐма peros 45 дней Триметоприм-сульфаметоксазол (ТМП-СМТ) СД 6- 8 мг/кг массы тела/сут по ТМП в 2 приема peros 45 дней или Офлоксацин от 8 до 12 лет по 200мг мг 2 р\д — 45 дней, от 12 до18 лет по 400 мг 2 р\д — 45 дней + рифампицин 8- 10 мг/кг массы тела/ сутки-в 2- 3 приема peros 45 дней Доксициклин 200 мг\сутв 2 приема peros 45 дней+ гентамицин СД 3- 5 мг\кг массы тела/ сутки 2 раза в\м -7-10 дней ≥ 18 лет Доксициклин 100 мг 2 р\д 45 дней +ципрофлоксацин 0,5 г 2 р\д – 45 дней Ципрофлоксацин СД 1,0 г в 2 р\д 45 дней + рифампицин* СД 600 мг 2 р\д – 45 дней Офлоксацин 400 мг 2 р\д — 45 дней +рифампицин* 600-900г/сут в 2 -3 приема – 45 дней Триметоприм/ сульфаметоксазол (ТМП/СМЗ), 80 мг TMП/400 мг СМЗ +доксициклин 200 мг\сут в 2 приема peros 45 дней Триметоприм/ сульфаметоксазол (ТМП/СМЗ), 80 мг TMП/400 мг СМЗ) СД8/40 мг/кг, в 2 приема peros 6-8 нед. +рифампицин 900 мг\сут peros 6 нед. При нейробруцеллезе (менингит, менингоэнцефалит), эндокардите Доксициклин 200 мг\сут в 2 приема peros 45 дней+ ципрофлоксацин 1000 мг\сут в 2 приема + Триметоприм/ сульфаметоксазол (ТМП/СМЗ), 80 мг TMП/400 мг СМЗ) peros 6-8 недель — Беременные Рифампицин* 900 мг\сут в 3 приема peros – 45 дней Триметоприм-сульфаметоксазол (ТМП-СМТ) СД 5 мг/кг по ТМП в 2 приема peros – 45 дней —