Меню Рубрики

Диагностика бруцеллеза методом пцр

Выявление возбудителей бруцеллёза (Brucella spp), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции определяется генетический материал (ДНК) микроорганизма в моче, синовиальной жидкости, грудном молоке или образце ткани.

Бруцелла, возбудитель бруцеллёза, ундулирующей лихорадки, септицемии Брюса.

Синонимы английские

Brucella spp, DNA [Polymerase chain reaction] (urine, synovial fluid, breast milk, tissue sample), B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. canis.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Биоптат, грудное молоко, первую порцию утренней мочи, синовиальную жидкость.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Brucella spp – это грамотрицательные аэробные коккобациллы, являющиеся внутриклеточными паразитами человека и животных и вызывающие бруцеллёз. Они попадают в организм при употреблении сырого козьего молока и при непосредственном контакте с инфицированными тканями животных (как у ветеринаров, работников мясной промышленности, сотрудников микробиологических лабораторий). Наибольшее значение в клинике инфекционных болезней человека имеет 4 вида Brucella: B. melitensis, B. abortus, B. suis и B. canis, при этом на долю B. melitensis приходится подавляющее большинство случаев заражения. Бруцеллёз, вызванный различными видами Brucella, протекает и лечится одинаково, поэтому с клинической точки зрения нет необходимости определять видовую принадлежность возбудителя.

Бруцеллёз представляет собой системный инфекционный процесс, при котором поражаются практически все органы. Наиболее часто микроорганизм удаётся обнаружить в крови, однако другие биологические среды (моча, синовиальная жидкость) и фрагменты тканей (биоптат) также могут быть использованы для диагностики бруцеллёза. Несмотря на то что бруцеллёз считается зоонозной инфекцией, описаны случаи передачи микроорганизма от человека к человеку, в том числе случаи заражения младенцев при употреблении грудного молока больной матери. Его могут исследовать на бруцеллёз, чтобы установить источник заражения и не допустить реинфекции.

Диагностика бруцеллёза – достаточно сложная задача. Заболевание не имеет каких-либо специфических признаков, а также может протекать в бессимптомной, хронической и локализованной форме. Поэтому диагностика основана на лабораторном выявлении микроорганизма. Существует несколько способов идентификации Brucella: посев на питательную среду, серологические методы и исследование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР – это метод молекулярной диагностики, позволяющий обнаруживать в биологическом материале (например, в моче) фрагменты генетического материала (ДНК) возбудителя инфекции. Для диагностики бруцеллёза исследование с помощью ПЦР используют сравнительно недавно, однако, благодаря его преимуществам, метод находит всё большее применение в клинической практике.

Около 20-40 % случаев бруцеллёза – это локализованные формы заболевания, характеризующиеся изолированным поражением какого-либо органа, наиболее часто это орган мочеполовой, нервной системы, сердце, а также поражение сустава. Как правило, локализованный бруцеллёз – это последствие нераспознанной ранее остросептической формы. Чувствительность бактериологического метода («золотого стандарта» идентификации Brucella) при исследовании большинства биологических жидкостей не превышает 40 %. В такой ситуации ПЦР является хорошей альтернативой посеву на питательную среду: её чувствительность составляет 97-98 %. В некоторых случаях положительный результат исследования с помощью ПЦР может оказаться достаточным диагностическим критерием даже при отрицательном результате бактериологического посева и серологических тестов.

ПЦР основана на выявлении уникального для представителей рода Brucella фрагмента ДНК (гена bcsp31) и поэтому характеризуется очень высокой специфичностью. Для сравнения: большинство серологических методов выявляют антитела к общему для многих микроорганизмов липоолигосахариду, и их результаты могут быть ложноположительными при наличии инфекции Yersinia enterocolitica O:9, Salmonella urbana group N, Francisellatularensis, EscherichiacoliO:157, Stenotrophomonas maltophilia и некоторых других микроорганизмов.

Благодаря высокой специфичности положительный результат исследования с помощью ПЦР у пациента с признаками заболевания позволяет подтвердить диагноз. С другой стороны, случайно выявленный положительный результат у пациента без каких-либо жалоб и симптомов требует дальнейшего, более полного клинического и лабораторного обследования.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики остросептической, хронической и локализованных форм бруцеллёза, а также рецидива заболевания.

Когда назначается исследование?

  • При симптомах бруцеллёза (остросептической формы): высокой лихорадке с температурой 39-40 °С и выше (особенно при колебаниях температуры), ознобе, потливости, слабости, миалгии, артралгии или артрите.
  • При обследовании пациента с изолированным поражением мочеполовой системы и суставов при наличии в анамнезе указаний на употребление сырого козьего молока, особенно в эндемичных по бруцеллёзу районах, и профессиональных особенностей (как у ветеринаров, работников молочной и мясной промышленности).
  • При подозрении на бруцеллёз у новорождённого.

Референсные значения: отрицательно.

Причины положительного результата:

  • бруцеллёз;
  • туберкулёз с поражением костно-суставной системы.

Причины отрицательного результата:

  • отсутствие бруцеллёза;
  • неправильное взятие биоматериала на исследование.

Что может влиять на результат?

  • Туберкулёз костно-суставной системы может приводить к ложноположительному результату.
  • Применение доксициклина, рифампицина, ципрофлоксацина и других фторхинолонов способствует ложноотрицательному результату.
  • Результат исследования следует оценивать с учётом дополнительных анамнестических, лабораторных и инструментальных данных.

Кто назначает исследование?

Инфекционист, уролог, хирург, невролог, врач общей практики.

  • Al Dahouk S, Nöckler K. Implications of laboratory diagnosis on brucellosis therapy. Expert Rev Anti Infect Ther. 2011 Jul;9(7):833-45.
  • Yu WL, Nielsen K. Review of detection of Brucella spp. by polymerase chain reaction. Croat Med J. 2010 Aug;51(4):306-13. Review.
  • Morata P, Queipo-Ortuño MI, Reguera JM, Miralles F, Lopez-Gonzalez JJ, Colmenero JD. Diagnostic yield of a PCR assay in focal complications of brucellosis. J Clin Microbiol. 2001 Oct;39(10):3743-6.
  • Nimri LF. Diagnosis of recent and relapsed cases of human brucellosis by PCR assay. BMC Infect Dis. 2003 Apr 28;3:5.

Оставьте ваш E-mail и получайте новости, а также эксклюзивные предложения от лаборатории KDLmed

источник

Определить это заболевание – непростая задача. Очень часто при вяло протекающих симптомах врачи могут спутать бруцеллез с раком, лейкозом, различными инфекциями. Большое значение имеют эпидемиологический анамнез и клиническая картина.

Анализ на обнаружение бруцеллеза.

Когда человек сталкивается с домашним рогатым скотом, то возникает большая вероятность заболевания бруцеллезом.

Основываясь на симптомах, нельзя с точностью подтвердить правдивость диагноза. Для того чтобы наверняка удостовериться в диагнозе, используются аллергологический, бактериологический и серологический анализы. Также актуальны стандартные анализы на бруцеллез, с использованием крови, мочи, пункции лимфатических узлов, суставной жидкости.

Бактериальное исследование имеет значительную отрицательную сторону – очень медленный рост бруцелл на питательных средах. Колонии вызревают лишь через 20–30 дней, что осложняет и замедляет диагностирование бруцеллеза. Такой анализ делать очень долго, поэтому сейчас актуально использовать серологические методы.

Для того чтобы убедиться, что у вас бруцеллез, необходимо провести следующие анализы. Важную информацию дает анализ крови на бруцеллез. Ее можно сдать практически в любом медицинском учреждении.

Биохимический анализ крови.

Сначала делают стандартный набор исследований:

  1. Общий анализ крови. В ней нужно определить содержание лейкоцитов. Если показатель повышен, это означает, что в организме присутствует воспалительный процесс. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) ускоряется, но не намного. Запущенная стадия заболевания приводит к понижению показателей всех элементов крови.
  2. Общий анализ мочи. Здесь необходимо определить, присутствует ли белок в моче, и в каких количествах. Для этого следует повторять такой анализ мочи несколько раз.
  3. Биохимический анализ крови. Здесь анализируют уровни печеночного цитолиза (АлАТ, АсАТ), если эти показатели становятся выше нормы, то это говорит о гипербилирубинемии, снижается уровень альбуминов (гипоальбуминемия), при этом общий белок остается на нормальном уровне.

Чтобы определить возбудителя заболевания, применяют следующие методы.

Он дает практически 100% достоверный результат.

Однако этот метод отличается сложностью и длительностью. В качестве биологического материала используются кровь, моча, спинномозговая, внутрисуставная жидкость, желчь, а также проба из лимфатических узлов. Эти жидкости засевают на питательные среды и ждут роста микроорганизмов. Длительность этого метода составляет чуть меньше месяца, а порой и целый месяц, все зависит от роста колониальных бруцелл.

Это самый популярный анализ для определения бруцеллеза. Результаты можно узнать уже через неделю. Принцип заключается в нахождении иммуноглобулинов (антител) в сыворотке к бруцеллезным антигенам. По их классу можно определить продолжительность и скорость процесса. Для определения используют реакции Райта и Хеддельсона.

Бруцеллы убивают при помощи нагревания, и эта взвесь реагирует с сывороткой крови пациента. Если в процессе реакции бруцеллы склеиваются в маленькие шарики и оседают – это означает, что в сыворотке содержатся антитела и, значит, человек действительно болеет бруцеллезом. При отрицательной реакции заболевание не диагностируется. Этот метод хорош тем, что уже на ранних стадиях заболевания он может дать положительный результат. При помощи такой реакции находят бруцеллез не только у человека, но и у животных.

Она не дает такого достоверного результата. Здесь агглютинация делается на стекле. Часто эта реакция дает ложный результат.

Его проводят для обнаружения антител, которые атакуют эритроциты.

Для обнаружения бруцеллеза используется прямая реакция. Эта реакция различает антитела, которые напрямую связаны с эритроцитами. Если антиглобулиновый тест показывает отрицательный результат, значит, кровь чистая, и антител нет. Положительный результат означает появление антител, которые активно борются с эритроцитами.

ПЦР-диагностика основывается на обнаружении ДНК-цепей бруцелл из биологического материла пациента. Для этого материал обеззараживают, добавляя метиолят натрия в концентрации 0,01% с дальнейшим прогреванием в течение получаса. Когда завершится инкубирование в лизирующем растворе, который содержит все необходимые реагенты для экстракции ДНК при поддержании температуры 66 °С на протяжении 10–15 минут, биологическая ткань обезвреживается.

ПЦР-диагностика на обнаружении ДНК-цепей бруцелл.

Этот анализ особенно приемлем в том плане, что можно использовать абсолютно любую биологическую ткань пациента.

К одним из популярных методов относится реакция Бюрне. Она основана на введении внутрикожно бруцеллина. Если есть бруцеллез, то на месте укола начинается покраснение и небольшая пастозность. Именно этот участок и оценивается как аллергологическая проба Бюрне. Пятно измеряют и делают заключение: если пятно превышает 6 сантиметров, то реакция считается положительной.

Такая проба действительна, когда бруцеллез в хронической форме. Также необходимо учитывать и тот факт, что положительная реакция может возникнуть у людей, которые проходили вакцинирование по профилактике бруцеллеза.

источник

Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.

Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.

Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.

Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО2.

БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.

АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.

Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека

Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.

Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).

Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.

Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.

С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.

Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.

Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.

Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.

Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.

Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.

Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.

источник

Выявление ДНК возбудителя бруцеллеза (микроорганизмов рода Род Brucella: Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella canis методом ПЦР в реальном времени.

Чувствительность набора: до 103 мл геном эквивалентов вируса на 1 мл пробы.

Материал для исследовнаия: Материал НЕ требующий оформления пробоподготовки: — сперма, — молоко от абортировавших животных — содержимое бурс и гигром — выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта Материал требующий оформления дополнительной пробоподготовки. — Абортированный плод целиком или пат материал от него (содержимое брюшной полости и желудка, околоплодная жидкость или слизь между оболочками и плодом), парензиматозные органы (селезенка, печень, сердце, почки)). — плацента и плодовые оболочки от абортировавших животных; — в случае диагностического убоя животных для исследования отбирают парные лимфатические узлы (не менее 7 пар) подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые и кусочки паренхиматозных органов (печень, селезенка); — от самцов с признаками орхита или эпидидимита отбирают семенники с придатками. Для пат органов и абортированных плодов необходимо дополнительная утилизация отходов по весу на момент поступления в лабораторию Правила отбора проб для исследования: 1) Лимфоузлы берут целиком. 2) Жидкости для исследования, кроме молока, отбирают в объеме 5 — 10 мл в стерильные контейнеры. 3) Из органов и тканей вырезают кусочки не более 5 х 5 х 5 см, каждый орган помещается в отдельный герметичный пакет, подписывается. Органы, расфасованные в пакеты, от одного животного складываются в общий пакет и маркируются идентификатором животного. Доставляются в лабораторию в течение 2-х часов после отбора. При не возможности соблюсти данное требование, отобранный пат материал замораживается и через 1 сутки в замороженном виде доставляется в лабораторию, размораживание при транспортировке не допускается. 4) Взятие содержимого гигром, бурс. В области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с плотной пробкой. 5) Молоко. Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.У собак при взятии проб молока соски обмывают теплой водой и обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждого соска сцеживают около 0,5-1 мл молока в стерильнуюпробирку с крышкой без консервантов, без активаторов свертывания. У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с крышкой без консервантов, без активаторов свертывания. Молоко должно быть доставлено в лабораторию в день взятия пробы. 6) Абортированные плоды весом до 1 кг берется целиком. Плод помещается в отдельный чистый пакет, маркируется. Если вес плода более 1 кг, то необходимо провести вскрытие плода и взятие органов для исследования. Хранение: в холодильнике не более 2 -х суток при температуре +2-+8⁰С более длительное хранение при температуре не выше -16⁰С, кроме крови. Молоко должно быть доставлено в лабораторию в день взятия пробы.

источник

Бруцелла, ДНК Brucella spp., качественный — определение ДНК Brucella species в моче, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Метод ПЦР — позволяет идентифицировать в биологическом материале искомый участок генетического материала и обнаружить единичные молекулы ДНК микроорганизма, не выявляемые другими методами. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий, специфичных для данного возбудителя участка ДНК.

С помощью ПЦР-анализа можно диагностировать инфекцию в остром периоде и выявлять случаи носительства.

Brucella spp — это грамотрицательные аэробные коккобациллы, которые являются внутриклеточными паразитами человека и животных, и вызывающие бруцеллёз.

Бруцеллёз — зоонозная инфекция, передающаяся от больных животных к человеку, при которой поражаются практически все органы. Он характеризуется длительным течением, тяжелыми поражениями костно-суставного аппарата, сердечно-сосудистой и нервной систем. Передаётся человеку через мясо-молочные продукты и при непосредственном контакте с инфицированными тканями животных.

Диагностика бруцеллёза — достаточно сложная задача. Заболевание не имеет каких-либо специфических признаков, а также может протекать в бессимптомной, хронической и локализованной форме. Поэтому диагностика основана на лабораторном выявлении микроорганизма.

Около 20–40 % случаев бруцеллёза — это локализованные формы заболевания, характеризующиеся изолированным поражением какого-либо органа (наиболее часто это орган мочеполовой, нервной системы, сердца), а также поражением суставов. Как правило, локализованный бруцеллёз — это последствие нераспознанной ранее остросептической формы.

Благодаря высокой специфичности, положительный результат исследования с помощью ПЦР у пациента с признаками заболевания, позволяет подтвердить диагноз. С другой стороны, случайно выявленный положительный результат у пациента без каких-либо жалоб и симптомов требует дальнейшего, более полного клинического и лабораторного обследования.

Показания:

  • при симптомах бруцеллёза (остросептической формы): высокой лихорадке с температурой 39–40 °С и выше (особенно при колебаниях температуры), ознобе, потливости, слабости, миалгии, артралгии или артрите;
  • при обследовании пациента с изолированным поражением мочеполовой системы и суставов при наличии в анамнезе указаний на употребление сырого козьего молока, особенно в эндемичных по бруцеллёзу районах, и профессиональных особенностей (как у ветеринаров, работников молочной и мясной промышленности);
  • при подозрении на бруцеллёз у новорождённого.

Подготовка
Моча
Накануне сдачи анализа не рекомендуется употреблять в пищу овощи и фрукты, которые могут изменить цвет мочи (свекла, морковь, клюква и т.п.), принимать диуретики.

Перед сбором мочи необходимо провести тщательный гигиенический туалет внешних половых органов. Собирают строго утреннюю порцию мочи, выделенную сразу же после сна. Женщинам не рекомендуется сдавать анализ мочи во время менструации; во избежание попадания в мочу выделений из влагалища. Рекомендуется ввести во влагалище тампон.

За сутки до сдачи исключить прием алкоголя и половой акт.

Материал собирается в стерильный пластиковый контейнер. Собирается первая порция утренней мочи. При первом утреннем мочеиспускании, небольшое количество мочи (первые 1–2 сек) выпустить в унитаз, а затем, не прерывая мочеиспускания, собрать первую порцию мочи в чистую емкость. Продолжить мочеиспускание в унитаз. Емкость закрыть, промаркировать.

Интерпретация результатов
Единицы измерения: результат выдаётся в терминах «обнаружено» или «не обнаружено».

Референсные значения: не обнаружено.

Причины положительного результата:

  • бруцеллёз;
  • туберкулёз с поражением костно-суставной системы.

Причины отрицательного результата:

  • отсутствие бруцеллёза;
  • неправильное взятие биоматериала на исследование.

Что может влиять на результат?
Туберкулёз костно-суставной системы может приводить к ложноположительному результату.
Применение доксициклина, рифампицина, ципрофлоксацина и других фторхинолонов, способствует ложноотрицательному результату.

источник

СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

Всероссийский государственный центр качества и стандартизации ле-карственных средств для животных и кормов (ВГНКИ), Москва, Россия

Бруцеллез (Brucellosis) — хроническое заболевание многочис-ленных видов теплокровных животных и человека, вызываемое бак-териями рода Brucella. Болезнь наносит существенный экономиче-ский ущерб животноводству и имеет социальное значение, поражая человека. Хорошо известно, что для успешной борьбы с бруцеллезом важно, как можно раньше установить диагноз и приступить к прове-дению мероприятий по ликвидации источника инфекции.

В настоящее время диагностика болезни базируется на клини-ческих наблюдениях, эпизоотологических данных и результатах се-рологических, аллергических и бактериологических исследований. Однако, по спектру клинических проявлений бруцеллез похож на другие инфекционные и незаразные болезни (8), серологические и аллергические методы имеют определенные ограничения в чувстви-тельности и специфичности, а бактериологический — является трудо-ёмким и продолжительным по времени выполнения.

Для усовершенствования диагностики бруцеллеза нами разра-ботана тест-система «БРУ-КОМ», основанная на применении поли-меразной цепной реакции (Сертификат соответствия № РОСС RU. ФВ01.В08450), которая позволяет выявлять ДНК бруцелл всех видов в молоке, крови, сперме, внутренних органах и лимфатических узлах инфицированных животных (4,5,6).

Целью настоящего исследования являлось сравнительное изу-чение чувствительности тест-системы «БРУ-КОМ» и бактериологи-ческого метода исследования при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота в полевых условиях.

Материалы и методы. Исследования были проведены с ис-пользованием материала от коров из хозяйства, в котором бруцеллез был зарегистрирован в 2002 году. В течение предыдущих 25 лет хо-зяйство было благополучным по этому заболеванию. Специфическая профилактика бруцеллеза животных не проводилась.

Согласно результатам серологических исследований, выпол-ненных в период с 9.03 по 16.08.02 г., на бруцеллез реагировали по-ложительно 17 коров. При этом положительные результаты при ис-следовании в РА, РСК, РБП и РИД совпадали у 10 голов; в РА, РСК и РБП — у 6 голов; РСК и РБП — у 12 голов.

Сомнительные результаты были зарегистрированы при иссле-довании 12 голов и совпадали в РА, РСК и РБП — у 2 голов; в РА и РБП — у 6 голов; в РСК и РБП — у 1 головы. Сомнительно только в РА реагировали 2 головы и только в РСК — 1 голова.

Все животные, сомнительно и положительно реагировавшие на бруцеллез, были убиты.

При серологическом исследовании оставшихся 704 коров поло-жительно реагировали на бруцеллез 9 голов и сомнительно — 5 голов. Динамика роста количества положительных результатов серологиче-ских исследований свидетельствовала об остром течении болезни.

С целью получения материала для исследования был проведен убой 5-ти коров положительно — и 2-х — сомнительно реагирующих на бруцеллез по результатам серологического исследования.

После убоя из туш животных были отобраны образцы материа-ла: лимфатические узлы (заглоточные, предлопаточные, надколен-ные, надвыменные, парааортальные, тазовые) целиком и внутренние органы (селезенка, печень) в объеме примерно 443 см. Перед ис-следованием лимфатические узлы и кусочки органов погружали в 96 %-ный спирт ректификат и обжигали, повторив подобную операцию 3-4 раза. Для отбора проб из образцов материала использовали пасте-ровские пипетки, у которых были надпилены и отломлены оттянутые концы в области на 1 см выше от начала сужения. Подготовленные таким образом пипетки, путем легкого надавливая и вращения, по-гружали в образцы материала (для каждого образца использовали от-дельную пипетку). Пробы материала, заполнившие пипетки, перено-сили в отдельные универсальные пластиковые пробирки с предвари-тельно налитым в объеме по 3 мл физиологическим раствором и из-мельчали до получения гомогенной взвеси. Для этого стерильную па-стеровскую пипетку с отломленным на 1-2 мм кончиком вносили в пробирку с пробой материала и при легком надавливании производи-ли вращательное движение пипеткой вокруг ее оси в разные стороны, разрушая оттянутую часть. Для измельчения каждой пробы материа-ла использовали 1-2 пипетки.

После отстаивания взвеси в течение 15-20 мин надосадочную жидкость в объеме по 100 мкл переносили в 2-3 пробирки и исполь-зовали для выделения ДНК методом сорбции на силикагеле (7) с по-мощью набора «ДНК-сорб-В» (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва). ПЦР проводили с использованием тест-системы «БРУ-КОМ».

Кроме того, полученные взвеси использовали для бактериоло-гического исследования. С этой целью взвесь каждой пробы материа-ла перемешивали путем пипетирования, затем переносили в объеме по 1,5-2,0 см3 в пробирку с мясо-пептонным печеночным глюкозо-глицериновым бульоном и, перемешав в нем, высевали примерно по 1,5 см3 в две пробирки на скошенный мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар с добавлением 5 % аминопептида и се-лективной добавкой.

Посевы инкубировали при температуре 37-38 °С в течение 30 суток. Перед помещением в термостат посевы каждой пробы матери-ала в одной пробирке на плотной питательной среде парафинирова-ли. Учет посевов и орошение посевным материалом поверхности плотной питательной среды проводили через каждые 5 дней. Культу-ры бактерий, выросшие на плотной питательной среде в виде коло-ний или налета и похожие при этом на культуру бруцелл, пересева-лина Ml 1111 ГА, скошенный в пробирках. Полученные двухсуточ-ные культуру оценивали визуально, а приготовленные из них мазки, окрашенные по Граму и Козловскому, микроскопировали под иммер-сией при увеличении 1090. Кроме того, культуры идентифицирова-ли в пластинчатой РА с S и R-антибруцеллезными сыворотками, раз-веденными соответственно 1:50 и 1:5, и по способности продуциро-вать сероводород.

Для сравнения чувствительности тест-системы «БРУ-КОМ» и бактериологического метода исследования была выполнена стати-стическая обработка полученных данных.

Объектом статистического наблюдения являлась совокупность проб, отобранных параллельно из одних и тех же образцов материа-ла, взятых от 5 коров положительно- и 2-х – сомнительно реагирую-щих на бруцеллез в серологических реакциях, а также плода одной из коров.

При статистической группировке за единицу наблюдения при-нимались результаты исследования одной пробы патологического материала. Результаты группировали по методу исследования. Дру-гим признаком, характеризующим единицы наблюдения, была оцен-ка результата исследования — положительная либо отрицательная.

Чтобы оценить значимость различий результатов двух совокуп-ностей исследований, использовали методом 2(3):

Ф — эмпирические данные (частоты полученного распределе-ния);

О — ожидаемые данные (частоты теоретического распределе-ния).

Число степеней свободы v для сопоставляемых данных пред-ставленных в виде таблицы 2 определяли по формуле:

 = (число строк -1)  (число граф -1).

При расчетах 2 выдвигается т.н. нулевая гипотеза, согласно которой частота получения положительных результатов в интересу-ющих нас совокупностях предположительно одинакова, т.е. значение 2 равно нулю. При наличии различий между сравниваемыми рас-пределениями оно возрастает. Расчетный результат сравнивали с таб-личными значениями 2.

Достоверность различий в эффективности выявления ДНК бруцелл методом ПЦР из разных образцов патматериала определяли аналогичным образом.

Результаты исследования. Результаты исследования проб ма-териала от коров методом ПЦР представлены на рис.1. Согласно дан-ным рисунка наличие ДНК бруцелл зарегистрировано в материале от 6-ти из 7-ми исследуемых коров. В частности, в 2-х пробах — от коро-вы № 3466, в 13-ти пробах — от коровы № 2360, а также в 1 -ой пробе от плода этой коровы, в 10-ти пробах — от коровы № 99, в 1-ой пробе — от коровы № 3457, в 3-х пробах — от коровы 3157, в 8-ми пробах — от коровы № 3491. Материал от коровы № 230 был исследован с отрица-тельным результатом.

Культура бруцелл выделена из материала от 5 коров: из 1-ой пробы — от коровы № 3466; из 7-ми проб — от коров № 2360; из 4-х проб — от коровы № 99; из 1-ой пробы — от коровы № 3157; из 2-х проб — от коровы № 3491.

Рис. 1 Результаты исследования проб материала от коров №№ 3466, 3457, 2360, 3157, 230, 99, 3491 методом ПЦР

— К+ — положительный контроль

— К– — отрицательный контроль

-10 — парааортальный правый

— 2360* — 14, 15, 16 пробы от плода

Всего, при исследовании 94-х проб материала, культура бруц-елл выделена из 15-ти — что составило 15,3 %. Наличие ДНК бруцелл было выявлено в 38 (40,4 %) пробах от шести коров. Причем, все по-ложительные результаты бактериологического исследования были подтверждены положительными результатами исследования матери-ала методом ПЦР. Согласно результатам идентификации все выде-ленные культуры бруцелл были отнесены к В.abortus.

Представлялось интересным установить, в каких объектах ис-следования (лимфатических узлах, печени, селезенке) статистически достоверно чаще обнаруживается генетический материал бруцелл.

Данные таблицы 1 показывают, что в конкретном случае из лимфатических узлов ДНК бруцелл выделяли значительно чаще. Справедливо ли это заключение для большего числа наблюдений проверили с помощью критерия 2.

Частота выявления ДНК бруцелл в разных объектах исследования

источник

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан» дартиэации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «8ГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. № 82-П)

‘ а принятие проголосовали:_

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97

Код страны по МК 3 и позволяющий получать частицы суспензии диаметром 10 — 50 мкм.

Микроскоп иммерсионный или стереоскопический по ГОСТ 8074.

Центрифуга лабораторная со скоростью вращения до 6000 об./мин.

СОг-инкубатор или эксикатор стеклянный (микроанаэростат) с содержанием углекислого газа от 10% до 15%.

Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 -‘С до 50 °С.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317.

Баня водяная с терморегулятором.

5.2 Питательные среды и реактивы

Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16260.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Кислота борная по ГОСТ 9656 или ГОСТ 18704.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Кристаллический фиолетовый (генцианеиолет) по ГОСТ 4919.1.

Малахитовый зеленый по ГОСТ 4919.1.

Метанол технический по ГОСТ 2222.

Метиленовый синий по ГОСТ 4919.1.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.

Раствор натрия хлорида 0.9 %-ный изотонический (физиологический раствор).

Физиологический раствор фенолиэированный 0.5 %-ный.

Сафранин. 2 %-ный водный раствор по ГОСТ 4919.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Стандарт мутности оптический, эквивалентный 10 международным единицам.

Пипетки градуированные вместимостью 1.2.5 и 10 см 3 по ГОСТ 29230.

Пипетки Мора вместимостью 100 см 3 .

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пробирки серологические Флоринского по ГОСТ 25336.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

Чашки бактериологические одноразового использования или стеклянные по ГОСТ 25336.

5.4 Животные и материалы Бактериофаг бруцеллезный*.

Бумага фильтровальная марок ФБ-II или ФБ-HI по ГОСТ 12026.

Добавки селективные, ингибирующие рост посторонней микрофлоры и не влияющие на рост бруцелл**.

Дозаторы одкоканальные пипеточные переменного объема.

Иглы ветеринарные для взятия крови.

Иглы инъекционные по ГОСТ ISO 7864.

Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739.

Наконечники для дозаторов вместимостью 0.2. 0.5 и 1.0 см 3 .

Пакет для гомогенизации с фильтром.

Перчатки анатомические медицинские одноразовые по ГОСТ 32275.

Перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3.

* Примером может служить бактериофаг Тбилиси (76). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

’* Примером селективной добавки служит добавка, содержащая во флаконе: полимиксин В — 2500 ME. 6а-цитрацин — 12500 ME. циклогексимид — 50.0 ME. нистатин — 50000 ME. натамицин — 50,0 мг. налидиксоеую кислоту — 2.5 мг. ванкомицин — 10.0 мг. Содержимое флакона может не содержать циклогексимид. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241.

Свинки морские массой 300 —400 г.

Сыворотка крови крупного рогатого скота или лошади (нормальная, стерильная).

Шприцы медицинские инъекционные многократного применения по ГОСТ 22967.

Шприцы медицинские инъекционные однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.

Штативы 100-гнеэдмые для пробирок Флоринского.

5.5 Допускается применение других средств измерений и посуды с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше.

5.6 Допускается применение готовых питательных сред, а также других сред, приготовленных по прописи производителя, предназначенных для культивирования бруцелл с проверенными ростовыми свойствами.

5.7 Допускается применение готовых растворов генциан фиолетового. Люголя, фуксина Циля, малахитового зеленого и 5%-ной спиртовой настойки йода.

5.8 Допускается использовать другие селективные добавки, обладающие аналогичным действием, указанным в 5.4.

5.9 Допускается использовать посуду одноразового применения.

6.1.1 Материал для диагностики бруцеллеза отбирают от каждого животного в отдельности.

6.1.2 При взятии проб необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды в соответствии с требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

6.1.3 Пробы направляют в лабораторию и исследуют в день отбора или на следующий день.

6.2 Отбор проб патологического материала

6.2.1 Для бактериологического и молекулярно-генетического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от многоплодных животных берут не менее трех плодов). От плодов крупных животных направляют селезенку, печень, желудок с содержимым. перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

6.2.2 Если в течение 24 —30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30 %-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в четыре —пять раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

6.2.3 От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для молекулярно-генетического исследования на бруцеллез.

6.3 Отбор проб для прижизненной диагностики бруцеллеза

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут:

• содержимое гигром, бурс и абсцессов.

При диагностическом убое дополнительно берут:

• лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, предлопаточные. надколенные, подколенные. надвыменные. парааортальные. тазовые;

6.3.2.1 Кровь морских свинок для получения сыворотки с последующим исследованием при постановке биопробы берут из краевой ушной вены или из сердца по 1—3 см 3 стерильными шприцами в стерильные пробирки подходящей вместимости.

6.3.2.2 Приготовление сыворотки

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при температуре 30 °С — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С — 10 °С. Через 20 — 24 ч полученные сыворотки сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию.

6.3.2.3 Пробы крови от животных для бактериологического исследования берут стерильными шприцами в объеме 18 — 20 см 3 , в которые предварительно набирают антикоагулянтное средство (глюгицир или аналогичное>. Сразу после взятия крови иглы, не отсоединяя от шприцев, закрывают колпачками и перемешивают содержимое, переворачивая шприцы. Перед посевом использованные иглы заменяют стерильными.

6.3.3.1 Перед взятием проб молока у коров (буйволиц) вымя обмывают теплой водой, соски об* рабатывают 70 %-ным этиловым спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в объеме 10 —15 см 3 в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

6.3.3.2 У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70 %-ным этиловым спиртом и смазывают 5 %-ным раствором йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко в объеме 10 см 3 и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

6.3.4 Отбор проб содержимого гигром, бурс и абсцессов

При взятии содержимого гигром, бурс и абсцессов в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70 %-ным этиловым спиртом и смазывают 5%-ным раствором йода. Затем стерильным шприцем с ветеринарной иглой для взятия крови делают пункцию, отбирают содержимое гигромы, бурсы или абсцесса и переносят его в стерильную бактериологическую пробирку вместимостью 16—18 см 3 с резиновой пробкой.

6.3.5 Упаковка и маркировка проб

6.3.5.1 Отобранные в стерильные пробирки пробы крови и молока помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

Пробы патологического материала упаковывают в пергаментную бумагу, маркируют и помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

6.3.5.2 Пробы маркируют с указанием:

— вида, попа и возраста животного;

— инвентарного номера животного;

7 Бактериоскопический метод

Сущность бактериоскопического метода заключается в окрашивании мазков и мазков-отпечатков из патологического материала и последующем микроскопическом выявлении клеток бруцелл.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка растворов для окраски

7.2.1.1 Приготовление кристаллического фиолетового и генцианового фиолетового

Берут 1 г кристаллического фиопетоеого или генцианового фиолетового и растирают в ступке с 2 г фенола, добавляя небольшими порциями 96 %-ный этиловый спирт в объеме 10 см 3 . После полного растворения краски в ступку при постоянном помешивании добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см 3 .

Срок хранения растворов при температуре от 2 °С до 10°С — не более 6 мес.

7.2.1.2 Приготовление раствора Люголя

Для приготовления раствора Люголя в 10 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают в течение 5 — 6 ч до полного растворения йода и добавляют 290 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 10 °С а склянке из темного стекла — не более 30 сут.

7.2.1.3 Приготовление карболового фуксина Циля

Для приготовления карболового фуксина Циля 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллического фенола и 0.5 см 3 глицерина, добавляя небольшими порциями 96 %-ный этиловый спирт в объеме 10 см 3 , а затем при постоянном помешивании в ступку добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см 3 .

Срок хранения раствора при температуре 18 °С —- 22 °С во флаконах из темного стекла с при* тертой пробкой —не более 6 мес.

Непосредственно перед работой к одной части полученного раствора карболового фуксина Циля добавляют девять частей дистиллированной воды.

7.2.1.4 Приготовление 0,75 %-ного и 1.0 %-ного водных растворов малахитового зеленого Берут 0.75 или 1.00 г малахитового зеленого и растворяют в 100 см 3 кипящей дистиллирован*

Срок хранения раствора при температуре от2 0 Сдо8′ : ‘С — не более 1 мес.

7.2.1.5 Приготовление 0.5 %*ного раствора уксусной кислоты

Берут 0.5 см 3 уксусной кислоты и добавляют 99.5 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 1 мес.

7.2.1.6 Приготовление 1 %-ного водного раствора метиленового синего

Берут 1 г метиленового синего и растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранешя раствора при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 1 мес.

7.2.1.7 Приготовление 2 %-ного водного раствора сафранина

Берут 2 г сафранина и растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2 0 С до 8 °С — не более 1 мес.

7.2.1.8 Приготовление 5 %-ного спиртового раствора йода

Берут 5 г кристаллического йода и переносят в мерную колбу вместимостью 250 см 3 , добавляют 10 г калия иодида и равные объемы дистиллированной воды и 96 %*ного этилового спирта, доводя раствор до объема 100 см 3 .

Срок хранения раствора при температуре не выше от 2 °С до 25 °С в склянке из темного стекла — не более пяти лет.

7.2.1.9 Приготовление 3 %-ного слиртоаого раствора гидроокиси калия

Берут 3 г гидроокиси калия, растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды и в мерной колбе вместимостью 200 см 3 доводят объем раствора 96 %-ным этиловым спиртом до 100 см 3 . Декантируют прозрачный раствор.

Срок хранения раствора при температуре не выше 25 °С не более одного года.

7.2.2.1 Из проб патологического материала по 6.2 делают по два мазка. При исследовании абортированных плодов готовят мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (печени, селезенки), котиледонов плодовых оболочек и другого плотного материала, а жидкий материал (содержимое желудка. жидкости брюшной и грудной полостей, околоплодную жидкость) наносят на предметные стекла пастеровской пипеткой.

7.2.2.2 Для приготовления мазкое-отпечатков используют чистые обезжиренные предметные стекла. Абортированный плод вскрывают, поверхность паренхиматозных органов, котиледонов плодовых оболочек и другого плодного материала стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая факелом, смоченным 95 %-ным этиловым спиртом. Стерильными ножницами вырезают кусочки размером 1.5 * 1.0 * 1.5 см и прикладывают поверхности срезов к предметному стеклу (по три отпечатка на два предметных стекла). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе в течение 5 мин и фиксируют над пламенем горелки. Мазки-отпечатки на одном предметном стекле окрашивают по Козловскому или Стампу, на другом — по Г раму.

7.3 Проведение исследования

Для окраски мазкое по Граму на фиксированный мазок по 7.2.2 кладут кусочек фильтровальной бумаги, наносят кристаллический фиолетовый или генциан фиолетовый и выдерживают в течение 2 мин. после чего снимают бумагу, сливают краску, промывают дистиллированной водой и наносят на мазок раствор Люто ля (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наносят 96 %-ный этиловый спирт на 0.5 —1.0 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают разведенным в соотношении 1:10 фуксином Циля в течение 1-2 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

Если после нанесения раствора Люголя мазок не чернеет, то необходимо приготовить новый раствор.

7.3.2 Окрашивание по Козловскому

Для окраски по Козловскому фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают 2 %-ным водным раствором сафранина с подогреванием на водяной бане до появления пузырьков. Мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают 0.75 %-ным или 1 %-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 0.5 —1.0 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.3 Окрашивание по Стампу

Для окраски по Стампу фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают в течение 10 мин карболо-вым фуксином Циля, разведенным no 7.2.1.3 в соотношении 1:10. Мазок промывают дистиллированной водой, а затем 0.5 %-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают 1 %-ным раствором метиленового синего в течение 20 — 30 с. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.4 Полученные по 7.3.1 — 7.3.3 мазки микроскопируют под иммерсионным маслом.

При микроскопии окрашенных мазков, содержащих бруиеллы. должны наблюдаться мелкие, грамотрицательныв. расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии. окрашенные в красный цвет.

Сущность культурального метода заключается в посеве патологического материала на питательные среды с последующим культивированием, идентификацией и дифференциацией выделенной культуры.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 дм 3 водопроводной воды и выдерживают в течение 15 — 18 ч в прохладном месте. Затем сливают полученный настой в колбу вместимостью 2 дм 3 или кастрюлю из нержавеющей стали вместимостью 3 дм 3 и кипятят в течение 30 — 40 мин на электрической или газовой плите, доливают дистиллированную воду до объема 1 дм 3 и фильтруют через ватко-марлевый или тканевый фильтр. Полученную мясную воду стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 мин.

Срок хранения мясной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5 — 15 дм 3 при температуре от 2 °С до 25 “С — не более одного года.

8.2.2 Приготовление печеночной воды

Для приготовления печеночной воды свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 вносят 500 г фарша, заливают 1 дм 3 водопроводной воды, настаивают в течение 1 ч и кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин. После отстаивания фарш удаляют, а полученную жидкость доводят до 1 дм 3 дистиллированной водой и фильтруют через ватко-марлевый фильтр или тканевый фильтр. Полученную печеночную воду разливают по колбам и стерилизуют при температуре 11S °С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин.

Срок хранения печеночной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5 — 15 дм 3 при температуре от 2 °С до 25 °С — не более одного года.

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 наливают 610 см 3 мясной воды по 8.2.1 и 305 см 3 печеночной воды по 8.2.2.10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 20 — 30 г пищевого или микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 30 мин. устанавливают pH 7.2 — 7.4 10 %-ным раствором натрия гидроокиси, добавляют 10 г глюкозы и 20 см 3 глицерина и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки по 7-8 см 3 или во флаконы по 250 —300 см 3 соответствующей вместимости и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. pH среды после стерилизации составляет 6.8 —7.0.

Срок хранения МППГТБ в пробирках и флаконах при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 3 мес.

6 емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 наливают 610 см 3 мясной во-ды по 8.2.1 и 305 см 5 печеночной воды по 8.2.2. 10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 20 —30 г микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 1 ч. устанавливают pH 7.2 —7.4 10 %-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют 10 г глюкозы и 20 см 3 глицерина и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки или флаконы вместимостью 500 см 3 и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. pH среды после стерилизации составляет 6.8 —7.0.

Срок хранения МППГГА в пробирках и флаконах при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 3 мес.

МППБ готовят аналогично МППГГА по 8.2.3 без добавления агара, глюкозы и глицерина.

Срок хранения МППБ при температуре от 2 °С до 8 *С — не более 3 мес

8.2.6 Приготовление сывороточко-декстрозного агара

8 емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью Здм 3 наливают 835 см 3 дистиллированной воды, добавляют 20 г пищевого или микробиологического агара. 10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 165 см 3 мясной воды по 8.2.1. Полученную смесь кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин до расплавления агара. pH до стерилизации — 7.8. Затем стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 ч. затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят pH среды до 7,2-7.4 10 %*ным раствором гидроокиси натрия, разливают в колбы (пробирки, флаконы) и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. После стерилизации pH среды составляет 6.8 —7.0.

Срок хранения сывороточно-декстрозного агара при температуре от 2 °С до 8 *С —не более 3 мес.

Перед применением среду в колбах (пробирках, флаконах) расплавляют в кипящей водяной бане. охлаждают до температуры 50 °С —60 °С и добавляют 40 %-ный стерильный раствор глюкозы в количестве 1 % к объему питательной среды во флаконе (например. 2.5 см 3 40 %-ного стерильного раствора глюкозы добавляют к 97.5 см 3 питательной среды).

8.2.7 Приготовление селективной добавки для внесения в питательные среды

Содержимое флакона по 5.4 растворяют в 5 см 3 50 %-ного метилового спирта и перемешивают

до образования гомогенной суспензии.

Раствор используют свежеприготовленным.

Полученное количество селективной добавки стерильно добавляют к 500 см 3 расплавленной питательной среды.

8.3 Проведение исследования

8.3.1 Перед посевом материала кожу абортированного плода по белой линии живота протирают тампоном, смоченным 5 %-ным раствором фенола, приготовленного путем растворения 5 г кристаллического фенола в 100 см 3 дистиллированной воды. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей пастеровскими пипетками высевают в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь переносят в объеме по 1.0-1.5 см 3 на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в двух пробирках. Содержимое желудка в объеме по 1 —2 см 3 высевают в две пробирки с МППГББ и в пять пробирок на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6.

8.3.2 Лимфатические узлы, очищенные от жира и мышечных волокон, кусочки печени и селезенки размером 2.0 * 1,5» 2.5 см погружают в 96 %-ный этиловый спирт на 1 с и обжигают, проведя над пламенем спиртовки. После обработки от лимфоузлов стерильными ножницами отрезают кусочки размером 1 —2 см. Подготовленный материал помещают в пакет для гомогенеэации с фильтром, добавляют 4 —5 см 3 физиологического раствора и гомогенезируюг с использованием гомогенизатора по 5.1.

Допускается приготовление суспензии путем растирания материала в стерильной фарфоровой ступке с добавлением физиологического раствора до получения однородной гомогенной суспензии.

Полученный гомогенат высевают пастеровской пипеткой по 0.1 —0,2 см 3 на поверхность предварительно подсушенных после скашивания плотных питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 в пробирках и на чашки Петри.

Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из лимфатических узлов и органов. Для этого место прокола пастеровской пипеткой предварительно прижигают шпателем.

нагретым над пламенем спиртовки. Из каждого объекта проводят посев в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь в объеме по 1.0 —1.5 см 3 переносят на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 едва пробирки.

8.3.3 Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем в десять пробирок на среды по 8.2.4-8.2.6.

8.3.4 При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

8.3.5 Из плодовых оболочек вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3 %-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их промывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в гомогенизаторе или в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой в пробирки со средами по 8.2.3. 8.2.4 или 8.2.6. содержащими бактериостатические красители: генцианвиолет в разведении 1:200000 (0.1 см 3 0.5 %• ного слиртоводного раствора генцианвиолета на 100 см 3 среды) или кристаллвиолет в разведении 1:100000. генцианвиолет и малахитовую зелень в разведении каждой краски 1:200000. уксуснокислый натрий из расчета 12.5 мг на 100 см 3 среды, или селективную добавку, ингибирующую рост посторонней микрофлоры и грибов.

8.3.6 Содержимое бурс, гигром и абсцессов высевают на три-четыре чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. содержащей бактериостатические красители Во всех случаях вместо бактериостатических красителей допускается применение селективных добавок.

8.3.7 Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об./мин. Верхний спой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0.1 —0.2 см 3 вносят в три-четыре чашки Петри со средами по 8.2.4 и 8.2.6. содержащими бактериостатические красители или селективные добавки.

8.3.8 Для выделения культуры бруцелл. в том числе и Brucella canls. кровь от животных с антикоагулянтом вносят по 10 —18 см 3 во флаконы, содержащие по 100 см 3 МППГГБ. и по 0.3 —0.5 см э в чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. Посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды. Через 25 —30 мин чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С — 38 °С агаром вверх. Туда же помещают и флаконы с посевами.

Через семь суток инкубирования из посевов во флаконах делают пересев на три пробирки с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6 и инкубируют при тех же условиях.

8.3.9 При исследовании материала от крупного рогатого скота половину пробирок и чашек Петри культивируют в термостате при температуре 37 °С — 38 °С. другую — в СОг-инкубаторе с содержанием 5 % —10 % углекислого газа или эксикаторе (микроакаэростате).

Примечание — Допускается культивирование в пробирках, которые плотно укупоривают резиновыми пробками и заливают парафином или обертывают ватно-марлевые пробки парафильмом.

8.3.10 Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

• внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0.48 г бикарбоната натрия и 5 см 3 25 %-ного раствора кислоты или 0.4 г бикарбоната натрия и 0.35 см 3 концентрированной соляной кислоты на 1 дм 3 объема):

• сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

8.3.11 Посевы, полученные по 8.3.1 —8.3.9. выдерживают в термостате при температуре 37 °С — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 48 — 72 ч. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

В последующем посевы просматривают каждые 4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80 % и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

8.4.1 При просмотре посевов обращают внимание на характер роста бактерий.

8.4.2 На поверхности твердых питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью бесцветные колонии, имеющие в отраженном сеете голубоватый оттенок, в падающем свете —сероватый. При длительном культивировании колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

8.4.3 В жидких питагепьных средах по 8.2.1. 8.2.3 и 8.2.5 бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над поверхностью бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

8.4.4 При обнаружении роста на жидких питательных средах и отсутствии характерного роста на твердых питательных средах из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из методов по 7.3.1— 7.3.2. и делают пересев на чашки Петри с твердой питательной средой для выделе* ния чистой культуры. Пересевы на чашках Петри культивируют так же. как и высевы из патологического материала. При отсутствии роста культуры бруцелл наблюдение за посевами прекращают по истечении 30 сут.

9 Идентификация выделенных культур

9.1 Пластинчатая реакция агглютинация

9.1.1 Подготовка к исследованию

9.1.1.1 Подготовка двухсуточных культур бруцелл

Для идентификации используют двухсуточные агаровые культуры (иэоляты) бруцелл. выделенные из патологического материала. С этой целью выделенные культуры пересевают бактериологической петлей штрихом на поверхность плотной питательной среды по 8.2.4. 8.2.6, скошенной в пробирках. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С —38 °С в течение двух суток. Выращенные культуры исследуют непосредственно после извлечения из термостата.

Примечание —Допустимый срок хранения культур при температуре от 2°С до 8*С—не более 14 сут.

9.1.1.2 Подготовка Я• и S-бруцеллеэных агглютинирующих сывороток

R. и 5- бруцеллезные агглютинирующие сыворотки разводят 0,5 %-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения. Разведенные сыворотки хранят при температуре от 2 °С до 8 °С и используют в течение 30 сут.

9.1.2 Проведение исследования

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле Я- и S-бруцеллезных сывороток по

9.1.1 и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно перемешивают в капле S-. Я-бруцеллезной сыворотки и физиологического раствора. Параллельно ставят контроли: со стандартными S- и Я-бруцеллеэными сыворотками и гомологичными антигенами.

9.1.3 Учет и оценка результатов реакции агглютинации

При положительной РА в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

Реакцию учитывают визуально в течение 1-3 мин и оценивают в крестах:

• ■♦+♦+* (четыре креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината —положительная реакция;

• «+♦+» (три креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

• «++» (два креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

•«+» (один крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом —сомнительная реакция;

• «•» (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная —отрицательная реакция.

Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях Я- и

S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем на два креста, а с физиологическим раствором — отсутствует.

9.1.4 Обработка результатов

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными (см. раздел 8) и тинкгориальными свойствами (см. раздел 7), а также дающие положительную реакцию агглютинации с S- или Я-бруцеллезной сывороткой или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, считают бруцеллами.

9.2 Методы определения диссоциации культур бруцелл

9.2.1 Проба на стекле с раствором акрифлавина

На предметное стекло наносят каплю раствора акрифлавина в разведении 1:1000 в дистиллированной воде, в которой суспензируют с помощью бактериологической петли испытуемую культуру. У диссоциированных культур (Я- форма) в течение 1—2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культур бруцелл в S-форме остается гомогенной.

9.2.2 Реакция термоаггтотииации

Взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе ло 9.1.1 с со» держанием ло оптическому стандарту мутности 1 млрд/см 3 микробных клеток в объеме 4-5 см 3 про» гревают в пробирке вместимостью 20 см 3 на водяной бане при температуре 90 °С в течение 30 мин.

Результаты учитывают через 30 мин. 1 ч и через 24 ч при комнатной температуре.

При наличии диссоциации наступает выраженная агглютинация клеток бруцелл с формированием осадка, тогда как суспензия недиссоциированной культуры бруцелл в S-форме остается гомогенной.

9.2.3 Окраска колоний по Уайт-Билсону

Двухсуточную агаровую культуру бруцелл по 9.1.1 разводят физиопогическим раствором с таким расчетом, чтобы она по мутности соответствовала 10 ЕД оптического стандарта мутности. Полученную суспензию в объеме 3 см 3 смешивают с 2 см 3 физиологического раствора и делают десятикратные разведения до 10*. используя для каждого разведения отдельную пипетку, и высевают по 0.1см э на четыре-шесть чашек Петри с МППГГА. Поверхность агара в чашках равномерно орошают посевным материалом, выдерживают на горизонтальной поверхности стола в течение 20-30 мин и инкубируют при температуре 37 °С — 38 «С агаром вверх в течение 4-S сут.

Окраску колоний проводят рабочим раствором кристаллического фиолетового, приготовленного ло 7.2.1.1 в разведении 1:2000. В чашку Петри с изолированными колониями бруцелл пастеровской пипеткой с грушей вносят осторожно без напора рабочий раствор кристалвиолета. Через 30 с раствор краски удаляют с помощью пипетки с грушей, сливая в дезинфицирующую жидкость (3 %-ный раствор фенола или 5 %-ный раствор хлорамина). Колонии просматривают под бинокулярной лупой.

Колонии бруцелл в Я-форме (диссоциированные) имеют равномерно окрашенный широкий периферический ободок синего или фиолетового цвета и менее интенсивно окрашенную поверхность такого же цвета, иногда с исчерченностью.

Колонии бруцелл в S-форме имеют тонкий периферический ободок, окрашенный в синий или фиолетовый цвет. Центральная часть колоний светло-желтого цвета (не окрашивается).

9.3 Методы дифференциации бруцелл

Для дифференциации бруцелл используют следующие тесты:

— устойчивость к фуксину и тионину;

• способность аглютинироваться монорецепторными A.MuRбруцеллезными сыворотками:

9.3.1 Образование сероводорода (H2S)

9.3.1.1 Подготовка к исследованию

В качестве реактива применяют насыщенный водный раствор уксуснокислого свинца (30 г свинца растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды), которым пропитывают полоски фильтровальной бумаги размером 1 * 8 см. Пропитанные полоски фильтровальной бумаги высушивают при температуре ^ С — 20 °С в течение 20 мин.

Срок хранения пропитанных полосок фильтровальной бумаги в банке из темного стекла с притертой пробкой — не более 2 мес.

9.3.1.2 Проведение исследования

Двухсуточную взвесь культуры бруцелл по 9.1.1 в физиологическом растворе концентрацией 2 * 10*/см 3 микробных клеток по оптическому стандарту мутности на 10 ЕД засевают в пробирку бактериологической петлей на скошенную поверхность печеночного агара ло 6.2.4. Полоску фильтровальной бумаги зажимают между пробиркой и ватной пробкой так. чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался поверхности питательной среды.

Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.

Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °С — 38 Л С на 6 сут.

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего конца полоски, которое измеряют в миллиметрах.

Результаты учитывают через каждые 2 сут в течение 6 сут. При каждом учете тест-полоску заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода полученные три значения суммируют.

Суммарное значение почернения тест-полосок, свидетельствующее о продуцировании сероводорода. составляет для культур:

• В. abortus (биовар 1) — 5-7 мм:

Культура В. metoensis (биоеар 1), как правило, не образует сероводорода или вызывает только слабо выраженное почернение тест-лолосхи. Культуры В. ovis и в .canis сероводород не продуцируют.

9.3.2 Определение редуцирующей активности в отношении красок

9.3.2.1 Подготовка к исследованию

Для приготовления исходных растворов фуксина и тионика в разведении 1:1000 во флаконах вместимостью 200 см 3 смешивают 0.1 г краски. 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 80 см Ь дистиллированной воды.

Срок хранения исходных растворов фуксина и тионина в темном месте — не более 6 — 10 мес.

Для приготовления питательной среды МППГГА с красками к 100 см 3 охлажденного до температуры 50 °С — 60 °С агара с соблюдением правил асептики добавляют 2 см 3 исходного раствора краски для получения разведения 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 — 25 см 3 в чашки Петри и подсушивают при комнатной температуре, не открывая чашки.

Срок хранения среды с красками в холодильнике при температуре от 2 9 С до 8 “С — не более 10— 15сут.

Обесцвеченные среды для тестирования не используют.

9.3.2.2 Проведение исследования

Взвесь бруцепл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы испытуемых культур проводят бактериологической петлей из взвеси, содержащей 2 млрд/см 3 микробных клеток, на среду МППГГА с фуксином и тиоником по 9.4.2.1 и на среду МППГГА без добавления красок (контроль). Одну петлю взвеси засевают путем нанесения пяти отдельных штрихов на поверхность агара. На одну чашку Петри можно одновременно засевать четыре—шесть культур, предварительно разделив чашку Петри на четыре—шесть секторов.

Чашки с посевами переворачивают агаром вверх и выдерживают в термостате при температуре 37 °С — 38 9 С в течение 3 сут.

Учет результатов проводят через трое суток инкубации по следующей схеме:

• выраженный рост культуры во всех штрихах «♦+♦+»;

• выраженный рост в первых двух и более слабый в последующих штрихах «++♦»;

• умеренно выраженный рост в первых двух штрихах и слабый или отсутствие роста в остальных штрихах «++»:

• слабый сплошной рост или отдельные колонии в первых двух штрихах «+».

9.3.3 Реакция агглютинации с монорецепторными А и М бруцеллезными сыворотками

9.3.3.1 Проведение испытания

Для проведения РА монорецепторные А и М бруцеллезные сыворотки разводят последовательно двукратно, получая соотношения 1:5,1:10.1:20.1:40 и 1:80 в объеме 0.5 см 3 . В качестве антигена используют взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе е концентрации 2 млрд/см 3 микробных клеток по оптическому стандарту мутности.

Антиген добавляют по 0.5 см 3 во все пробирки таким образом, разведение сыворотки удваивается (1:10.1:20 ит. д.).

Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16 —18 ч. а затем в течение 1 ч при комнатной температуре.

Положительная РА в разведении сыворотки 1:20 с оценкой не менее чем на два креста позволяет отнести культуру бруцеллы к виду B.abortus или В. malitensis.

9.3.4 Определение чувствительности культур бруцелл к фагу ТЪ

Бруцеллезный фаг ТЬ избирательно лизирует бруцеллы вида В. abortus, находящиеся в S-форме.

9.3.4.1 Подготовка к исследованию

Для определения чувствительности бруцелл к лизису бактериофагом используют два его разведения: 1 * 10 s корпускул/см 3 и 1 ■ 10 е корпускуп/см 3 . Разведения бактериофага готовят путем десятикратных разведений исходной культуры в физиологическом растворе.

9.3.4.2 Проведение исследования

Для исследования используют МППГГА в чашках Петри с концентрацией агара 1.5 % —1.8 %. Среду и взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с концентрацией 1 млрд/см 3 микробных клеток по ОСО мутности на 10Е подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 ч.

Взвесь культуры бруцепл подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 ч. в объеме 0.4 • 0.5 см 3 наносят на поверхность МППГТА в чашках Петри и тщательно распределяют по его поверхности. Избыток посевного материала удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки Петри подсушивают в течение 1 ч при температуре 37 °С — 38 °С до полного впитывания в агар посевного материала. После чего на поверхность питательной среды в два разных места наносят пастеровской пипеткой по одной капле 0.05 см 3 бактериофага каждого разведения. Чашки наклоняют, чтобы капли бактериофага стекли по поверхности питательной среды двумя дорожками. Контролем являются посевы культуры бруцелл на среде без внесения бактериофага. Посевы помещают в термостат агаром вверх и инкубируют в течение четырех —пяти суток при температуре 37 °С — 38 °С.

Результаты исследования учитывают в крестах:

• полный лизис культуры на месте нанесения фага (или линии стекания)

• лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки (участок лизиса) в виде сот

• резко ослабленный рост культуры бруцелл и небольшое количество бляшек «+•*■»;

• очень слабый лизис культуры бруцелл «+»:

— отсутствие лизиса культуры бруцелл «-».

За положительный результат чувствительности к лизису фагом принимают лизис культуры бруцелл не менее чем на два креста.

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода вгисеНа приведены в приложении А.

10.1 Подготовка к исследованию

Для постановки биологической пробы используют морских свинок (не менее двух животных), не реагирующих на бруцеллез при серологическом исследовании в пробирочной РА. Пробы сыворотки крови от животных в разведении 1:5 не должны агглютинировать S-бруцеллезный антиген.

10.2 Проведение исследования

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 см 3 .

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0.5 х 0.5 см. фламбируют на пламени горелки, растирают в фарфоровой ступке со стерильным песком или гомогенизируют и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке подкожно в объеме 1 см 3 .

Содержимое гигром, бурс вводят морским свинкам подкожно в объеме 0.2 — 0.3 см 3 . При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об7мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 см 3 материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

Через 15, 25 и 40 сут после заражения у морских свинок берут кровь в объеме 1—2 см 3 из ушной вены путем надреза или из сердца путем пункции и готовят сыворотку, которую исследуют в РА в пробирках в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически (раздел 8). высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку с бульоном и две пробирки с агаром из паховых, подчелюстных, заглоточных, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (два высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют по 8.3.8.

При отрицательной РА у морских свинок биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бактериологическое исследование не проводят.

При выделении культуры бруцелл на питательных средах биологическое исследование прекращают. а ранее зараженных морских свинок убивают.

Результат исследования на бруцеллез считают положительным при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, даже если из исходного материала культура бруцелл не выделена.

11 Молекулярно-генетический метод исследований

11.1 Молекулярно-генетическое исследование на бруцеллез проводят е полимеразной цепной реакции (ПЦР). руководствуясь инструкциями по применению конкретных тест-систем.

11.2 Молекулярно-генетическое исследование методом ПЦР проводят в случае аборта и (или) при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и (или) сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами из хозяйств, благополучных по данному заболеванию и для идентификации культур бруцепл (изолятов), выделенных при исследовании патологического материала.

11.3 Для исследования в ПЦР используют тот же патологический материал, что и для бактериологической диагностики.

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella А.1 Дифференциальные свойства видов и биоваров рода ВгисоНо приведены в таблице А.1.

источник

Артикул Наименование услуг Цена, руб. Доступность экспресс Ед. измер. Материалы Заказать
003 Бруцеллез (ПЦР) 800 p (Время исполнения до 72 часов) 1 исслед. J N V E C C
Читайте также:  Кому делают прививку от бруцеллеза