Бруцеллез животных методом ифа

В статье дана сравнительная оценка диагностической ценности серологических реакций при бруцеллезе животных. Были исследованы две группы животных: крупный рогатый скот и овцы. В результате исследований выяснено, что ИФА более ценный диагностический метод в сравнении с РА и РСК.

Бруцеллез–хроническая инфекционная болезнь, протекающая часто с обострениями и выраженными клиническими признаками, проявляющимися в виде абортов, задержания последов, эндометритов, орхитов, эпидидимитов, расстройств воспроизводительной способности животных, поражения опорно-двигательного аппарата[1].

Бруцеллезом болеют животные всех видов. Резервуаром и переносчиком возбудителя бруцеллеза могут быть многие представители дикой фауны. Благодаря этому бруцеллез получил широкое распространение.

Ликвидация бруцеллеза представляет собой мировую проблему для медицинского и ветеринарного здравоохранения. В борьбе с бруцеллезом большое значение имеет диагностика, в частности иммунологические методы.

Для проведения массовых профилактических и диагностических обследований скота на бруцеллез широко используют РА, РСК и РДСК. Кроме этих реакций, применяют пластинчатую РА с роз-бенгал-антигеном (роз бенгал проба — РБП) и кольцевую реакцию (КР) с молоком коров.

На ранних стадиях бруцеллезного процесса наиболее чувствительна РА. Агглютинины в сыворотке крови больных животных в низких титрах можно выявить уже с 10—15-го дня, а затем в течение 1—3 мес после инфицирования. В более поздние сроки диагностическая ценность РА снижается [2].

Однако показатели РА весьма нестабильны, особенно в период беременности, а также могут не выявлять до 45% зараженных животных [3].

РСК и РДСК по времени выявления зараженных животных несколько отстают от показаний РА у крупного рогатого скота, но являются более ценными и чувствительными при диагностике бруцеллеза у овец. Обе реакции стабильны, специфичны и существенно дополняют показания РА [2].

В последнее время для диагностики бруцеллеза стали также широко применять иммуноферментный анализ, который к настоящему времени прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. С его помощью можно проводить как массовое обследование стад, так и поставить окончательный диагноз у конкретного животного.

Главные преимущества ИФА перед традиционными иммунологическими тестами: высокая чувствительность, специфичность, возможность получения количественных данных, воспроизводимость, стандартизация основных ингредиентов анализа, возможность исследования сильно загрязненных образцов, биологических жидкостей и экстрактов, возможность автоматизации всех этапов постановки и учета реакции [4].

Вышеперечисленные преимущества определили широкое применение ИФА во всех областях лабораторной диагностики, и в настоящее время, согласно стандартам МЭБ (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004), ИФА, наряду с традиционными методами, является узаконенным методом диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота [5].

ИФА является более чувствительным методом в сравнении с РА и РСК, а также выявляет антитела в более ранние сроки [3].

Материалы и методы исследований

Нами была изучена иммунологическая активность различных клеточных структур (капсула, клеточная стенка, дезинтеграт, цитоплазма) бруцелл и целых клеток в РСК и ИФА. В результате исследований было выяснено, что активность дезинтеграта выше по сравнению с другими антигенами.

В крестьянском хозяйстве «Арай» Карасайского района Алматинской области были взяты пробы крови крупного рогатого скота (35 голов) и овец (43 головы). Их исследовали в РА, РСК и ИФА со стандартными и полученными нами антигенами.

Для получения антигенов были использованы бруцеллы вида abortus штамма 19, выращенные на эририт агаре, смытые физиологическим раствором натрия хлорида.

При получении цельных клеток бактериальную массу подвергли встряхиванию на шуттель-аппарате в течение 3-х ч с последующим центрифугированием при 5 000 об./мин в течение 1 ч для отделения капсульного вещества. Осадок (цельные клетки) ресуспендировали в физиологическом растворе натрия хлорида и использовали в качестве антигена для постановки РА.

Часть полученного осадка дезинтегрировали посредством ультразвука. Дезинтеграт очистили от неразрушенных клеток центрифугированием при 6 000 об./мин в течение 1 ч, вследствие чего последние выпали в осадок. Полученный дезинтеграт использовали в качестве антигена для постановки РСК и ИФА.

Результаты исследований

В РА стандартный и опытный антигены, по существу, являются аналогами, т. е. взвесью цельных бруцелльных клеток. При исследовании сыворотки крови животных этот антиген выявил 9 положительно реагирующих животных.

При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота в РСК со стандартным антигеном было получено 12 положительных и 1 сомнительный результат, а с антигеном из дезинтеграта 25 положительных и 7 сомнительных. Следовательно в РСК антиген из дезинтеграта проявляет большую активность, чем антиген из цельных клеток.

При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота с помощью ИФА было выявлено вдвое большее количество положительно реагирующих животных в сравнении с РСК со стандартным антигеном, в то время как РСК с антигеном из дезинтеграта дала весьма схожие с ИФА результаты.

ИФА со стандартным антигеном дал два сомнительных результата. Антиген из дезинтеграта позволил разрешить эту проблему. В этом тесте один сомнительный случай дал положительный результат, а другой – отрицательный. В остальных случаях оба антигена в ИФА дали идентичные результаты. Однако показатели оптической плотности в положительных случаях были выше в анализе с антигеном из дезинтеграта, что свидетельствует о его большей активности.

При исследовании сывороток крови овец в ИФА опытным антигеном было выявлено 9 положительно реагирующих овец, в то время как стандартный антиген выявил лишь 4.

Из данных таблицы видно, что опытный антиген выявляет в ИФА больше положительно реагирующих на бруцеллез животных, чем существующий, а также позволяет разрешать сомнительные случаи. Следовательно, активность и специфичность опытного антигена превышают таковые существующего.

Результаты исследований показали, что РА и РСК со стандартным единым антигеном при исследовании сыворотки крови животных выявляют приблизительно одинаковое количество положительно реагирующих животных. Однако диагностическая ценность РСК может быть существенно улучшена, если в качестве антигена использовать клеточный дезинтеграт. Тот же вывод можно сделать относительно ИФА. В целом можно сказать, что ИФА значительно более ценный диагностический метод в сравнении с РА и РСК при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез.

источник

В настоящее время в совершенствовании серологической диагностики заразных болезней широко используются методы, основанные на использовании ИФА. Это и понятно: ИФА является высокочувствительным тестом, позволяющим за короткое время исследовать большое количество образцов сыворотки крови. Однако высокая чувствительность теста, в первую очередь, требует применения в нем антигена, специфичного для возбудителя. Иначе, высокая чувствительность ИФА идет во вред его диагностической ценности, показывая ложноположительные результаты вследствие наличия у возбудителя и некоторых микроорганизмов общих антигенных детерминант.

Бруцеллез животных остается одной из главных проблем ветеринарии Казахстана. В ИФА-наборах, используемых в последнее время для серологической диагностики инфекции, в качестве антигена выступают липополисахариды (ЛПС) молекулы бруцелл. Известно, что ЛПС Brucella практически единтичны аналогичному антигену, полученному из Yersinia enterocolitica 0:9, и имеют гомологичные эпитопы с многими грамотрицательными микроорганизмами на которые в организме животных имеются антитела. Кроме того, иммунной системе вакцинированного организма более доступны ЛПС, расположенные поверхностно, и поэтому антитела в основном вырабатываются на детерминанты полисахаридной молекулы. В этой связи, нет сомнений в том, что использование данного антигена в ИФА приводит к необоснованному убою определенного поголовья здоровых животных, выработавших антитела в результате иммунизирующей субинфекции или вакцинации.

В НИИ биотехнологии КазАТУ им. С.Сейфуллина (А.К.Булашев и соавт.) проведена работа по определению диагностической ценности белков внешней мембраны (БВМ) Brucella abortus 19. Выбор данного антигена основан на следующих положениях. Во-первых, грамотрицательные микроорганизмы, хотя и имеют большие сходства между собой по ЛПС, существенно различаются по антигенам БВМ. Во-вторых, в иммунизированном организме вакцинные штаммы задерживаются, как правило, в течение короткого времени (1-3 мес.). Поэтому для иммунной системы вакцинированных животных более доступны ЛПС, расположенные на поверхности клетки, чем белковые антигены «замаскированные» сложным комплексом поверхностной структуры. В этой связи привитый организм успевает вырабатывать антитела в основном на ЛПС. В организме инфицированного животного происходит длительная персистенция бруцелл, сопровождающаяся реакцией иммунной системы на возбудителя болезни, пытающегося локализоваться в излюбленных им органах. Это приводит к накоплению в тканях большого количества продуктов распада бруцелл, среди которых имеются и БВМ, которые ранее были не доступными для иммунной системы.

Тест-система ИФА для выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота, разработанная сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина, основана на использовании БВМ бруцелл. Как показали результаты исследований, тест оказался более специфичным, нежели общеизвестные серологические реакций. Постановка ИФА проводилась в двух вариантах. В непрямом ИФА БВМ были иммобилизированы к твердой фазе неспецифически, а в «сэндвич» варианте – посредством моноклональных антител (МКА), имеющих специфичность к эпитопу белка с молекулярной массой 50 кД. Сравнивая диагностическую значимость двух методов постановки ИФА, исследователи предпочтение отдают «сэндвич» варианту. Во-первых, в последнем случае белковый антиген, в составе которого имеется эпитоп моноклональных антител, фиксируется к твердой фазе специфически. При этом другие белковые компоненты БВМ бруцелл удаляются в процессе отмывки лунки планшеты. Таким образом, в ходе постановки «сэндвич» ИФА первые антитела осуществляют отбор антигенов, свойственных для бруцелл из состава БВМ бруцелл. Это, безусловно, повышает специфичность данного теста. Разработчик имеет научно-техническую документацию и опытные образцы иммуноферментного диагностикума (зарегистрирован в Государственном реестре ветеринарных препаратов за №РК-ВП-2-0126-04 от 27.01.2004.). Авторские права защищены патентом РК №14230 «Способ определения антител против возбудителя бруцеллеза» (Бюл.№4, опубл.15.04.2008.). Высокая специфичность белковых антигенов Leptospira, серогруппы Hebdomadis была отмечена нами при серологической ИФА-диагностике крупного рогатого скота на лептоспироз в сравнении с другими иммунологическими методами. (А.К.Булашев, 2005). Диагностикум существенно превосходил по чувствительности и специфичности реакцию микроагглютинации и лизиса (РМАЛ) и на 6% больше выявлял серопозитивных животных, чем его зарубежный аналог «IФА-лептоспiроз-ВРХ» (М.А.Куйбагаров, 2006).В литературе имеются сообщения о перспективности использования БВМ в диагностике других инфекционных болезней. Например, на основе БВМ Yersinia pseudotuberculosis сконструирован псевдотуберкулезный видоспецифический антигенный полимерный диагностикум для объемной реакции агглютинации. При этом чувствительность диагностикума составлял 100%, специфичность – 85,7-89,5% (Д.И.Симакова и др., 2011).

Большую практическую значимость имеют и методы детекции антигенов возбудителей инфекционных болезней, предложенные учеными КазАТУ им.С.Сейфуллина. Так, диагностический набор, основой которого являются МКА штаммов гибридом БАМА и БИМА, позволяет обнаруживать Brucella abortus в патматериале, а именно в паренхиматозных органах и лимфатических узлах, а также в содержимом желудка аборт-плодов (А.К.Булашев, 1992). МКА упомянутых штаммов были использованы Н.А.Бызовой и соавт. (2011) для разработки экспрессных иммунохроматографических тестов (ИХТ) для детекции антигенов Brucella abortus и антител против данного патогена. Тесты для определения антигена Brucella abortus позволяют в течение 10-15 мин выявлять в биоматериале ЛПС в концентрациях до 5 нг/мл., единый стандартный бруцеллезный антиген до 1 млн.кл/мл. Результаты серологический исследований с помощью ИХТ полностью совпали с данными ИФА.

Экспресс-тест на основе МКА был апробирован нами и для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале. Установлено, что «dot» ИФА с использованием антител к Mycobacterium bovis как в «сэндвич», так и в прямом варианте по чувствительности и специфичности, и, естественно, по времени проведения (3,5-4 часа) существенно превосходит классические методы исследований (микроскопический, бактериологический) и сопоставим с ПЦР-диагностикой. Данный тест, в отличие от других использованных, давал возможность дифференцировать Mycobacterium bovis от других видов, включая представителей атипичных микобактерий (А.К.Булашев и соавт., 2010; 2011). Заслуживает внимания и иммуноферментный диагностикум, предназначенный для серологического обследования крупного рогатого скота на туберкулез (A.K.Bulashev, 2003). По результатам апробации у всех животных, показавших позитивные результаты одновременно по ИФА и аллергической пробе, в легких и лимфатических узлах выявлены поражения, характерные для туберкулеза, тогда как у коров, реагировавших только на ППД-туберкулин, видимые изменения во внутренних органах не обнаруживались.

В связи с неблагополучной эпизоотической ситуацией по сибирской язве, ящуру и бешенства ветеринарная служба Казахстана нуждается в эффективных экспресс-тестах для мониторинга санитарного состояния объектов внешней среды. Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина и Национального центра биотехнологии РК (НЦБ РК) разработан высокоспецифичный метод индикации возбудителя B.anthracis в почве, основанный на использовании двух видов МКА в «dot» ИФА на нитроцеллюлозной бумаге (А.К.Булашев и соавт., 2005). Чувствительность теста составляла 4 500 м.кл./мл. Кроме того, его можно использовать для обнаружения сибиреязвенных бацилл и в других объектах внешней среды (вода, корма), а также в сырье животного происхождения.

Учеными двух названных научных учреждений были созданы 3 штамма-продуцента МКА к вирусу ящура и 4 гибридомы, синтезирующие антитела к вирусу бешенства и предложены методы ИФА для лабораторной диагностики упомянутых вирусных болезней (А.К.Булашев и соавт., 2005). Тест-система для идентификации антигенов вируса бешенства методом ИФА разработана и НИИ проблем биологической безопасности РК (Е.С.Жилин и соавт.,2011) . В результате проведенных исследований в 13 из 15 исследованных полевых материалах (мозг и слюна), отобранных от коров, овец, лис и корсаков, имеющих клинические признаки заболевания бешенством, выявлен антиген вируса бешенства. Полученные результаты были подтверждены испытанием аналогичной панели проб полевых материалов с использованием коммерческого ИФА-набора для диагностики бешенства (Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г.Казань). НЦБ РК и НИИ Физико-химической медицины (г.Москва) получен штамм-продуцент E.coli рекомбинантного неструктурного белка 3А вируса ящура. ИФА на основе упомянутого антигена, обладая высокой специфичностью, выявляла антитела в сыворотке крови больных коров в разведении 1:320 (К.Н.Мукантаев и соавт., 2011).

Одним из многообещающих подходов повышения специфичности ИФА является использование в этом тесте антиидиотипических антител (АИАТ), т.е. «внутренних образов» исходного антигена. При этом, однажды полученные моноклональные антитела к специфичному эпитопу определенного возбудителя могут быть использованы для получения моноклональных АИАТ, которые в последующем заменят исходный антиген и исключают тем самым необходимость работы персонала патогенными микроорганизмами. АИАТ способны имитировать любые, в том числе слабоиммуногенные и слабоантигенные детерминанты гаптенов, полисахаридов, липидов, зачастую выделяемых в деградированной форме и, следовательно, лишенных части эпитопов, присущих нативной молекуле, или же сохраняющих высокую токсичность за счет особенностей экстракции. АИАТ, выступающие в роли белкового «заменителя» определенного бактериального антигена, позволяют устранять подобные препятствия и эффективно презентировать атоксичные детерминанты клеткам иммунной системы. Именно поэтому АИАТ в настоящее время успешно применяются многими исследователями в качестве «суррогата» антигена или его отдельных детерминант для индукции протективного иммунного ответа против бактериальных ЛПС, токсинов, ряда внутриклеточных паразитов – возбудителей малярии, лейшманиоза, трипаносомоза, бактериальных и вирусных инфекций и т.д. Бесспорным преимуществом подобного подхода является отсутствие необходимости предварительного выделения изучаемой субстанции. Абсолютная специфичность МКА, использованных для получения АИАТ, предопределяет их гомологию исходному антигену.

Сотрудниками КазАТУ им.С.Сейфуллина были получены АИАТ к идиотипу Ат2-бета моноклональных антител, направленных на поли-Б антиген бруцелл (С.Г.Оспанова и соавт, 2009). Одним из критериев характеристики АИАТ как Ат2-бета по сообщениям ряда авторов, является способность их взаимодействовать с ксеногенными антисыворотками, специфичными к исходному антигену, так как только этот идиотип, несущий «внутренний образ» антигена, могут связывать специфические антитела. Поэтому изучалось взаимодействие моноклональных АИАТ с кроличьей поликлональной моноспецифической антисывороткой и поликлональной позитивной сывороткой крупного рогатого скота в ИФА. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммами гибридом, проявляли активность по отношению к указанным ксеногенным сывороткам в титрах от 1:1600-1:3200. Одним из значимых свойств Ат2-бета является их способность индуцировать синтез гомологичных антител третьего порядка (анти-АИАТ), направленных против исходного антигена. Для этой цели были проведены серии иммунизаций линейных мышей препаратами АИАТ. Сыворотки мышей исследовали в непрямом ИФА на наличие антител третьего порядка, способных взаимодействовать с исходным поли-Б антигеном бруцелл. Как показали результаты, полученные АИАТ при введении в организм животных способны стимулировать синтез антител третьего порядка (Ат3), направленных против исходного антигена. Таким образом, исследователями доказана возможность применения АИАТ в качестве антигена при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез в ИФА.

Феномен антиидиотипии в диагностике кровепаразитарных болезней (пироплазмозов, анаплазмозов, нутталиозов, трипаносомозов) изучалась и Г.С. Шабдарбаевой и соавт. (2009). Ими установлено, что АИАТ к антигенам различных кровепаразитов, полученные в результате двукратной иммунизации лабораторных животных – кроликов, достаточно информативны, специфичны и их вполне можно использовать в качестве диагностикумов в таких серологических тестах, как РНГА и ИФА.

Иммуноферментный анализ с использованием F(ab)2-фрагментов антиидиотипических антител вместо нативных антигенов был предложен Б.Б. Гнеденко и соавт. (2006). Ими проведено определение сывороточного содержания аутоантител к трем группам белков в норме и у пациентов с шизофренией с помощью стандартных методов и тест-систем с иммобилизованными F(ab)2-фрагментами АИАТ. Уровни аутоантител ко всем белкам у пациентов с шизофренией были выше, чем в группе контроля.

Е.С.Жилин и соавт. (2011) испытали поликлональные антиидиотипические иммуноглобулины и их конъюгаты с пероксидазой хрена в ИФА для выявления антирабических антител в сыворотках животных. В результате испытаний регистрировали положительные результаты со специфическими сыворотками в независимости от вида продуцентов антирабических антител при отрицательных результатах с нормальными и гетерологичными сыворотками. Чувствительность тест-системы в 2-4 раза превышала непрямой и конкурентный вариант ИФА.

Представляют большой интерес работы, посвященные проблемам адаптации ИФА тестов условиям практики за счет удлинения срока годности иммуноферментного конъюгата. При этом изучается возможность использования иммобилизованных ферментов, искусственно связанных с нерастворимым носителем и при этом сохраняющих свои свойства. Иммобилизованные ферменты в тысячи раз стабильнее свободных. Все это обеспечивает высокую экономичность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные препараты. Одним из существенных факторов, сдерживающих широкое использование ИФА на производстве, является непродолжительный срок годности иммуноферментного конъюгата (6-12 мес. при надлежащем хранении в холодильнике). А.С.Геогджаян и соавт. (2011) получили иммобилизованные ферменты и применили их в разработке диагностических тест-систем для выявления возбудителей инфекционных болезней. Технология получения иммобилизованного иммунопероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: активация пероксидазы хрена; включение фермента в липосомы (или иммобилизация на алюмосиликате); иммобилизация полученных препаратов с иммуноглобулинами; очистка от не связавшихся компонентов, лиофилизация и контроль. В качестве носителя необходимо было выбрать такой, который бы не препятствовал проникновению к нему субстрата и не лишал фермент подвижности, необходимой для выполнения присущей ему функции. Иммобилизованный в липосомах материал оказывается защищенным липидной мембраной от действия неблагоприятных факторов внешней среды, благодаря чему увеличивается срок его годности. Исследователями определены оптимальные условия получения высокостабильных и специфичных иммобилизованных иммунопероксидазных конъюгатов при использовании в качестве носителей липосом и алюмосиликата. Показана перспективность иммобилизации носителей с ферментом и иммуноглобулинами. Иммунопероксидазные конъюгаты апробированы при ИФА на гомо- и гетерологичных штаммах возбудителей туляремии и лептоспироза. Срок годности разработанных препаратов увеличивается до 5 лет для липосомных и до 3 лет для алюмосиликатных иммунопероксидазных конъюгатов без снижения чувствительности и специфичности.

Заслуживают внимания практиков и методы диагностики инфекционных болезней, основанные на иммунохроматографии. Так, Н.А.Бызовой и соавт. (2010) предложена иммунохроматографическая детекция клеток Mycobacterium tuberculosis. Разработаны конкурентный и «сэндвич» варианты иммунохроматографического анализа, в которых контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами непосредственно инициируют движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимическое взаимодействие и формирование визуально детектируемых окрашенных зон. Показано, что и конкурентный, и «сэндвич» варианты метода позволяют определять клетки возбудителя туберкулеза в концентрации до 10 тыс. кл./мл (50-100 кл. в пробе). Преимуществом «сэндвич» анализа является возможность качественной визуальной диагностики, когда окрашивание аналитической зоны независимо от его интенсивности свидетельствует о положительном результате анализа.

Жердев и соавт. (2010) разработали иммунохроматографический способ определения антител к возбудителю туберкулеза. Для детекции антител используют два антигенных реагента – иммобилизованный в аналитической зоне тест-полоски антиген Mycobacterium tuberculosis и антиген, конъюгированный с частицами коллоидного золота. Благодаря наличию у антител как минимум двух антигенсвязывающих сайтов при контакте тест-полоски с пробой в аналитической зоне происходит формирование иммунных комплексов, состоящих из иммобилизованных на мембране молекул антигена, содержащихся в пробе антител к антигену Mycobacterium tuberculosis и конъюгата антигена возбудителя с частицами коллоидного золота. Комплексы определяют визуально или с использованием оптического детектора.

ИФА, особенно его точечный («dot») вариант, достаточно широко используют в диагностике таких паразитарных заболеваний, как амебиозы, бабезиозы, фасциолезы, лейшманиозы, гиподерматоз, эхинококкоз и токсоплазмоз. Эта реакция имеет очевидные преимущества перед другими иммуноферментными тестами, прежде всего, в возможности проведения большого числа анализов при значительно меньших объемах исследуемого образца, расходуемых реактивов, материалов и иммунореагентов. Антитела или антигены в иммунодоте наносятся в минимальных количествах на ограниченный участок полимерного листового материала, обладающего в 80-120 раз большей сорбционной емкостью на единицу площади, чем носители с гладкой поверхностью, используемых в панельных тестах. С другой стороны, при проведении иммунодота можно обойтись без электрооборудования, что немаловажно в период массовых исследований в полевых условиях. В.Г.Бережко и соавт. (2009) испытали точечный ИФА в диагностике трихинеллеза и эхинококкоза свиней. Специфичность иммунодота при первой инвазии составила 97,4%. Наибольшее количество ложноположительных ответов регистрировали у свиней с естественной инвазией E.granulosis . По мнению авторов, с одной стороны, такой результат можно объяснить наличием общих для трихинелл и эхинококков белковых эпитопов, а с другой – он мог быть спровоцирован различными заболеваниями печени, при которых ложноположительные ответы наблюдают на антигены самых различных возбудителей. Специфичность иммунодота при эхинококкозе составила 68%. Основная причина ложноположительных результатов с сыворотками крови свиней, инвазированных C.tenuicollis , — близкое антигенное родство этого паразита с E.granulosis доказано иммунохимическим методом.

В течение последних трех лет (2009-2011 гг) НИР ученых-биотехнологов нашего университета была направлена на совершенствование методов диагностики заразных болезней животных, таких как лейкоз, эхинококкоз и описторхоз. Выбор названных болезней является неслучайным. Анализ эпизоотической ситуации показывает, что лейкоз крупного рогатого скота регистрируется почти во всех странах с высокоразвитым молочным животноводством. Инфекция наносит большой урон селекции и племенной работе, сокращает сроки эксплуатации животных, снижает молочную продуктивность, качества молока и мяса. По данным ветеринарной отчетности племенных хозяйствах Казахстана доля скота, положительно реагирующего на лейкоз доходит в среднем до 6%. Оздоровительные мероприятия основаны на своевременном выявлении и изоляции из стада инфицированных животных. Однако РИД и ИФА, наиболее чаще используемые для этой цели, не всегда дают объективные результаты. Первый тест имеет низкую специфичность, а второй из-за своей высокой чувствительности могут давать ложноположительные реакции в случае использования недостаточно очищенного антигена вируса.

В этой связи перед нами была поставлена задача разработать тест-систему ИФА, позволяющей по ходу анализа избавляться от нежелательных компонентов вируссодержащего материала, и тем самым способствующей сенсибилизации твердой фазы антигенами, специфичными для возбудителя лейкоза. С целью придания тест-системе такого селективного свойства, т.е. свойства отделять специфичный антиген от балластных веществ, были испытаны МКА — один из популярных на сегодняшний «инструментов» иммунологов.

Продуцентами МКА явились штаммы культивируемых клеток мышей, полученные нами методом гибридомной техники. Создание штаммов-продуцентов с желаемыми свойствами — дело не из легких, но, как показывает мировая практика, однажды полученные штаммы, позволяют с лихвой окупить все расходы, предоставляя исследователям весьма ценные препараты — однородные антитела со строгой специфичностью.

Иммунизацию линейных мышей проводили гликопротеидным gp51 и полипептидным p24 антигенами вируса лейкоза. В результате слияния иммунных спленоцитов с миеломными клетками получены 3 штамма гибридных клеток, синтезирующих МКА к полипептидному антигену и 6 штамма гибридом, продуцирующие антитела к гликопротеидному антигену вируса.МКА, полученные в результате культивирования штамма-продуцента в брюшной полости сингенных мышей, характеризовались высокой активностью и аффинностью по отношению к исходным антигенам.В наших исследованиях МКА были испытаны в качестве лиганды для фиксации вирусспецифического антигена к твердой фазе при постановке «сэндвич» ИФА.

Лунки планшет сначала сенсибилизировали МКА, пассировали активные центры полистирола, затем вносили вируссодержащий материал. При этом антитела избирательно связывались с теми антигенами, которые в своем составе имели специфичные для них эпитопы. Отмыв лунки планшет от не связавшихся компонентов, вносили образцы сыворотки крови или молока коров. При наличии в исследуемых пробах противовирусных антител, последние связываются с другими эпитопами антигена, фиксированного к твердой фазе посредством антител, образуя иммунный комплекс. Этот комплекс выявляли с помощью антибычьего конъюгата. В результате многочисленных опытов нами были определены оптимальные параметры и условия постановки ИФА для диагностики лейкоза.

По своей диагностической ценности наш метод не уступал коммерческим ИФА тест-системам. Итоги исследований легли в основу лабораторного регламента изготовления и применения компонентов диагностического набора. Метод скрининга поголовья крупного рогатого скота на маркеры вируса лейкоза на основе выявления интегрированного генома возбудителя в крови был разработан сотрудниками НЦБ РК (Е.Б.Евтыхова и соавт., 2011). Образцы выделенной из крови ДНК были протестированы на наличие провируса методом мультиплексной ПЦР с использованием смеси праймеров нацеленных на ген env и на фрагмент гена актина (внутренний контроль амплификации). Детекцию амплификаторов осуществляли электрофорезом в 2%-геле агарозы. Учеными этой же научной организации (К.К.Муканов и соавт., 2011) разработана ИФА на основе рекомбинантного р24 антигена вируса для серологической диагностики лейкоза.

Среди паразитарных болезней животных наибольшую тревогу вызывает эхинококкоз, так как эта болезнь наносит не только экономический, но и социальный ущерб. Люди заражаются при непосредственном контакте с собаками – пораженными половозрелыми эхинококками Echinococcus granulosis, а также при поедании овощей и плодов, загрязненных яйцами гельминта. При этой инвазиив печени, реже в легких и других органах промежуточных хозяев (с.х.животные и человек) образуются множественные кистозные образования, содержащие личинки паразита.Лечение больных животных не разработано. В редких случаях отмечается самовыздоровление животных с образованием обызвествленных эхинококковых пузырков. По клинической картине диагностировать болезнь весьма трудно. Иногда используют серологические реакций, основанные на обнаружении антител в сыворотке крови животных, такие как реакция сколекспреципитация, непрямая гемагглютинация, РДСК, а также аллергический метод. Однако, ни один из них не нашел применения в ветеринарной практике в силу низкой специфичности. Это и понятно – в этих тестах используется сложнейшая смесь антигенов гельминта. Одним словом, для искоренения болезни нужны достоверные методы диагностики, позволяющие своевременно выявлять и выбраковывать больных животных с последующей утилизацией зараженных органов под контролем ветеринарных специалистов.

В своей работе мы использовали четыре вида антигена: содержимое эхинококкового пузыря, протосколексы (продукт герминативной оболочки, свободно плавающий в полости капсулы), стенка пузыря и экскреторно-секреторный антиген (ЭС-АГ), выделяемый протосколексами в питательную среду в результате моделирования инвазии in vitro. Все антигены в РИД и ИФА активно взаимодействовали с антителами сывороток крови, полученных от животных с эхинококкозными поражениями. Для дальнейшей работы мы отобрали ЭС-АГ по следующим соображениям. Во-первых, белковый состав продукта жизнедеятельности эхинококка, культивируемого в искусственной питательной среде, намного проще, чем у других видов антигенов, во-вторых, методику получения антигена в условиях in vitro можно стандартизировать, и, в третьих, в случае выздоровления животных с образованием обызвествленных пузырков, естественно, прекращается иммунный ответ организма на метаболиты паразита.

Протосколексы были получены из эхинококковых пузырей животных во время убоя. ЭС-АГ гельминта выделяли в результате культивирования протосколексов в жидкой питательной среде. Антиген состоял из 11 белковых фракций с молекулярными массами в диапазоне 19-63 кД. Методом гибридомной техники были получены штаммы клеток, продуцирующие антитела к детерминанте экскреторного белка с молекулярной массой 21 кД, и изучены их свойства.

Принцип обнаружения сывороточных антител, специфичных к эхинококкам, был основан на применении МКА в качестве первых антител в «сэндвич» ИФА. Эти антитела избирательно взаимодействуя с ЭС-АГ способствовали сенсибилизации твердой фазы метаболитами гельминта. Как показали результаты производственного испытания, во всех случаях обнаружения паталогоанатомических изменений, характерных для эхинококкоза, выявлялись и специфические антитела в образцах сыворотки крови.

Результатылабораторного и производственного испытания были использованы в разработке нормативно-технической документации на диагностическую тест-систему. Опытная партия диагностикума передана в МСХ для регистрации в государственном реестре ветеринарных препаратов.

ИФА, основанный на использовании в качестве антигенов — продуктов жизнедеятельности гельминта, был испытан нами для иммунодиагностики и другой инвазионной болезни — описторхоза — широко распространенного природно-очагового паразитарного заболевания человека, вызываемое гельминтом Opisthorchis felineus.

Гельминт локализируется в желчных протоках печени, желчном пузыре и поджелудочной железе. Заражение человека и плотоядных животных — окончательных хозяев данного паразита, происходит при употреблении в пищу инвазированной личинками гельминта рыб семейства карповых. Болезнь протекает хронически, без выраженных клинических признаков, не всегда в образцах фекалия пациентов, больных описторхозом, обнаруживаются яйца гельминта. Предложен аллергический метод, который, как и другие тесты, основанные на повышенной чувствительности замедленного типа, часто дает фальшрезультаты.

Для извлечения ЭС-АГ описторхиса сначала выделяли метацеркарий из поверхностных и глубоких спинных мышц рыб, обитающих в водоемах бассейна озера Тенгиз и реки Иртыш. Надо отметить, что степень зараженности рыб была довольно высокой, и у отдельных видов она достигала 26%. Затем заражали лабораторных животных (собак, кроликов и хомяков) метацеркариями. По истечении 60 суток животных забивали, изолировали половозрелые гельминтыи культивировали их в неполной среде Игла для накопления метаболитов.

Методом гибридомной техники получены два штамма-продуцента, МКА которых показали высокую активность по отношению к исходному антигену.

При разработке метода ИФА-диагностики описторхоза нами определялась возможность использования МКАкакв качествеагента,фиксирующего антиген описторхиса к твердой фазе, так и в роли антител, вступающих в реакцию с циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК) сыворотки крови, состоящими из молекул специфического иммуноглобулина и антигена. По данным литературы, на поздних стадиях болезни антитела, активные центры которых заняты антигенами паразита, не выявляются в серологических реакциях. Такие иммунные комплексы могут быть определены другими антителами, специфичными к свободным эпитопам антигена.

Предлагаемые тест-системы апробировались на образцах сыворотки крови людей, заведомо больных описторхозом в сравнении с коммерческой тест-системой Описторх-IgG-ИФА АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Оба варианта ИФА дали вполне сопоставимые результаты как между собой, так и со сравниваемым аналогом.

Экспертиза продуктов животного происхождения на наличие в них остаточного количества антибиотиков или других биологически активных веществ становится одной из важных задач практической ветеринарии в связи с вхождением Казахстана в Таможенный союз и предстоящим вступлением его в ВТО. Присутствие контаминантов вызывают у людей аллергические реакции, дисбактериоз и другие патологии. Для определения антибиотиков в продуктах животноводства предложен ряд методов. Наиболее широкое применение нашел микробиологический метод. Несмотря на относительную надежность, метод имеет ряд существенных недостатков. К ним относят низкий уровень чувствительности и воспроизводимости результатов, необходимость постоянной поддержки в лаборатории штаммов тест-микробов. В странах ЕС, США и Японии иммуноферментный анализ является рекомендованным методом для определения остаточных количеств ветеринарных препаратов в продуктах животного происхождения.

Получение антител к антибиотикам является трудновыполнимой задачей, поскольку по своей химической природе они являются гаптенами и не вызывают иммунный ответ. В этой связи в наших исследованиях антибиотики сшивались с высокомолекулярными носителями (БСА, овальбумин). Эти конъюгаты и служили антигеном в гибридомной технике. Осуществив семь слияний иммунных спленоцитов с миеломной линией клеток, нам удалось получить 3 штамма–продуцента антител к гидроксильной группе молекулы стрептомицина, и по 2 штамма, синтезирующие иммуноглобулины к антигенным детерминантам хлорамфеникола (левомицетина) и окситетрациклина.

Метод, предлагаемый нами дляопределенияостаточного количестваантибиотиков, основан на конкуренции свободного антибиотика, содержащегося в исследуемой пробе и антибиотика, иммобилизованного на твердой фазе в составе белкового конъюгата, за активные центры антител. Диагностическая ценность тест-системы для определения остаточных количеств антибиотиков в животноводческой продукции апробирована на пробах молока и мяса в сравнении с коммерческими аналогами.Результаты испытания свидетельствуют о возможности использования ее для экспресс-обнаружения антибиотиков в продуктах питания. Таким образом, ИФА имеет все основания для того, чтобы занять свою достойную нишу в лабораторной практике ветеринарии.

Контрольные вопросы:1. Расскажите об основных результатах научной работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина в области совершенствования диагностики инфекционных болезней животных; 2. Основные итоги работы НИИ биотехнологии КазАТУ им.С.Сейфуллина по совершенствованию методов диагностики инвазионных болезней; 3. Чем объясняется перспективность применения антиидиотипических антител в иммунодиагностике инфекционных болезней?

Дата добавления: 2018-03-01 ; просмотров: 571 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

источник

• Главная
• «ПРОФИЛАКТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЛЮДЕЙ. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. МУ 3.1.7.1189-03» (утв. Главным государственным санитарный врачом РФ 30.01.2003)

5. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей применяются три группы методов: первая — тесты, позволяющие выявить возбудитель заболевания и его растворимые антигены; вторая — методы определения специфических антител; третья — тесты, выявляющие сенсибилизацию организма к бруцеллезным антигенам.

Вся работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в условиях, предупреждающих возможность инфицирования персонала и обсеменения возбудителем объектов внешней среды, в строгом соответствии с санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности. СП 1.2.011-94».

Характерной особенностью рода Brucella является медленный рост на питательных средах, особенно в первых генерациях. При посевах крови, костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5 — 10 дней, а иногда через 20 — 30 дней после засева. При этом первые генерации культур В.abortus и В.ovis способны расти только при наличии в атмосфере повышенного содержания углекислоты (5 — 10%). Биовары В.abortus 5, 6 и 7 могут расти в обычных аэробных условиях.

Для выделения культур бруцелл рекомендуются следующие среды: сывороточно-декстрозный агар, агар из картофельного настоя + сыворотка и кровяной агар (5% овечьей крови в среде), Albimi — агар, среда «Д», печеночные и мясопептонные агары и бульоны (pH сред — 6,8 — 7,2). Рецепты приготовления сред приведены в конце указаний. В настоящее время в практике широко используется коммерческая среда для выделения бруцелл — эритрит агар (г. Махачкала). Следует отметить, что данная среда является высокоэффективной для выделения первой генерации возбудителя. Однако при последующих пересевах на этом агаре изучаемая культура бруцелл может диссоциировать.

Посевы следует производить на предварительно проверенные питательные среды.

Для проверки агара из 2-суточной культуры В.melitensis или В.abortus готовят суспензию бруцелл в концентрации 200 мк в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Посев проводят на 4 чашки по 0,1 мл — 20 мкл суспензии. Агар признается пригодным, если через 5 суток пребывания в термостате при 37 °C в среднем вырастает не менее 18 колоний на чашку.

Исследование крови и другого биологического материала.

Посевы крови рекомендуется делать во время лихорадочного состояния больного, т.к. в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Однако не исключена возможность получения гемокультуры и при нормальной температуре. Кровь для посева следует брать до лечения антибиотиками. Посевы крови рекомендуется проводить во флаконы (желательно прямоугольные) емкостью 100 — 200 мл, в которые наливают по 30 — 50 мл агара. После стерилизации их укладывают так, чтобы агар застыл на одной из сторон флакона. Затем в каждый флакон стерильно добавляют по 25 — 30 мл предварительно простерилизованного бульона и выдерживают в термостате при 37 °C в течение 2 — 3 суток (агар с бульоном может быть использован не позднее 5 — 7 дней). Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут шприцем из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона. Один из флаконов инкубируют при повышенном содержании углекислоты (5 — 10%), а другой — в обычных условиях. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста культуры поверхность агара орошают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду. При бактериологическом обследовании больных, прошедших курс лечения антибиотиками, через 1 месяц и спустя 4 — 6 месяцев после окончания курса антибиотикотерапии, а также больных хронической формой бруцеллеза в период обострения (особенно при субфебрилитете) перед началом лечения рекомендуется проводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов на специальную питательную среду для выделения L-культур бруцелл (состав питательной среды см. в конце указаний).

Способ посева бактериологического материала для выделения L-культур идентичен с методом выделения бактериальных гемокультур. Посевы выдерживаются в термостате не менее 35 — 40 дней.

Бруцеллы можно выделить также из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, экссудата из бурситов, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т.д. Посевы проводят на твердые и жидкие питательные среды. В случаях исследования загрязненного материала для задержки роста посторонней микрофлоры к среде следует добавлять генцианвиолет из расчета 1:200000. С этой целью также добавляют различные антибиотики, в частности полимиксин — 3 мкг/мл и амфоглюкамин — 3 мкг/мл.

Для выделения бруцелл из материалов, загрязненных посторонней микрофлорой и при малой концентрации бруцелл в исследуемом материале, используются морские свинки (весом 300 — 350 г) или белые мыши (весом 17 — 18 г). Исследуемый материал вводят подкожно в паховую область в дозах не более 0,5 мл для мышей и 1 мл для морских свинок.

Вскрытие белых мышей производится через 20 — 25 дней, а морских свинок — через 30 — 35 дней после введения исследуемого материала. Перед вскрытием у свинок следует взять кровь из сердца для исследования сыворотки в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут целиком лимфатические узлы (регионарные к месту введения исследуемого материала): паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный, кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей лимфатические узлы: паховый, акселярный, парааортальный, подчелюстной, кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг для засева берут пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, а также мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательные среды (агар и бульон). Лимфатические узлы животных перед посевом рекомендуется надсекать ножницами. После этого каждый лимфатический узел и кусочки органов (по возможности больше) берут «уколом» стерильной деревянной палочки (палочка должна быть длиной 25 — 30 см, диаметром 4 — 5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом) и вносят первоначально в пробирку с агаром, где той же палочкой материал раздавливают и тщательно втирают в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. После использования палочки погружают на 1 час в дезраствор (5% раствор фенола), затем автоклавируют, после чего тщательно промывают и стерилизуют для последующего употребления. Посевы выдерживают при 37 °C в термостате 20 — 25 дней. Просмотр посевов на пробирках с агаром и бульоном производят каждые 3 — 4 дня, из помутневших бульонов делают высевы на пробирки со скошенным агаром.

Результат исследования оценивается положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл из организма животного или при наличии положительной реакции Райта у животных в титре не менее 1:20.

Для определения принадлежности выделенных культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение морфологии колоний, микроскопия окрашенных препаратов по Граму или Козловскому, люминесцентная микроскопия и проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле.

Колонии бруцелл на агаре бесцветны, выпуклы (холмиком), с гладкой поверхностью, гомогенны, иногда с нежной зернистостью в центре колонии. С возрастом нежные и прозрачные колонии постепенно мутнеют.

Величина колоний может быть различной. Наряду с крупными, достигающими в диаметре 3 — 4 мм и больше, могут быть очень мелкие — точечные колонии 0,1 — 0,05 мм. Различные факторы (pH питательной среды, влажность, наличие бактериофага в культуре и др.), влияющие на биологию культуры, могут привести также к изменению внешнего вида колоний (встречаются зернистые, стекловидные колонии, растущие в толще агара, эрозированные, сухие, слизистые, радиально исчерченные и др.).

Для изучения структуры колоний целесообразно использовать стереоскопическую лупу МБС-1 или обычный микроскоп с объективом наименьшего увеличения.

Микроскопия окрашенных препаратов.

При окраске по Граму бруцеллы грамотрицательны (окрашиваются в красный цвет). Окрашивание препаратов по способу Козловского: препараты, фиксированные на пламени горелки или спиртовки, окрашивают 0,5% водным раствором сафранина при подогревании до появления пузырьков, промывают дистиллированной водой и докрашивают 0,5%-ным водным раствором малахитовой или бриллиантовой зелени в течение 40 — 50 секунд. Бруцеллы сохраняют красную окраску сафранина, а остальные бактерии окрашиваются в зеленый цвет.

Проба со специфической сывороткой.

Для предварительной, быстрой идентификации ставят реакцию агглютинации на стекле. На предметное стекло наносят каплю специфической сыворотки, разведенной 1:25 0,5% карболизированным физиологическим раствором, в которой эмульгируется одна петля исследуемой культуры. В положительных случаях быстро (в течение 1 минуты) наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев, в отрицательных — суспензия остается гомогенной. Для контроля исследуемую культуру эмульгируют в капле нормальной сыворотки или физиологическом растворе.

Люминесцентная микроскопия (см. раздел 4 «Идентификация бруцелл в воде и пищевых продуктах»).

Для определения принадлежности выделенных L-культур к роду Brucella можно использовать следующие методы: изучение характера роста и морфологии колоний, микроскопия нативных препаратов, проба со специфической сывороткой в реакции агглютинации на стекле, а также способность к росту на специфической питательной среде с пенициллином.

Характер роста и морфологии L-форм бруцелл.

L-колонии бруцелл могут быть изолированными или в виде нежного сплошного налета. Колонии от 2 до 3 мм имеют золотистый цвет, слизистую консистенцию, часто врастают в агар. При просмотре через бинокулярную лупу МБС-1 L-колонии имеют вид «яичницы» — плотный центр и ажурные светлые края.

Микроскопия нативных препаратов.

Для изучения морфологии L-клеток отбирают характерные колонии и из них готовят нативные препараты: на предметное стекло наносят каплю физиологического раствора, в которой эмульгируют одну каплю исследуемой культуры, закрывают покровным стеклом, края заливают парафином и просматривают в световом микроскопе в фазовом контрасте с иммерсией.

По морфологии L-формы бруцелл представляют собой полиморфные клетки в виде шаров, грушевидных и неправильной формы тел от 1 до 6 мкм с цитоплазмой разной оптической плотности с вакуолями и зернистостью. Зерна-гранулы могут располагаться как внутри крупных клеток, так и лежать свободными зернистыми массами. В препарате могут находиться клетки от 0,2 до 0,5 мкм гетероморфные или близкие по морфологии к нормальным клеткам бруцелл.

Проба со специфической сывороткой.

L-культуры бруцелл сохраняют антигенное родство с исходными штаммами бруцелл. Для предварительной быстрой идентификации L-культур бруцелл ставят реакцию агглютинации на стекле со специфической агглютинирующей поливалентной антисывороткой в разведении 1:25. Необходимо учитывать, что L-культуры бруцелл очень плохо эмульгируются, что затрудняет учет реакции. Поэтому рекомендуется сначала петлю культуры тщательно растереть стеклянной палочкой в небольшом количестве физиологического раствора и после этого каплю эмульсии перенести в каплю специфической сыворотки на предметном стекле и параллельно в каплю нормальной сыворотки или физиологического раствора в качестве контроля.

Скорость специфической реакции агглютинации может быть только замедленной. Характер агглютината при положительной реакции обычен.

После идентификации культуры бруцелл проверяют на диссоциацию. С этой целью применяют следующие тесты: проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации (проба с нагреванием).

Проба с раствором трипафлавина (на стекле).

На предметное стекло наносят каплю солевого (0,85%) раствора трипафлавина 1:500, в котором эмульгируется капля испытуемой культуры. У диссоциированных культур быстро через 1 — 2 минуты наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь из S-форм культур остается гомогенной.

2 — 3 мл 1 x 10(9) мкл/мл двухсуточной культуры бруцелл в физиологическом растворе подогревают в пробирке на водяной бане при 90° в течение 30 минут. Результаты учитывают через 30 минут, 1 час и окончательно через 24 часа пребывания при комнатной температуре. В эти сроки наступает, при наличии диссоциации, ясно выраженная агглютинация клеток бруцелл, тогда как суспензия недиссоциированных (S) штаммов остается гомогенной. Дифференциации подлежат культуры бруцелл, находящиеся только в S-форме.

Тестами дифференциации бруцелл являются: их отношение к росту в присутствии CO2, образование H2S, устойчивость к фуксину и тионину, способность агглютинироваться монорецепторными сыворотками, отношение к фагу «Тб».

Дифференциация по образованию сероводорода.

В качестве реактива применяют водный раствор уксусно-кислого свинца, в котором смачивают полоски фильтровальной бумаги размером 1 x 8 см. Полоски затем просушивают. Заготовленные впрок сухие полоски фильтровальной бумаги хранят в банке из темного стекла с притертой пробкой не более 1 — 2 месяцев.

Взвесь испытуемой культуры в физиологическом растворе (2 x 10(9) мкл в 1 мл) засевают стандартной петлей (2 мм) на скошенную поверхность печеночного агара (pH — 6,8 — 7,2). Затем берут полоску фильтровальной бумаги и зажимают между пробиркой и ватной пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался агаровой среды. Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты. Пробирки с посевами ставят в термостат при 37 °C.

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего, свисающего над посевом конца бумажки. Почернение бумажки измеряется в мм.

Результаты учитываются через 2 дня в течение 6 дней. При каждом учете темневшую бумажку заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода все три показателя складывают.

Для В.suis (биовар 1) суммарный показатель образования сероводорода равен примерно 12 — 20 мм, для В.abortus (биовар 1) — около 5 — 7, В.melitensis (биовар 1), как правило, совсем не образует сероводорода или вызывает только легкое побурение свинцовой бумажки. У штаммов В.neotomae показатель образования сероводорода в среднем равен 5 — 8 мм. Культуры В.ovis и В.canis сероводорода не образуют.

Дифференциация по редуцирующей активности в отношении красок.

Для этого метода дифференциации рекомендуется применять твердые питательные среды — агар Albimi и мясо-пептонный агар. Применяют основной фуксин и тионин, предварительно оттитрованные по отношению к трем основным видам референтных штаммов бруцелл, в концентрации: фуксин — 1:50000, тионин — 1:50000.

При отсутствии стандартных оттитрованных красок рабочие их дозы можно оттитровать с использованием эталонных штаммов бруцелл. Для этого испытуемые краски добавляют к среде в различных концентрациях. Концентрация красок в среде, с которой получается четкая дифференциация эталонных штаммов бруцелл (В.melitensis 16M, В.abortus 544, В.suis 1330), и являются рабочей дозой данной краски. Основные растворы фуксина и тионина готовят в концентрации 1:1000 (0,1 г краски, 20 мл 96° спирта и 80 мл дистиллированной воды). Флаконы с краской хранят в темном месте в течение 6 — 10 месяцев. Готовят питательную среду с краской следующим образом: к 100 мл охлажденного до 45 — 50 °C агара стерильно добавляют 2 мл основного раствора краски для получения концентрации 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 — 25 мл в каждую чашку Петри. Затем среду подсушивают, не открывая чашки. Среды с красками должны храниться в холодильнике (+4 °C) и пригодны для работы в течение 10 — 15 дней. Обесцвеченные среды применять нельзя.

Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы контрольных (эталонных штаммов всех трех видов бруцелл) и испытуемых штаммов производят петлей диаметром 2 мм из взвеси, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных клеток (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Одну петлю такой взвеси засевают штрихом на поверхность агара. На чашку можно одновременно засевать 4 — 6 культур, предварительно разделив чашку Петри на 4 — 6 секторов. Посевы помещают в термостат при 37 °C. Учет результатов проводят через трое суток инкубации.

— интенсивный рост по всему штриху 4+;

— интенсивный рост вначале и более слабый в конце штриха 3+;

— менее интенсивный в начале или слабый рост по всему штриху 2+;

— очень слабый рост по ходу штриха или отдельные колонии +.

Реакция агглютинации с монорецепторными и R-сыворотками.

Монорецепторную сыворотку последовательно разводят до ее предельного титра (1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 и т.д. в объеме 0,5 мл). В качестве антигена применяют смыв в физиологическом растворе 2-суточной агаровой культуры бруцелл изучаемого штамма, разведенного до 2 млрд. микробных клеток в 1 мл (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Для разведения сыворотки и антигена применяют физиологический раствор, pH 7,0. Антиген добавляют по 0,5 мл во все пробирки. Разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).

Реакцию ставят с двумя контролями: а) контроль с эталонным штаммом вида В.melitensis; б) контроль с эталонным штаммом В.abortus. Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °C 18 — 20 часов, а затем в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого проводят учет реакции. Реакция считается положительной, начиная с разведения сыворотки 1:20 , но не менее чем на 2+.

Для культур бруцелл вида ovis и canis, а также для культур других видов и биоваров бруцелл, находящихся в R-форме, для реакции агглютинации используют анти-R-сыворотку. Техника постановки реакции аналогична. Используется физиологический раствор на фосфатном буфере, pH 8,2 — 8,4.

Определение чувствительности культур бруцелл к фагу.

Бруцеллезный фаг «Тб» избирательно лизирует бруцеллы вида abortus, находящиеся в S-фазе. При определении чувствительности бруцелл к фагу используют следующий метод:

Питательная среда — 1,5% мартеновский агар (можно 1,5% агар Альбими) разливают в чашки Петри по 25 — 30 мл. Среду подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 часов. Чашки можно открыть и прикрыть их стерильными кружками фильтровальной бумаги, но в этом случае желательно чашки держать под лучами бактерицидной лампы.

Для посева используют 48-часовую агаровую культуру бруцелл, из которой готовят взвесь в физиологическом растворе из расчета 1 x 10(9) мкл в 1 мл, 0,4 — 0,5 мл из этой взвеси наливают на поверхность агара. Затем чашки тщательно раскачивают для получения равномерного газона, лишнюю посевную жидкость удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки подсушивают в течение 1 часа при температуре 37 °C. На газон наносят пастеровской пипеткой по одной капле фага в концентрации по 10 x 10(2) корпускул фага в 1 мл. Чашки быстро наклоняют и капли фага стекают по дорожке. Места нанесения капель и путь стекания капли можно заранее расчертить карандашом на внешней стороне дна чашки.

Полный лизис культуры на месте нанесения фага (или по дорожке) «4+», лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки в виде сот «3+». Резко ослабленный рост и небольшое количество бляшек «2+», очень слабый лизис «+» и отсутствие лизиса «-» — результат отрицательный.

За положительный результат следует принимать лизис культуры минимум на два креста на месте нанесения капли фага. В качестве контроля рекомендуется включать референтные штаммы В.melitensis 16M, В.abortus 544 и В.suis 1330.

Дифференциальные свойства видов и сероваров рода Brucella: см. таблицу.

Учитывая, что бруцеллы относятся к медленно растущим микроорганизмам и окончательный ответ бактериологического и биологического методов исследования можно ожидать только через 3 — 5 недель, были разработаны тесты, основанные на иммунологическом взаимодействии специфического антигена и антител (реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — прямой метод, реакция нейтрализации антител (РНАт), иммуноферментный анализ (ИФА), а также молекулярно-биологический метод — полимеразная цепная реакция (ПЦР)). Технику постановки этих методов см. в разделе 4.

При бруцеллезе рекомендуется несколько методов, которые используются в зависимости от целей исследования.

При проведении эпидобследования населения в очагах рекомендуется: реакция агглютинации — пластинчатая (Хеддлсона), РПГА, ИФА, кожно-аллергическая проба Бюрне.

При обследовании населения перед профилактической вакцинацией: пластинчатая реакция агглютинации (Хеддлсона) или ИФА и кожно-аллергическая проба Бюрне или реакция лизиса эритроцитов.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза проводят бактериологические исследования, ставят реакцию агглютинации и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса. Может быть использована ИФА.

Для диагностики хронического бруцеллеза и при проведении диспансерного наблюдения за переболевшими бруцеллезом рекомендуется реакция Кумбса, ИФА и аллергические тесты.

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменять друг друга. Это обуславливает необходимость применения комплексного серо-аллергического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

В ранние сроки от начала заболевания (в первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического; серологические реакции в этот период оказываются положительными почти в 98% случаев. По мере удлинения срока заболевания процент положительных серологических реакций (реакция агглютинации, РПГА) начинает падать. В поздние периоды заболевания большую диагностическую ценность имеет реакция Кумбса, ИФА и внутрикожная аллергическая проба.

При проведении обследования нужно учитывать, что если высокие титры антител почти всегда указывают на наличие инфекции, то антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключают возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется проводить повторные исследования с интервалом 1 — 2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Следует иметь в виду, что положительную реакцию агглютинации с бруцеллезным антигеном могут давать также сыворотки, содержащие антитела к микроорганизмам, имеющим общие антигенные детерминанты с бруцеллами (Е.coli, V.cholerae, Fr.tularensis, Y.enterocolitica 0 — 9, S.typhimurium).

Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции, быстром получении результатов и чувствительности реакции. В качестве антигена для постановки реакции Хеддлсона и Райта применяют единый бруцеллезный диагностикум. Реакцию ставят на обычном оконном, тщательно вымытом, обезжиренном стекле, расчерченном на квадраты величиной 4 x 4 см каждый, по горизонтали должно быть 5 квадратов. На первом квадрате с левой стороны записывается номер испытуемой сыворотки, в последующие квадраты слева направо разливают (микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую сыворотку в следующих дозах: 0,04, 0,02, 0,01 и 0,03 (контроль сыворотки). К первым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последней дозе сыворотки (0,03) добавляют 0,03 мл физиологического раствора. Сыворотку осторожно смешивают с антигеном палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03 мл физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло слегка подогревают над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерное нагревание всей поверхности стекла.

В случае положительной реакции в первые же минуты в каплях сыворотки с антигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения 8 минут:

а) контроль сыворотки ставят с каждой испытуемой сывороткой для исключения спонтанной агглютинации;

б) контроль антигена ставят один (при любом числе испытуемых сывороток) для исключения спонтанной агглютинации применяемого антигена.

Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме:

а) полное просветление жидкости с крупными и мелкими хлопьями, т.е. 100% агглютинации (4+);

б) почти полное просветление жидкости с ясно заметными хлопьями, т.е. 75% агглютинации (3+);

в) незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями, т.е. 50% агглютинации (2+);

г) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+);

д) равномерная мутная жидкость (-).

Для оценки результатов рекомендуется следующая схема:

а) агглютинация на 4+ во всех дозах сыворотки — результат «резко положительный»;

б) агглютинация не менее 2+ во всех дозах сыворотки — результат «положительный»;

в) агглютинация только в первой или в первой и второй дозах сыворотки — результат «сомнительный»;

г) отсутствие агглютинации во всех дозах сыворотки — реакция «отрицательная».

Для диагностики бруцеллеза имеет значение только положительный результат реакции. При сомнительном или отрицательном результатах реакции и наличии эпидемических и эпизоотических показаний, а также в стационаре и при обследовании доноров, где необходимо определение титра агглютининов и их динамики, следует применять реакции Райта и Кумбса, РПГА и ИФА.

Реакция агглютинации является одним из основных методов диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность реакция агглютинации представляет при острой и подострой форме бруцеллеза.

Техника постановки реакции.

В пробирки разливают физиологический раствор: в первую — 2,4 мл, в остальные по 0,5 мл. В первую пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, перемешивают, переносят 0,5 мл в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси выливают, в результате получают в каждой пробирке по 0,5 мл следующих разведений 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. Из первой пробирки 0,5 мл переносят в чистую пробирку и добавляют туда 0,5 мл физиологического раствора (контроль сыворотки в разведении 1:50), а 1,0 мл выливают.

Диагностикум разводят физиологическим раствором согласно прилагаемому к нему наставлению и добавляют по 0,5 мл во все пробирки, кроме контроля. После добавления диагностикума разведение сыворотки соответственно удваивается, т.е. получается 1:50, 1:100 и т.д. Сыворотки с антигеном смешивают путем встряхивания и помещают в термостат (37 °C ) на 18 — 20 часов. После инкубации пробирки выдерживают 1 — 2 часа при комнатной температуре и проводят учет реакции.

Учет реакции проводят по стандарту мутности в зависимости от степени осаждения агглютината и просветления жидкости.

Для приготовления стандарта мутности антиген, применяемый для постановки РА, еще раз разводят в два раза.

Дальнейшее разведение антигена физиологическим раствором производят по схеме 1.

РАЗВЕДЕНИЕ АНТИГЕНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИМ РАСТВОРОМ

Стандарт мутности готовят каждый раз при постановке РА и ставят в термостат одновременно с основной реакцией.

Титром сыворотки является максимальное ее разведение, дающее 50% агглютинации, — просветление, оцениваемое на 2+.

При применении стандартизированного диагностикума титры исследуемых сывороток соответствуют количеству международных единиц антител (ме/мл).

Так, титры 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. соответственно равны 50, 100, 200 и т.д. ме/мл.

При диагностической оценке РА рекомендуется следующая схема:

— титр сыворотки 1:100 (100 ме/мл) — результат положительный;

— титр сыворотки 1:200 (200 ме/мл) — результат положительный;

— титр сыворотки 1:400 (400 ме/мл) — результат резко положительный.

Диагностическим титром принято считать реакцию агглютинации не менее 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше.

В диагностике бруцеллеза у людей и животных, особенно при хроническом течении инфекции, когда реакция агглютинации может быть отрицательной или положительной в низких титрах, важное место следует отвести выявлению неполных антител. При постановке реакции Кумбса используют предварительно оттитрованную антиглобулиновую сыворотку против глобулинов человека (например — антиглобулиновая сыворотка для иммуноэлектрофореза против глобулинов человека) (см. схему титрации).

Техника постановки реакции Кумбса (РК).

В начале ставят реакцию агглютинации (Райта). После учета реакции агглютинации (через 20 часов) берут не менее трех пробирок первых разведений при отрицательном результате реакции агглютинации или не менее трех пробирок, начиная со слабоположительного результата (+, ++). Эти пробирки центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 20 минут для осаждения антигена. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают с помощью пастеровской пипетки и отбрасывают, затем в каждую пробирку наливают по 1 мл физиологического раствора, тщательно встряхивают и снова центрифугируют, таким образом осадок промывают три раза. После последнего центрифугирования к осадку отмытого антигена добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки в рабочем титре, пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 18 — 20 часов. Учет реакции проводят так же, как при реакции агглютинации. Диагностическим титром РК считается агглютинация не менее 2+ в разведении сыворотки 1:50.

Для контроля антиглобулиновой сыворотки взять в опыт сыворотку, содержащую неполные антитела с известным титром.

Контроль антигена. Взвесь антигена в физиологическом растворе подвергается отмыванию центрифугированием, как в основной реакции, после чего добавляют 0,5 мл антиглобулиновой сыворотки. При учете в контроле антигена наблюдается равномерное помутнение.

Схема титрования антиглобулиновой сыворотки для РК.

Для титрования антиглобулиновой сыворотки (против глобулинов человека) необходимо иметь сыворотку крови человека, заведомо содержащую неполные антитела к бруцеллам в высоком титре. Титрование антиглобулиновой сыворотки производят следующим образом. Вначале титруют положительную бруцеллезную сыворотку в реакции агглютинации (Райта). При этом делают несколько рядов разведений сыворотки, приблизительно — 8 рядов (схема 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

После учета реакции агглютинации во всех рядах отбирают пробирки, в которых отсутствует агглютинация (в схеме 1 — начиная с 1:400) и в каждой из них отмывают антиген согласно методике постановки реакции Кумбса. Затем (схема 3) делают несколько разведений титруемой антиглобулиновой сыворотки (в нашем примере от 1:10 до 1:250) и добавляют по 0,5 мл каждого разведения этой сыворотки в один ряд пробирок с оставшимся после отмывания антигеном. Объем жидкости в каждой пробирке должен быть доведен до 0,5 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37 °C. Результаты учитывают так же, как реакцию агглютинации. За титр антиглобулиновой сыворотки принимают ее наибольшее разведение (в нашем примере 1:80 — 4 ряд), которое выявляет неполные антитела в максимальном титре (1:3200). Для реакции Кумбса антиглобулиновая сыворотка применяется в удвоенном титре (1:40).

РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАКЦИИ КУМБСА

РПГА является специфичным и высоко чувствительным методом выявления бруцеллезных антител в сыворотке крови человека. Для постановки РПГА необходимо иметь: а) бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум; б) контрольные (несенсибилизированные) эритроциты; в) нормальную сыворотку кролика; г) бруцеллезную сыворотку.

Для титрования испытуемых сывороток применяется нормальная сыворотка кролика, инактивированная при 56 °C в течение 30 минут и разведенная физиологическим раствором 1:100.

Испытуемую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 (0,1 мл сыворотки +2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в течение 30 минут при 56 °C. Перед исследованием сыворотку адсорбируют 50% взвесью контрольных эритроцитов. К 1,2 мл инактивированной сыворотки добавляют 0,2 мл 50% эритроцитов, встряхивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь центрифугируют при 1000 об./мин. в течение 2 минут.

Можно оставить сыворотки с эритроцитами на ночь в холодильнике (+4 °C), в этом случае исключается центрифугирование.

Эритроцитарный диагностикум перед применением разводят физиологическим раствором (pH 7,0 — 7,2) согласно указанию на этикетке и получают 2,5%-ную взвесь, которая применяется в РПГА. Контрольные (несенсибилизированные эритроциты также разводят согласно указанию на этикетке и применяют полученную 2,5%-ную взвесь для контроля сывороток).

Реакцию ставят в прозрачных полистироловых пластинках с лунками. Каждую сыворотку исследуют не менее чем в 6 — 8 разведениях, начиная с 1:50. Сначала нормальную разведенную 1:100 инактивированную сыворотку кролика разливают во все лунки по 0,5 мл. Затем в первую лунку (контроль сыворотки) вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки, предварительно инактивированной и разведенной 1:25, перемешивают и 0,5 выливают. Во вторую лунку также добавляют 0,5 мл испытуемой сыворотки (1:25), перемешивают, переносят 0,5 мл в третью лунку и титруют сыворотку до конца ряда, из последней лунки 0,5 мл выливают. Таким образом получают ряд последовательных двукратных разведений испытуемой сыворотки, начиная с 1:50, в объеме 0,5 мл.

В первые лунки (контроль сыворотки) добавляют микропипеткой по 0,05 мл контрольных эритроцитов. Затем в каждую лунку, начиная со второй, с помощью микропипетки добавляют по 0,05 мл диагностикума. Пластины осторожно встряхивают до полного перемешивания содержимого лунки, следя, чтобы не было разбрызгивания жидкости, и оставляют при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2 — 3 часа.

При постановке РПГА предусматриваются следующие контроли:

а) контроль качества нормальной сыворотки кролика (1:100) проводят в двух лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую лунку 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума, во вторую — 0,05 мл контрольных эритроцитов;

б) качество диагностикума проверяют путем титрования специфической бруцеллезной сыворотки, начиная с разведения 1:50 до 1:100000. Затем в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума.

Реакция считается специфической, если в контролях исследуемых и контрольной сыворотки отсутствует гемагглютинация, а титр специфической сыворотки в реакции будет соответствовать титру, указанному на этикетке флаконов эритрицитарного диагностикума.

Оценка реакции проводится по следующей схеме:

4+ — эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногда наблюдается зонтик.

3+ — эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем, но площадь его меньше, чем при 4-крестовой реакции, размеры зонтика также меньше.

2+ — агглютинат небольшой, расположен в центре лунки.

1+ — вокруг осадка эритроцитов в центре виден небольшой агглютинат.

Отрицательная реакция — осадок эритроцитов на дне лунки в виде пуговки или маленького кольца.

За титр сыворотки принимают ее последнее разведение с оценкой реакции не менее чем 3+. Оценка результатов исследования сывороток на бруцеллез в РПГА у людей: титр 1:50 — реакция сомнительная, титр 1:100 и выше — реакция положительная. При записи результатов РПГА следует указывать титр сыворотки.

Техника постановки РПГА микрометодом.

РПГА может быть выполнена в микрообъемах с помощью микротитратора типа Такачи (или круглодонных микропланшетах с микропипетками), который позволяет проводить титрование в объемах 25 и 50 мкл. Техника постановки реакции, последовательность всех операций такая же, как и при использовании макрометода. Следует учитывать то, что чувствительность микрометода обычно на одно разведение ниже, чем макрометода.

Для постановки реакции в микротитраторе с помощью пипетки-капельницы в каждую лунку вносят разводящую жидкость в объеме 50 мкл. Затем с помощью титраторов с головкой объемом 50 мкл забираем исследуемую сыворотку, погружая в нее головку. Титратор с сывороткой переносят в первую лунку и делают несколько вращательных движений в обе стороны. Затем титратор переносят в следующую лунку и повторяют манипуляцию. Титрование можно проводить одновременно в нескольких рядах. После титрования всего ряда титратор промывают дистиллированной водой путем вращательных движений, удаляют воду из головки с помощью тампона и обжигают ее на пламени горелки.

В лунки после титрования добавляют 25 мкл эритроцитарного диагностикума, разведенного 1:10, пластины слегка встряхивают до получения гомогенной взвеси. Учет проводят через 2 — 3 часа по аналогичной схеме, как и при использовании макрометода.

Метод используют для диагностики всех форм заболевания, а также при эпидемиологическом обследовании населения и при отборе лиц для вакцинации против бруцеллезной инфекции.

Для постановки ИФА используют диагностическую тест-систему, иммуноферментную для определения бруцеллезных антител. Выявление специфических антител в сыворотках людей происходит за счет взаимодействия бруцеллезного антигена (ЛПС), адсорбированного на полистироловом планшете (плоскодонном) с антителами исследуемой сыворотки. Образовавшийся комплекс «антиген + антитело» выявляют с помощью антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой хрена.

Тест-система представляет собой набор ингредиентов для проведения ИФА на твердофазном носителе и включает в себя: бруцеллезный ЛПС (либо планшет, сенсибилизированный этим антигеном), антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой (конъюгат), контрольные (положительную и отрицательную) сыворотки человека, набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов, субстрат — ортофенилиндиамин (ОФД). Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА), планшеты для ИФА однократного применения.

1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора бруцеллезного антигена в концентрации 10 мкг/мл в 0,02М растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ), pH 7,2. Адсорбцию антигена на планшетах проводят в течение 2 часов в термостате при температуре 37 °C или при 4 °C в течение 18 часов. Затем антиген удаляют встряхиванием планшета с последующей трехкратной отмывкой (по 5 мин.) раствором ФСБ, содержащим 0,1% детергента — твит-20.

2. Внесение исследуемого материала. Испытуемые сыворотки, разведенные 1:200, вносят по 100 мкл в первую лунку ряда и далее последовательно путем двукратных разведений на ФСБ + твин, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), раститровывают. Параллельно на каждом планшете ставят отрицательный и положительный контроль. Планшеты встряхивают и выдерживают при 37 °C в течение 1 часа. После чего жидкость удаляют и отмывают планшеты, как указано в п. 1.

3. Внесение конъюгата. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата в рабочем разведении (конъюгат разводят на ФСБ + твин и 1% БСА). Планшеты помещают в термостат на 40 мин., после чего жидкость удаляют, а планшеты отмывают 4 — 5 раз, как указано в п. 1.

4. Проявление реакции. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1М цитратно-фосфатном буфере, pH 5,5. Инкубацию проводят при комнатной температуре 15 — 30 мин. и останавливают реакцию внесением 50 мкл 0,5 моль/л серной кислоты.

5. Учет и оценка результатов ИФА. Результат реакции можно учитывать визуально с помощью сравнивания окраски в опытных и контрольных лунках, а также с помощью спектрофотометра типа Multiskan при длине волны 492 нм. Появление желто-оранжевого окрашивания в опытных лунках при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о положительной реакции. При фотометрическом учете результатов проба считается положительной, если оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей.

Диагностическим титром в ИФА считается разведение сыворотки более чем 1:400.

Использование ИФА в эпидемиологической практике.

При проведении массовых обследований на бруцеллез для постановки ИФА может быть использована не сыворотка крови, а цельная кровь. Для этого кровь из пальца, с помощью микропипетки, в объеме 10 мкл вносится в микропробирку с физиологическим раствором в объеме 1 мл. Пробирку встряхивают и затем либо центрифугируют при 1000 об./мин. 5 мин., либо дают отстояться в холодильнике при 4 °C в течение 18 часов. Таким образом получают разведение сыворотки 1:200. Для постановки ИФА используют надосадочную жидкость. ИФА как скрининг-тест можно ставить в 2 лунках микропланшета, при получении сомнительного или положительного результата ИФА повторяют в количественном варианте с последующей раститровкой надосадочной жидкости. При получении положительного результата необходимо исследовать сыворотку крови.

При использовании непрямого ИФМ для обнаружения антител к бруцеллам заранее готовят мазки из 1 — 2 суточной агаровой

9 культуры возбудителя (1 x 10 мкл/мл). На одном предметном стекле делают 8 мазков, фиксируют их в этиловом спирте в течение 30 мин., высушивают на воздухе и помещают во влажную камеру. Исследуемую сыворотку разводят 2-кратно, начиная с разведения 1:2 до 1:320, и наносят пастеровской пипеткой на мазки, начиная с большего разведения. Влажную камеру с препаратом помещают в термостат при 37 °C на 30 мин. Мазок отмывают от несвязавшихся антител и после подсыхания его вновь помещают во влажную камеру, докрашивая антивидовой люминисцирующей сывороткой в рабочем разведении. Дальнейшая обработка препарата ведется, как при прямом иммуннофлюоресцентном методе (см. раздел 4). После просмотра препарата под люминесцентным микроскопом устанавливают титр антител в исследуемой сыворотке.

В качестве контролей служат препараты, в которых бруцеллы обработаны бруцеллезной сывороткой (положительный контроль) и сывороткой, не содержащей антитела к бруцеллам (отрицательный контроль). Диагностическим титром считается титр не менее 1:4.

Внутрикожная аллергическая проба основана на способности организма, сенсибилизированного бруцеллезным антигеном, специфически отвечать местной реакцией (отек, болезненность) на внутрикожное введение бруцеллезного аллергена. Реакция специфична, но выявляется у больных позднее, чем антитела, и сохраняется очень долго, иногда годами, после исчезновения клинических симптомов. Необходимо иметь в виду, что аллергическая реакция может быть положительной в случаях бессимптомной инфекции, а также у привитых живой бруцеллезной вакциной и у лиц, длительно контактировавших со специфическим антигеном.

Бруцеллезный аллерген вводится внутрикожно в количестве 0,1 мл. Инъекция делается с соблюдением асептики на ладонной поверхности предплечья шприцом с тонкой иглой (техника, тождественная реакции Манту, Шика и Дика). Учет реакции производится через 24 — 48 часов после введения аллергена путем осмотра и ощупывания кожи. В некоторых случаях аллергическая реакция становится положительной к 72 часам.

При положительной реакции на месте введения аллергена появляется красноватая или бледная болезненная отечность удлиненной или овальной формы. Отек может быть хорошо контурирован с ясным возвышением над уровнем нормальной кожи. При слабо выраженной реакции отек распознается только при ощупывании (сравнить с аналогичным участком кожи на другой руке). Гиперемию кожи при отсутствии отека принимают за отрицательный результат. При учете реакции отмечается размер отека в сантиметрах (длина и ширина), степень болезненности через 24 и 48 часов. При отрицательном результате следует учитывать реакцию и через 72 часа.

Наличие выраженного отека кожи на месте введения аллергена считается положительной аллергической реакцией. Отсутствие болезненности и гиперемии при наличии отека не исключает положительной оценки пробы.

Реакция, появившаяся и исчезнувшая ранее шести часов после введения аллергена, считается неспецифической.

У людей, высокосенсибилизированных к бруцеллезному антигену, возможна общая реакция организма на введение бруцеллина с повышением температуры, ознобом, головной болью и недомоганием.

Оценка реакции: слабо положительная — слабо выраженный отек не более 2 см в диаметре, положительная — отек размером от 2 до 6 см в диаметре, резко положительная — отек свыше 6 см, иногда сопровождающийся лимфааденитом и общей реакцией организма.

Введение специфического антигена в сенсибилизированный организм небезразлично для обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный метод выявления гиперчувствительности замедленного типа методом in vitro с помощью реакции лизиса лейкоцитов (РЛЛ). РЛЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического антигена, регистрируемого методом in vitro. РЛЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через 3 — 4 часа после взятия крови.

РЛЛ проводится в пробирках из химически чистого стекла. В качестве антигена используется взвесь убитых нагреванием бруцелл (может быть использован вакцинный штамм В.abortus 19BA) в

7 концентрации 1 x 10 мкл/мл.

Кровь для исследования берется в количестве 1 мл и вносится в колбочку с гепарином из расчета 75 — 80 ме гепарина на 1 мл крови. По 0,4 мл гепаринизированной крови помещается в 2 пробирки. В первую пробирку добавляют 0,1 мл бруцеллезного антигена (опытная пробирка), во вторую — 0,1 мл физраствора для установления неспецифического лизиса лейкоцитов (контрольная пробирка). Пробирки встряхивают в течение 2 — 3 мин., после чего проводят подсчет лейкоцитов в камере Горяева по принятому в гематологии методу. Затем пробирки помещают в термостат на 2 часа при 37 °C и периодически встряхивают их через 15 — 20 мин. После инкубации пробирки вновь встряхивают в течение 2 — 3 мин. и проводят подсчет лейкоцитов. Подсчет производится не менее 2 — 3 раз для каждой пробирки, а затем выводится среднее их количество. Наличие лейкоцитов после инкубации в опытной и контрольной пробирках подсчитывается по формуле: количество лейкоцитов после инкубации x 100% количество лейкоцитов до инкубации.

Показатель специфического лизиса лейкоцитов (ПСЛ) подсчитывается путем определения разницы — процент уменьшения лейкоцитов в опытной пробирке минус процент уменьшения лейкоцитов в контроле. ПСЛ выражается отрицательной величиной и колеблется в пределах от -10 до -30%. ПСЛ меньше -10% свидетельствует о неспецифическом лизисе.

Наиболее достоверным методом обнаружения возбудителя бруцеллеза в пищевых продуктах, воде, патологическом материале являются бактериологический и биологический методы, описанные выше. Для быстрого обнаружения возбудителя бруцеллеза в первичных посевах, пищевых продуктах, воде и патологическом материале рекомендуются следующие методы: микроскопия препаратов, прямой иммунофлюоресцентный метод, реакция нейтрализации антител (РНАт), ИФА и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Мазки, приготовленные из первичных посевов, из центрифугата или фильтрата (при исследовании воды, молока), и препараты-отпечатки из патологического материала после фиксации окрашивают по Граму или Козловскому и просматривают в световом микроскопе.

При исследовании патологического материала от больных людей и животных, а также из объектов внешней среды может быть эффективен прямой иммунофлюоресцентный метод, позволяющий выявлять как живые, так и нежизнеспособные бактерии по свечению в них специфического антигена. Для обнаружения бруцелл применяют флюоресцирующие бруцеллезные антитела.

А) Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии.

При исследовании воды готовят мазки (не менее 3 — 4) из осадка после центрифугирования и с мембранных фильтров. Мазки фиксируют в метиловом спирте 10 — 15 минут.

Мазки, приготовленные из проб цельного молока, сливок и осадка, после центрифугирования обезжиривают эфиром в течение 20 минут и дополнительно фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут.

Мазки, приготовленные из мясного экстракта или осадка, фиксируют 96° спиртом в течение 20 минут.

Из селезенки белых мышей, которым был введен исследуемый материал, готовят препараты-отпечатки, которые фиксируют 96° спиртом в течение 15 — 20 минут при 37 °C или метиловым спиртом 15 минут при комнатной температуре.

При исследовании материала от абортированных плодов, различных экссудатов и органов инфицированных животных и людей готовят препараты-отпечатки, прикладывая предметное стекло к поверхности свежего среза. Затем препараты подсушивают на воздухе и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 — 20 минут при 37 °C или метиловым спиртом при комнатной температуре 15 минут.

Б) Обработка препаратов флуоресцирующими антителами.

На фиксированные мазки наносят каплю бруцеллезной сыворотки. Для гашения неспецифического свечения фона применяют бычий альбумин, меченый родамином, который придает клеткам и другим органическим частицам тусклое оранжево-красное свечение. Перед обработкой препаратов бруцеллезную люминесцирующую сыворотку и альбумин разводят до удвоенного рабочего разведения, указанного на этикетке (например, если рабочее разведение равно 1:20, то разводят 1:10). После этого альбумин и сыворотку смешивают в равных объемах и наносят на исследуемый препарат, который помещают во влажную камеру (чашка Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) на 15 — 20 минут, затем промывают проточной водопроводной водой в течение 10 минут и высушивают на воздухе. На препарат наносят каплю забуференного глицерина (9 частей глицерина и 1 часть забуференного физиологического раствора), покрывают покровным стеклом и исследуют под люминисцентным микроскопом.

Для микроскопии используется люминисцентный микроскоп МЛ-2 при силе тока 4,5, объективы 90 и 100 и окуляры 5x или 7x (в зависимости от освещенности препарата). Светофильтры следует располагать следующим образом: (от источника света) СЭС-14-14, БС-8-2, ФЗ-1-2. Окулярный фильтр Т-2Н или Ж-18, вспомогательная линза — 1,6. При микроскопии препаратов следует пользоваться нефлюоресцирующим маслом.

В положительных случаях, т.е. когда в исследуемом материале имеются бруцеллы, в микроскопе на темном или оранжево-красном фоне видны клетки с ярким зеленым свечением по периферии. Центральная часть клетки не светится. Конгломераты бруцеллезного антигена имеют также яркое зеленое свечение.

Для оценки интенсивности специфического свечения используют четырехкрестовую систему.

Сверкающая флюоресценция зеленого цвета с четко выраженной формой клетки — четыре креста. Яркая флюоресценция зеленого цвета — три креста. Заметная, но слабо выраженная флюоресценция, — два и один крест.

Положительным результатом считается флюоресценция, оцениваемая на четыре и три креста при наличии 2 — 3 клеток в каждом поле зрения препарата.

РНАт является модификацией реакции пассивной гемагглютинации и основана на нейтрализации антител специфическим антигеном, находящимся в исследуемом материале. Тем самым специфическая сыворотка лишается способности агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные специфическим антигеном.

РНАт применяется для обнаружения бруцеллезного антигена в патологическом материале, пищевых продуктах и объектах внешней среды.

Подготовка исследуемого материала.

Материал, подозрительный на зараженность бруцеллами, перед постановкой реакции следует обезвредить путем прогревания при 100 °C (в кипящей водяной бане) в течение 10 минут. Жидкости (вода, молоко) прогревают в нативном виде. После прогревания воду и молоко центрифугируют при 3000 об./мин. 2 часа и берут для исследования осадок. Кусочки органов, брынзу и другой материал предварительно измельчают и растирают в ступке с добавлением 9 объемов физиологического раствора, полученную суспензию прогревают. Прогретую суспензию фильтруют через 2 слоя марли или бумажный фильтр и исследуют фильтрат или же центрифугируют его и берут для реакции надосадочную жидкость и осадок.

Реакцию ставят в полистироловых пластинах с лунками, которые должны быть тщательно вымыты, т.к. реакция отличается высокой чувствительностью и присутствие даже следов антигена может исказить ее результаты. Для постановки РНАт нужны те же ингредиенты, что и для РПГА, и, кроме того, взвесь убитых бруцелл

8 в концентрации 5 x 10 мкл/мл и бруцеллезная сыворотка с высоким титром гемагглютинирующих антител.

Бруцеллезную сыворотку предварительно титруют в РПГА, определяя ее предельное разведение, дающее реакцию не менее чем 3+. Это разведение принимают за одну сывороточную гемагглютинирующую единицу. Для РНАт берут разведение сыворотки, соответствующее 4 единицам. Например, если 1 единица соответствует разведению 1:25600, то 4 единицы — 1:6400. Поскольку в РНАт бруцеллезная сыворотка берется в объеме 0,25 мл, ее следует разводить в удвоенном титре (титр 1:3200). Реакцию ставят в 4-х рядах лунок, первый ряд — опытный (8 — 10 лунок), остальные — контрольные (6 лунок).

В первом (опытном) ряду титруют испытуемый материал. Во втором ряду (контроль 1) контролируется возможность неспецифической реакции за счет тканевых антигенов или гетерогенных антител. В третьем ряду (контроль 2) контролируется специфичность РНАт с заведомо бруцеллезным антигеном. В четвертом ряду (контроль 3) проверяется активность бруцеллезной сыворотки.

Если одновременно исследуют несколько проб, то для каждой пробы ставят только 1-й контроль, а второй и третий контроли ставят для всей партии проб.

В лунки первого, второго и третьего рядов вносят нормальную сыворотку кролика (разведенную 1:100) по 0,25 мл, а в четвертый ряд по 0,5 мл в каждую лунку, кроме первой лунки. Затем в 1-е лунки опытного и второго (контроль 1) рядов вносят по 0,25 мл исследуемого материала и титруют. В третий (контроль 2) ряд вносят бруцеллезный антиген в объеме 0,25 мл и также титруют. Во все лунки 1-го (опытного) и 3-го (контроль 2) рядов добавляют по 0,25 мл положительной бруцеллезной сыворотки 4 сывороточных гемагглютинирующих единиц (например, 1:3200).

Во все лунки второго (контроль 1) ряда добавляют 0,25 мл нормальной сыворотки кролика (1:100). В четвертом (контроль 3) ряду разводят бруцеллезную положительную сыворотку в объеме 0,5 мл, начиная с разведения, которое было использовано в первом (опытном) и третьем (контроль 2) рядах и проверяют соответствие разведения сыворотки 4-м сывороточным единицам (например, 1:6400). Пластины встряхивают и ставят в термостат при 37 °C на 2 часа. Затем во все лунки четырех рядов добавляют по 0,05 мл (1 капля) 2,5% взвеси бруцеллезного эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 — 3 часа.

При наличии бруцеллезного антигена в исследуемом материале эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки» или маленького колечка — реакция нейтрализации положительная. Если в исследуемом материале антиген отсутствует, то специфические антитела, добавленные в реакцию, остаются свободными и склеивают эритроциты — реакция нейтрализации отрицательная.

За титр РНАт принимают последнее разведение исследуемого материала, которое вызывало полное подавление гемагглютинации. Результат РНАт считается положительным, если подавление гемагглютинации отмечается не менее чем в первых 2 — 3 лунках.

Техника постановки РНАт в микрообъемах.

В лунки микротитровальных пластинок вливают по 0,025 мл (1 капля) 1% нормальной сыворотки кролика. Затем титратором с головкой, вмещающей 0,025 мл, набирают исследуемый материал 1:5 — 1:10 и титруют переносом по 0,025 мл из одной лунки в другую в 7 — 8 разведениях. Из последней лунки 0,025 мл удаляют (так же, как в РПГА). После этого в лунки добавляют по 0,025 мл раствора бруцеллезной сыворотки в такой концентрации, чтобы в этом объеме содержалось четыре гемагглютинирующие единицы сыворотки. Пластины оставляют на 1 час при комнатной температуре и затем во все лунки добавляют по 0,025 мл диагностикума бруцеллезного эритроцитарного в концентрации 0,5%. За титр реакции принимают последнее разведение исследуемого материала, в котором отмечено полное подавление гемагглютинации.

Примечания. 1. Перед работой головки используемых титраторов следует предварительно обжечь.

2. При заборе материала для исследования и титрации нельзя прикасаться головкой титратора к стенкам пробирок или лунок титровальных пластинок, что может привести к удалению части жидкости.

3. Для заполнения титраторов достаточно погрузить их головки в исследуемую жидкость и убедиться в заполнении головок жидкостью.

Метод используется для выявления бруцеллезного антигена в объектах внешней среды, пищевых продуктах и биологических объектах, а также для идентификации выделенных культур бруцелл. Метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, возможностью количественной и автоматизированной оценки результатов, воспроизводимостью и стандартностью основных ингредиентов анализа. С помощью ИФА можно выявить бруцеллы в концентрации 1 x 10(3) — 1 x 10(4) мкл/мл или 1 — 5 нг/мл бруцеллезного растворимого антигена.

Для постановки ИФА используют иммуноферментную тест-систему для определения бруцеллезного антигена, в которую входят: иммуноглобулины бруцеллезные, бруцеллезный конъюгат, бруцеллезный антиген (ЛПС), набор солей, необходимых для приготовления буферных растворов, субстрат — ортофенилиндиамин (ОФД). Твин-20, бычий сывороточный альбумин (БСА, полистироловые планшеты для иммунологических реакций).

Выявление бруцеллезного антигена в ИФА происходит за счет специфического взаимодействия бруцеллезных иммуноглобулинов, сорбированных на планшете, с бруцеллезным антигеном, содержащимся в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс «антиген + антитело» выявляют с помощью конъюгата (бруцеллезные антитела, меченные пероксидазой хрена).

1. Сенсибилизация твердой фазы. В лунки планшета вносят с помощью дозатора по 200 мкл раствора бруцеллезных иммуноглобулинов в рабочем разведении (20 мкг/мл) в 0,02М растворе ФСБ, pH 7,2. Планшеты помещают в термостат на 2 часа при 37 °C или в холодильник на 18 часов при 4 °C. После окончания адсорбции иммуноглобулины удаляют из лунок планшета встряхиванием и трехкратно отмывают раствором ФСБ, содержащим 0,1% твина-20.

2. Внесение исследуемого материала. Исследуемый материал в разведениях (двух- или десятикратных) на ФСБ + твин, содержащий 1% БСА, вносят по 100 мкл в каждую лунку. Параллельно с исследуемыми образцами готовят серию последовательных разведений контрольного образца бруцеллезного антигена в концентрациях от 1 до 1000 нг/мл и каждое разведение антигена вносят в количестве 100 мкл в лунки планшета. Планшеты выдерживают в термостате при 37 °C в течение часа, после чего жидкость из планшета удаляют встряхиванием и планшеты отмывают, как указано в п. 1.

3. Внесение конъюгата. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора коньюгата в рабочем разведении (коньюгат разводят на ФСБ + твин, содержащий 1% БСА). Планшеты помещают в термостат на 40 мин., а затем отмывают, как указано в п. 1.

4. Проявление реакции. В каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного раствора, содержащего 0,04% ОФД и 0,04% H2O2 в 0,1М цитратно-фосфатном буфере, pH 5,5. Планшеты помещают в темное место при комнатной температуре на 15 — 20 мин. Реакцию останавливают внесением в лунки 50 мкл серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.

5. Оценка результатов. Оценку результатов проводят по изменению окраски субстрата (от светло-коричневой до оранжево-коричневой) визуально или с помощью фотометра при длине волны 492 нм, сравнивая интенсивность окраски контрольных и опытных проб. Появление желто-оранжевого окрашивания в опытных лунках и положительном контроле при его отсутствии в лунках с отрицательными контролями свидетельствует о наличии в пробе бруцеллезного антигена. При фотометрическом учете результатов анализа проба считается положительной, если ее оптическая плотность (ОП) в 2 и более раз превосходит наивысшее значение ОП отрицательных контролей, которое не должно превышать 0,2.

источник