Разнообразные клинические проявления бруцеллеза приводят к необходимости широкого использования лабораторных методов исследования: бактериологического, биологического, серологического и аллергического. Комплекс лабораторных исследований с обязательным учетом клинических, эпидемиологических и эпизоотологических данных обеспечивает правильную диагностику заболевания.
Работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в строгом соответствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
Бактериологический метод.Для исследования на бруцеллез в лабораторию поступает патологический материал от больных людей (кровь, мокрота, гной, суставная жидкость, пунктат из селезенки, моча), сельскохозяйственных животных (абортированный плод, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, кровь, моча, молоко, молочные продукты) и различные объекты окружающей среды (вода, навоз). Материал для исследования забирают в стерильную посуду.
Для выделения культур бруцелл всех видов используют печеночные и мясопептонные агары в различных модификациях, агар Альбими, сухие питательные среды — агар «Д» и эритрит агар. Посев материала производят на качественные, предварительно проверенные питательные среды, выращивают при 37 °С в аэробных условиях и с повышенным (5-10 %) содержанием углекислого газа.
Исследование крови необходимо проводить во время лихорадочного состояния больного до лечения антибиотиками, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона среды Кастанеда. Начиная с четвертого дня, посевы ежедневно просматривают и, при отсутствии роста культуры, поверхность агара орошают бульоном путем осторожного покачивания флакона. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца роста бруцелл не обнаруживают, то делают контрольный высев из бульона среды Кастанеда на твердую питательную среду.
При обследовании людей на бруцеллез для удобства доставки флаконов с кровью можно пользоваться транспортной жидкой средой, которую готовят заранее и хранят в лаборатории в течение полугода. Кровь доставляют в лабораторию в транспортной среде, засевают на среду Кастанеда и исследуют по общепринятой схеме.
Бруцеллы можно выделить из костного мозга, мочи, спинномозговой жидкости, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т. д. Исследуемый материал по 0,1 мл засевают на пластинки питательного агара и по 5-10 мл на жидкие питательные среды. Для задержки роста посторонней микрофлоры при исследовании загрязненного материала к среде добавляют генцианвиолет (1:200 000) или антибиотики (пенициллин 0,25 ед/мл и стрептомицин 0,05 ед/мл).
Особого внимания заслуживает получение культуры из молока сельскохозяйственных животных. Забор молока у овец, коров, верблюдов и коз рекомендуется проводить путем сдаивания его последних порций из каждого соска вымени по 10 мл в стерильную посуду. Если исследовать молоко в течение первых суток не удается, то его консервируют добавлением сухой борной кислоты 1 %, генцианвиолета 1:25 000. Для исследования молока из больших емкостей забирают 100 мл верхнего слоя, затем перемешивают и набирают еще 100 мл.
Лучшие результаты дает посев сливок, полученных центрифугированием молока при 2,5-3 тыс. об/мин в течение 3-5 мин или путем отстаивания в течение одних суток в холодильнике. Сливки в количестве 0,1-0,2 мл засевают на твердую питательную среду с подавителем посторонней микрофлоры (4-6 пробирок на 1 пробу).
Бактериологический метод считается самым достоверным, т. к. выделение бруцелл является неопровержимым доказательством бруцеллезной инфекции. Отрицательные результаты бактериологического исследования не дают права для заключения об отсутствии заболевания.
Биологический метод.Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или содержащего малые концентрации возбудителя, в качестве биологической пробы используют морских свинок (весом 250-300 г) или белых мышей (весом 17-18 г). Исследуемый материал в объеме не более 0,5 мл вводят подкожно в паховую область белой мыши и 1 мл морской свинке.
Вскрытие белых мышей производят через 20-25 дней, а морских свинок — через 30-35 дней после введения материала. Перед вскрытием у свинок кровь из сердца исследуют в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный), кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей — лимфатические узлы (паховый, аксиллярный, парааортальный, подчелюстной), кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селезенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг извлекают пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательную среду (агар и бульон). Лимфатические узлы и органы перед посевом надсекают ножницами, берут стерильной деревянной палочкой, вносят первоначально в пробирку с агаром, раздавливают и тщательно втирают материал в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. Палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом. После использования ее погружают на 1 час в дезраствор.
Все посевы дублируют (часть помещают в условия повышенного содержания углекислоты), выдерживают при 37 °С до 30 дней. Для предотвращения высыхания питательных сред пробирки заливают парафином или закрывают резиновыми колпачками.
Посевы просматривают каждые 3-4 дня. Из помутневших бульонов делают высев в пробирки со скошенным агаром. Колонии бруцелл на пластинчатом агаре становятся видимыми на 5-7 сутки, иногда позднее. По истечении 30 дней наблюдение прекращают. Если за это время рост не появился, посевы уничтожают, а результаты бактериологического исследования считают отрицательными.
Результат оценивают положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл. Идентификацию возбудителя бруцеллеза проводят по: по характеру роста культуры на плотных питательных средах; морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, Козловскому; агглютинации со специфической бруцеллезной сывороткой на стекле и объемным методом; свечению на 3-4+ культур, обработанных бруцеллезной люминесцирующей сывороткой.
Культуры предварительно проверяют на наличие признаков диссоциации, одним из перечисленных выше методов.
Дифференциации (определение видов и биоваров) подлежат культуры в S-форме после идентификации.
Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета номенклатуры бактерий и Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу в 1972 г. были определены единые тесты для проведения идентификации и дифференциации бруцелл для всех стран мира.
О видовой принадлежности культуры бруцелл и биоварах судят на основании результатов комплексного изучения отношения выделенных культур к условиям выращивания (при повышенном содержании углекислоты или в обычных аэробных условиях), чувствительности к анилиновым краскам (бактериостатическим методом), способности образовывать сероводород, чувствительности к бруцеллезному фагу «Тb», окислительно-метаболических тестов, агглютинабельных свойств культур с использованием монорецепторных сывороток (антиабортус и антимелитензис) и дополнительного исследования уреазной активности, вирулентности и других признаков. Дифференциацию бруцелл на виды и биовары проводят в параллельных опытах испытуемых штаммов с референтными всех трех видов бруцелл.
Серологические и аллергические методы исследования на бруцеллез.Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.
В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.
При проведении эпидемиологического исследования в очагах применяют реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и объемную (Райта), реакцию Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилактической вакцинацией населения можно ограничиться постановкой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.
Для диагностики острого и подострого бруцеллеза ставят реакцию Хеддльсона, Райта и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса.
При диагностике хронического бруцеллеза и проведении диспансерного наблюдения за переболевшими рекомендуют наряду с реакциями Хеддльсона, Райта, РПГА, использовать реакцию Кумбса и аллергическую пробу (Бюрне).
Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменить друг друга. Это обусловливает необходимость применения комплексного серологического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.
В ранние сроки от начала заболевания (первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического. Серологические реакции в этот период оказываются положительными почти в 95 % случаев. По мере удлинения срока заболевания процент положительных серологических реакций начинает снижаться. При проведении обследования необходимо учитывать, что высокие титры антител всегда указывают на наличие инфекции, антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключает возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется проводить повторные исследования с интервалом 1-2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.
Для постановки диагноза бруцеллеза у крупного рогатого скота применяют серологические и аллергические методы. Обследование начинают с постановки роз-бенгал пробы (РБП). Сыворотки, с которыми получена положительная РПБ, исследуют в РА Райта, РСК (РДСК), РПГА для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. Исследование проводят двукратно с промежутком в 30 дней.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ
Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы
источник
В постановке диагноза бруцеллез очень важна роль лабораторных методов исследования, которые довольно часто приобретают решающее значение в диагностике бруцеллеза или в исключении его у обследуемого больного при учете клинико-эпидемиологических данных.
К основным методам лабораторной диагностики бруцеллеза относятся бактериологический, биологический, реакции агглютинации сыворотки крови или ликвора больных со специфическим антигеном, аллергическая проба Бюрне.
Бесспорным признаком бруцеллеза является выделение бруцелл из различных биосубстратов (кровь, моча, ликвор, костный мозг, мокрота, желчь, вагинальные выделения, экссудат из очагов воспаления, молоко кормящей женщины). Разумеется, отрицательные результаты посева еще не исключают наличие бруцеллеза.
Выделение гемокультуры зависит от температурной реакции, напряженности специфического иммунитета больного и, разумеется, от качества лабораторных сред и методов бактериологического исследования. Объединенный комитет экспертов ВОЗ по бруцеллезу рекомендует в качестве основных питательных сред использовать сыворочно-декстрозный агар, приготовленный на мясном экстракте, агар из картофельного настоя с сывороткой или кровью.
Очень редко Бруцелла выделяется из мочи, желчи, мокроты, ликвора, межплевральной жидкости, влагалищных выделений и грудного молока.
Реакция агглютинации с бруцеллезным антигеном в пробирках (реакция Райта)
Одним из основных серологических методов диагностики бруцеллеза до настоящего времени остается реакция агглютинации в пробирках, предложенная Райтом и Семплем в 1897 году. Она проста в постановке, чувствительна, высокоспецифична и положительна в титрах 1:200 в конце первой и на второй неделе болезни. При хроническом бруцеллезе титр снижается, и реакция становится сомнительной. Нарастание титра антител свидетельствует об обострении заболевания.
Реакция Райта проводится в пробирках в объеме 1 мл с разведениями сыворотки 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 и единым бруцеллезным диагностикумом. Последний представляет собой взвесь убитых нагреванием и фенолом бруцелл. Для пробирочной реакции диагностикум разводят в 10 раз карболизированным (0,5%) физраствором. Методика разведения сыворотки обычна для пробирочной реакции агглютинации. Пробирки встряхивают, ставят в термостат при температуре 37° до следующего дня. Учет реакции проводят обычным способом или по 50% агглютинации (2+) в сравнении со стандартом мутности. Серийные титры 50% агглютинации 1:50, 1:100, 1:200, 1:400,1:800 свидетельствуют о том, что в 1 мл исследуемой сыворотки содержится соответственно 50, 100, 200, 400, 800 МЕ антител. Выраженность реакции больного оценивают по следующей схеме: титр 1:50 оценивается как сомнительный, 1:100 – слабо положительный, 1:200 и 1:400 – положительный, 1:800 – резко положительный.
При остром бруцеллезе реакция Райта положительна у больных в титре 1:200-1:800, тогда как при хроническом бруцеллезе – в титре 1:50-1:100. В то же время обострение хронического бруцеллеза сопровождается повышением титра 1:200-1:400.
Перечисленные показатели относятся к больным, заражение которых происходило в период их кратковременного пребывания в сельской местности, неблагополучной по бруцеллезу, или в результате систематического употребления некипяченого «фляжного» молока в городе.
Иногда резко выраженная реакция Райта наблюдается у больных со слабо выраженными клиническими проявлениями бруцеллеза. Приводим пример истории болезни № 13.
Больная С., 44 года, домохозяйка. Поступила с жалобами на общую слабость. Других жалоб не предъявляла. Обратилась к участковому терапевту с просьбой назначить ей рентгеноскопию легких, так как болела раньше туберкулезом легких (снята с учета два года назад). Объективно: температура 37,1-37,5°(в течение восьми дней), кожные покровы бледные, повышенной влажности. Шейные лимфоузлы величиной с горошину, безболезненные. Костно-мышечная система без особенностей. Тоны сердца ясные, ритмичные, ЧСС – 88 ударов в минуту. В легких – дыхание жесткое, хрипы не выслушиваются. Печень и селезенка не пальпируются. Общее состояние удовлетворительное. Ввиду наличия в населенном пункте эпизоотии бруцеллеза среди овец и коз, находящихся в личных хозяйствах, больная была своевременно обследована на бруцеллез. Реакция Райта – резко положительная (1:1600), реакция Хеддльсона – резко положительная, проба Бюрне – отрицательная. Из крови выделена Bruccella melitensis.
Основным фактором, определяющим классическую форму острого бруцеллеза, является бактериемия, фаза гематогенного заноса, сопровождающаяся реактивной перестройкой организма и появлением специфических антител в сыворотке крови больных.
В патогенезе же хронических форм бруцеллеза решающую роль играют аллергия и парааллергия, что не может, в свою очередь, не отразиться на уменьшении титра антител в крови.
Серологическая реакция агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона)
Реакция Хеддльсона (пластинчатая – применяют на стекле) более чувствительна, но менее специфична, дает возможность выявлять агглютинины в первые дни болезни, быстро получить ответ. На большое (9х12см) хорошо обезжиренное сухое стекло на расстоянии 3-4 см друг от друга микропипеткой наносят исследуемую сыворотку в дозах 0,04, 0,02, 0,01 мл (опытные капли) и 0,02 мл (контрольная капля). К трем первым каплям сыворотки добавляют по 0,03 мл единого неразведенного диагностикумума, к последней – 0,03 мл физраствора. Максимальный срок наблюдения – 8 минут. Учет осуществляют невооруженным глазом по 4+ системе. При положительной реакции в опытных каплях появляются хлопья и жидкость становится более или менее прозрачной. Агглютинацию во всех трех дозах 4+ принимают за резко положительный результат, в первой и второй дозах – за положительный результат, только в первой дозе – сомнительный результат, отсутствие агглютинации во всех дозах – отрицательный результат.
Применяется в модификации Е. Кайтмазовой для массовых обследований.
Другие серологические методы диагностики
Используются РСК, РПГА, положительная с разведения 1:100, реакция иммунофлюоресценции и антиглобулиновая проба Кумбса. В последнее время апробирована и получила высокую оценку, особенно в диагностике хронического бруцеллеза (до 65%), реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА), позволяющая определять антигенемию бруцелл.
Аллергическая внутрикожная проба Бюрне
Одним из основных факторов, определяющих клинические проявления бруцеллеза, является гиперчувствительность замедленного типа.
Степень специфической сенсибилизации организма при различных клинических формах бруцеллеза неодинакова. Она проявляется как общей, очаговой, так и местной реакцией. Исходя из этого, в 1922 году Бюрне предложил с целью диагностики бруцеллеза внутрикожную аллергическую пробу. Известно, что эта проба основана на способности организма, зараженного бруцеллезом, отвечать местной реакцией на внутрикожное введение бруцеллезного антигена.
Местная реакция может проявляться в виде отека, болезненности, гиперемии. Внутрикожная проба Бюрне ставиться согласно общепринятой методике. Используется 0,1 мл бруцеллина, который вводится внутрикожно на внутреннюю (ладонную) поверхность предплечья. Слабооположительная реакция считается при наличии отека при1-3 см, положительная реакция – при отеке 3-6 см, резко положительная реакция – при отеке более 6 см. Проба Бюрне считается также резко положительной (независимо от размера отека), если имеется лимфангоит или лимфаденит, либо некроз в месте введения бруцеллина. Оценку реакции проводят через 24 (рис. 18) и 48 часов (рис. 19). Значение ее выше в хронической стадии заболевания. Проба может быть положительной у вакцинированных лиц.
Рис. 18. Проба Бюрне через 24 часа.
Рис. 19. Проба Бюрне через 48 часов.
Особо необходимо отметить появление у некоторых больных бруцеллезом гиперергической реакции в ответ на введение аллергена, которая выражается в значительном повышении температуры (39-40°), в усилении болевого синдрома, иногда в появлении аллергической сыпи. В этих случаях повторная постановка пробы Бюрне противопоказана.
Для каждой формы бруцеллеза характерны следующие методы диагностики:
- При остросептической форме бруцеллеза, соответствующей фазе выраженной генерализации инфекции, наблюдаются высокие титры реакции Райта и резко положительная реакция Хеддльсона. РСК при остросептической форме бруцеллеза отстает по чувствительности от реакции агглютинации. Наряду с этим наблюдается нерезко выраженная сенсибилизация к бруцеллезному антигену.
- Переход остросептической формы бруцеллеза в септико-метастатическую и вторично-хроническую форму характеризуется патогенетическим метастазированием возбудителя в органы и системы, сопровождается снижением гуморального иммунитета. Об этом свидетельствует существенное уменьшение числа положительных реакций агглютинации Райта и реакции Хеддльсона. Наряду с этим значительно увеличивается количество больных с положительной и резко положительной аллергической пробой Бюрне.
- При первично-хронической форме бруцеллеза, начинающейся постепенно, исподволь и отличающейся меньшей выраженностью клинических симптомов, положительные реакции Райта и Хеддльсона обнаруживаются несколько реже, чем при вторично-хронической форме. Более чувствительной, чем серологические реакции, при первично-хроническом бруцеллезе является внутрикожная аллергическая проба Бюрне. Серологические реакции, как и аллергическая проба Бюрне, при первично-хроническом бруцеллезе наиболее выражены в первые два года от начала заболевания, после чего наблюдается их постепенное «угасание».
В постановке диагноза нейробруцеллеза важную роль играют такие методы диагностики, как компьютерная томография головного мозга и магнитно-резонансная томография.
АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ
Обязательные диагностические исследования:
- Общий анализ крови, общий анализ мочи, RW, биохимический анализ крови (общий белок и его фракции, С-реактивный белок, сиаловые кислоты, серомукоид, билирубин, трансаминазы, тимоловая проба), сахар крови, анализ крови на ревмопробы.
- Бактериологический метод при подозрении на острый бруцеллез (посевы крови, пунктата костного мозга, лимфатических узлов).
- Реакция Райта.
- Реакция Хеддельсона.
- Проба Бюрне.
Дополнительные диагностические исследования (по показаниям и наличии возможности)
- КТ и МРТ головного мозга.
- Электроэнцефалография.
- Компьютерная паллестезиометрия
- Анализ ликвора.
- Исследование глазного дна.
- Анализ синовиальной жидкости и биоптата синовиальной оболочки, рентгенологическое и ультразвуковое исследование (артросонография), радинуклеидная сцинтиграфия опорно-двигательного аппарата.
- Консультации ортопеда, ревматолога, невролога, окулиста, кардиолога, уролога, гинеколога, гастроэнтеролога, дерматолога, иммунолога.
ЛЕЧЕНИЕ БРУЦЕЛЛЕЗА
Большое количество разнообразных средств и методов, предложенных для лечения больных бруцеллезом, свидетельствует о клиническом полиморфизме данной инфекции и о недостаточной эффективности этих средств. Вот почему проблема лечения бруцеллеза до настоящего времени не нашла удовлетворительного разрешения, хотя, по справедливому замечанию Коровицкого Л.К., мнение о полной неизлечимости бруцеллеза следует считать ошибочным.
Показания и противопоказания
В лечении нуждаются все пациенты с наличием совокупности клинико-эпидемиологических данных и результатов специального обследования, позволяющих поставить диагноз «бруцеллез».
При выявлении положительных серологических и (или) аллергологических тестов при отсутствии клинических проявлений заболевания (группа положительно реагирующих на бруцеллез) лечение не проводится. В этом случае необходимо тщательное обследование врачом инфекционистом два раза в год с обязательным лабораторным исследованием сыворотки крови на бруцеллез и, при необходимости, специалистами по профилю выявленной патологии.
Дифференциальные подходы к терапии бруцеллеза
Эффективность лечения больного бруцеллезом зависит от многих факторов. Прежде всего, это своевременное установление диагноза и назначение адекватной специфической и патогенетической терапии. Однако и при выявлении этого условия лечение бруцеллеза представляет трудную проблему. Одной из причин является многообразие клинических форм, механизмов, лежащих в основе тех или иных проявлений; в связи с этим необходимо индивидуализировать терапию.
Так, при наличии активного инфекционного процесса (острый, острый рецидивирующий, хронический активный бруцеллез в стадии обострения), сопровождающегося свободной циркуляцией возбудителя в кровеносном русле, требуется назначение антибактериальных средств. При хроническом бруцеллезе чаще всего на первое место выступают патологические иммунологические реакции, в связи с чем место этиотропной терапии занимает патогенетическая. Кроме того, наличие многочисленных очаговых проявлений и сопутствующей патологии вносит свой вклад в неизбежность полипрагмазии и, соответственно, увеличения риска побочных реакций.
Таким образом, при составлении плана лечения больного бруцеллезом необходимо учитывать форму заболевания, стадию процесса, совокупность и характер очаговых поражений, наличие сопутствующей патологии, аллергологический анамнез, возраст пациента – то есть терапия должна быть строго дифференциальной.
Антибактериальная (этиотропная) терапия составляет основу лечения больных с острой и рецидивирующей формой бруцеллеза. При выборе антибактериального средства необходимо, прежде всего, учитывать чувствительность к нему бруцелл, а также преимущественно внутриклеточную локализацию возбудителя и механизм транспорта лекарственного препарата внутрь клетки. Имеет значение спектр побочных эффектов антибиотика и совокупность органопатологии у больного, наличие индивидуальной непереносимости медикаментов.
источник
Купить ГОСТ 34105-2017 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
- Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
- Курьерская доставка (7 дней)
- Самовывоз из московского офиса
- Почта РФ
Распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза: — реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами; — пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба); — реакция связывания комплемента; — реакция длительного связывания комплемента на холоде; — реакция непрямой гемагглютинации; — реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном; — реакция иммунодиффузии в геле агара с R-бруцеллезным антигеном; — кольцевая реакция с молоком; — иммуноферментный анализ; — иммунохроматографический анализ. Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella.
Информация бюро по стандартам МГС о дополнительном присоединении страны Узбекистан (UZ, Узстандарт); ИУС 2-2018
3 Термины, определения и сокращения
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности
5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные.
7 Методы серологической диагностики бруцеллеза
8 Интерпретация результатов исследований
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия. обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2017 г № 99-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны no МК (ИСО 3166) 004—97
Код страны по МК (ИСО 3166)004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 июня 2017 г. № 582-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34105-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2018 г.
5 ВЗАМЕН ГОСТ 25385-91 в части серологических методов диагностики
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен. тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
При получении отрицательных результатов КР по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотку крови животных стада (группы, населенного пункта), в котором выявлены особи, сомнительно или положительно реагирующие в КР. исследуют на бруцеллез в РБП. или в РА и РСК (РДСК). или в РА и РИД. или в РИГА, или в ИФА. При этом проводят клинический осмотр животных и исключают их заболевание маститами.
7.4 Реакция агглютинации (РА) в пробирках
7.4.1 РА в пробирках с бруцеллезным антигеном применяют при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота (буйволов, яков, зебу), овец. коз. лошадей, верблюдов, оленей (маралов), собак, пушных зверей и морских свинок.
7.4.2 Приготовление фенолизированных растворов хлористого натрия с содержанием фенола 0,5 %
В 1 дм 3 дистиллированной воды растворяют соответственно 8.5. 50 и 100 г хлористого натрия и добавляют к каждому раствору по 5 г фенола. Растворы фильтруют дважды через бумажный фильтр. Растворы хранят в стеклянных бутылях, укупоренных резиновыми пробками при температуре от 2 °С до 20 °С. и используют в течение 1 мес.
7.4.3 Проведение исследования
7.4.3.1 При исследовании в РА сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов, собак, пушных зверей и морских свинок и антиген разводят фенолизированным 0,85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; овец и коз — фенолизированным 5 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2; оленей (маралов) — фенолизированным 10 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
7.4.3.2 Сыворотки крови исследуют в четырех разведениях в пробирках Флоринского в обьеме 1 см 3 :
— для крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов — в разведениях 1:50.1:100.1:200 и 1:400;
— для овец. коз. оленей (маралов) и собак — в разведениях 1:25.1:50.1:100 и 1:200;
— для собак с R-бруцеллезным антигеном (B.canis)— в разведениях 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400;
— для пушных зверей и морских свинок — в разведениях 1:10,1:20.1:40 и 1:80.
Исследование каждой сыворотки проводят в пяти пробирках.
7.4.3.3 Получение исходного разведения проб сыворотки:
— сыворотки крови крупного рогатого скота (лошадей, верблюдов) по 0.1 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2.4 см 3 фенолизироваиного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия по
— сыворотки крови овец, коз и собак по 0.2 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по 2.3 с».» 3 фенолизированного 5 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4 2 (разведение 1:12.5);
— сыворотку крови оленей и маралов по 0.2 см 3 вносят в пробирки первого ряда, содержащие по
2,3 см 3 фенолизированного 10 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:12.5);
— сыворотку крови пушных зверей и морских свинок по 0.3 ал 3 вносят в пробирки первого рада, содержащие по 1.2 см 3 фенолизированного 0,85 %-ного раствора хлористого натрия по 7.4.2 (разведение 1:5);
— при исследовании с ^-бруцеллезным антигеном (B.canis) сыворотку крови собак по 0.1 см 3 вносят в пробирки, содержащие по 2.4 см 3 фенолизированного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия по
В пробирки второго ряда раствор хлористого натрия не вносят.
В пробирки третьего, четвертого и пятого рядов вносят по 0.5 см 3 соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2.
Затем в пробирки второго и третьего рядов вносят по 0.5 см 3 исходного разведения сыворотки.
После пипетирования (не менее трех раз) разведение сыворотки из третьего ряда по 0.5 см 3 переносят в пробирки четвертого рада и после пипетирования из четвертого — в пятый. Из пробирок пятого ряда 0.5 см 3 жидкости удаляют. Таким образом, получают последовательные двукратные разведения образцов сыворотки.
7.4 3 4 В пробирки второго, третьего, четвертого и пятого рядов с разведенными сыворотками вносят при помощи группового дозатора Флоринского или другого дозирующего устройства по 0.5 см 3 антигена в рабочем разведении 1:10 (1.0 ♦ 9.0 сгл 3 ) соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2.
После внесения антигена разведение сыворотки в каждой пробирке удваивается.
В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем сыворотки на самоагглютина-цию. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглю-тинации не учитывают.
После добавления к исследуемым и контрольным сывороткам антигена штативы с пробирками интенсивно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37 °С—38 *С на 16—20 ч. затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
7.4.3.5 На территориях, угрожаемых или неблагополучных по бруцеллезу, проводят массовые серологические исследования. При этом допускается проведение исследований в двух разведениях Сыворотки разливают индивидуальной микропипеткой (с резиновой грушей), или групповыми дозаторами Флоринского. или одноканальными пипеточными дозаторами в две серологические пробирки Флоринского в дозах 0.02 и 0.01 см 3 (сыворотки крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов) или 0.04 и 0.02 см 3 при исследовании сывороток овец, коз. оленей (маралов) и собак. Затем в каждую пробирку вносят по 1.0 см 3 антигена, разведенного соответствующим фенолизированным раствором хлористого натрия по 7.4.2 в соотношении 1:20. При этом сыворотки крови будут разведены соответственно 1:50 и 1:100 или 1:25 и 1:50.
При получении положительных или сомнительных результатов РА при массовом исследовании эти сыворотки исследуют в четырех разведениях.
Массовые исследования пушных зверей и морских свинок не проводят.
7.4.4 Обработка результатов
Результаты реакции учитывают визуально, определяя степень просветления жидкости, внешний вид агглютината (при его наличии) или антигена на дне пробирки до и затем, после легкого встряхивания. оценивают в крестах по следующей схеме:
«++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости, микробные клетки антигена осели на дно пробирки в виде «зонтика», при легком встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, а >ющ-кость остается прозрачной (100 % агглютинации);
«♦++» (три креста) — неполное просветление жидкости и хорошо выраженный «зонтик» агглютината (75 % агглютинации);
«++» (два креста) — неполное просветление жидкости, «зонтик» агглютината умеренно выражен (50 % агглютинации);
«+» (один крест) — едва заметное просветление жидкости, «зонтик» агглютината выражен слабо, при встряхивании заметно небольшое количество хлопьев или комочков (25 % агглютинации);
«-» (минус) — просветления жидкости и образования «зонтика» агглютината не наступило, на дне пробирки по центру образуется небольшой осадок микробов антигена в виде точки или пятна. При встряхивании осадок легко разбивается, поднимается вверх в виде косички и равномерно распределяется в жидкости, которая при этом приобретает первоначальную мутность.
За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация на два креста («++»), что соответствует количеству международных единиц (ME) антител в 1 см 3 сыворотки (например, сыворотка с титром 1:100 содержит 100 ME. 1:200 — 200 ME и т. д.).
Для более объективной оценки результатов РА готовят образцы сравнения мутности, соответствующие 75 %. 50 %. 25 % и 0 % просветления жидкости.
В четыре пробирки последовательно вносят 0.5; 1.0; 1.5 и 2,0 см 3 антигена, разведенного 0,85 %-ным фенолизированным раствором хлористого натрия в соотношении 1:10. Затем в том же порядке в три первые пробирки добавляют 1,5; 1,0 и 0,5 см 3 соответствующего фенолизированного раствора хлористого натрия по 7.4.2. После перемешивания содержимого пробирок из каждой из них переносят по 1.0 см 3 в серологические пробирки. Полученные образцы сравнения мутности соответствуют 75 %. 50 % и 25 % просветления жидкости. В четвертой пробирке просветление отсутствует. Образцы сравнения мутности готовят каждый раз при постановке РА и выдерживают в термостате одновременно с основной реакцией.
При массовых исследованиях в двух разведениях все сыворотки, давшие агглютинацию с оценкой не менее чем на два креста («++») в каком-либо из указанных разведений, исследуют повторно в четырех разведениях.
В заключении лаборатории о результатах исследования должны быть отражены диагностическая оценка каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки. в котором получен соответствующий результат, выраженный в международных единицах (например: титр сыворотки крови крупного рогатого скота 1:200 с оценкой два — четыре креста — «положительная» 200 МЕ/см 3 ; титр сыворотки 1:100 с оценкой два — четыре креста — «сомнительная» 100 МЕ/см 3 ).
Результаты исследования исследуемой и контрольных сывороток, серию антигена, срок его годности записывают в журнал серологических исследований.
7.5 Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания
комплемента на холоде (РДСК)
7.5.1 РСК применяют при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого скота (буйволов, яков. зебу), овец. коз. свиней, верблюдов, лошадей, оленей (маралов), собак и пушных зверей.
Сущность реакции состоит в том. что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген — антитело.
7.5.2 РДСК применяют вместо РСК, в том числе для исследования сывороток, обладающих анти-комллементарными свойствами.
Сущность реакции состоит в образовании иммунного комплекса антиген — антитело в присутствии комплемента на холоде в течение нескольких часов.
7.5.3 Подготовка к исследованию
7.5.3.1 Приготовление 0.85 %-ного раствора хлористого натрия
Для приготовления 1 дм 3 раствора 8.5 г хлористого натрия растворяют в дистиллированной воде, устанавливают pH 6.8—7,2 ед. pH 5 %-ным раствором натрия гидроокиси и дважды фильтруют через бумажный фильтр. 0.85 %-ный раствор хлористого натрия хранят в стеклянной бутыли, закрытой резиновой или корковой пробкой, и используют в течение 1 мес.
7.5.3.2 Приготовление 5 %-ного раствора натрия гидроокиси
Для приготовления 5 %-ного раствора натрия гидроокиси 5 г натрия гидроокиси растворяют в 100 см 3 . Раствор хранят при комнатной температуре в течение месяца.
7.5.3.3 Образцы сыворотки крови и компоненты РСК и РДСК разводят 0.85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.5.3.1. Сухой комплемент регидратируют и титруют по ГОСТ 16446.
Берут такое количество флаконов (ампул), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта копичество комплемента. В каждый флакон (ампулу) вносят 0.85 %-ный раствор хлористого натрия в объеме, указанном на этикетке, и. не встряхивая, помещают в холодильник на 20—30 мин. Растворившийся комплемент осторожно перемешивают путем легкого встряхивания флаконов (ампул), сливают в одну пробирку, смешивают и помещают в холодильник при температуре от 4 °С до 10 °С. Непосредственно перед внесением в пробирки для титрования регидратированный комплемент разводят 0,85 %-ным раствором хлористого натрия в соотношении 1:20. а остальной — хранят в холодильнике. Рабочее разведение комплемента также готовят непосредственно перед внесением в пробирки при постановке реакции. Рабочий титр комплемента должен быть на два интервала больше его титра
где А — рабочий титр комплемента, см 3 ;
8 — количество пробирок в опыте, ил;
20 — исходное разведение комплемента (1:20).
Количество комплемента X. см 3 , необходимого для проведения опыта, рассчитывают по формуле
Так как количество комплемента о рабочем разведении, требующемся для всей реакции (на 100 пробирок), равно 20 см 3 (0,2 ■ 100), то к 0,6 см 3 регидратированного комплемента добавляют 19,4 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия.
Гемолитическую сыворотку титруют по ГОСТ 16445 при использовании каждой новой серии и по истечении срока годности.
Рабочий титр гемолитической сыворотки для РСК и РДСК составляет удвоенную дозу от титра. Так. если титр сыворотки равен 1:1500, то рабочий титр в РСК и РДСК будет 1:750.
Эритроциты барана — 2.5 %-ную взвесь эритроцитов барана в 0,85 %-ном растворе хлористого натрия для РСК и РДСК готовят из свежей или консервированной крови барана по ГОСТ 16446. Дефи-бринированную кровь фильтруют через марлю и консервируют стрептомицином из расчета 1 г препарата. растворенного в 10—20 см 3 стерильного 0.85 %-ного раствора хлористого натрия, на 100 см 3 крови. Ю
Консервированная кровь при хранении в холодильнике пригодна для использования, как правило, в течение 10—14 сут.
Гемолитическую систему готовят перед каждой постановкой РСК. Для этого 2.5 %-ную взвесь отмытых эритроцитов и раствор гемолитической сыворотки в рабочем разведении смешивают в равных объемах и при постановке РСК выдерживают в водяной бане при 37 °С—38 °С в течение 15—35 мин (в зависимости от объема и толщины стенок сосуда) при периодическом перемешивании, а при постановке РДСК — в холодильнике. При смешивании компонентов раствор гемолитической сыворотки вносят во взвесь эритроцитов.
Исследуемые и контрольные (бруцеллезная и негативная) сыворотки крови крупного рогатого скота в исходном разведении 1:5 инактивируют в день постановки реакции в водяной бане: для РСК — при 60 «С—62 °С в течение 30 мин (сыворотки крови ослов и мулов — 64 *0—65 °С. буйволов — 62 С—64 °С. свиней — 58 °С—60 °С); для РДСК — сыворотки крови животных всех видов — при 63 С—64 ’С в течение 30 мин.
Рабочие разведения всех компонентов для РСК (РДСК) готовят перед постановкой реакции и проверяют их на антикомплементарные и гемотоксические свойства по следующей схеме, представленной в таблице 1.
Таблица 1 — Проверка антикомплементармых и гемотоксических свойств компонентов реакций
Наименование и объем компонентов реакции, см 3
0.85 %-ный раствор хлористого натрия
Комплемент в разведении 1:20
Гемолитическая сыворотка в рабочем разведении
Антиген в рабочем разведении
0.85 %-ный раствор хлористого натрия
Водяная баня 10 мин при 37 °С—38 °С
Полная задержка гемолиза эритроцитов
В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.
7.5.4 Проведение исследования в РСК
При массовом исследовании постановку реакции проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при постановке в трех пробирках исследуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сывороток), (таблица 2).
Необходимые разведения сывороток готовят следующим образом:
— при массовом исследовании в одной пробирке к 0.05 см 3 исследуемой сыворотки добавляют 0.2 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:5);
— при постановке реакции в трех пробирках в первую вносят 0.1 см 3 исследуемой сыворотки, добавляют 0.4 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение сыворотки крови 1:5 в объеме 0.5 см 3 ) и смешивают. Из первой пробирки переносят 0.2 см 3 во вторую пробирку и 0.1 см 3 — в третью. В третью пробирку добавляют 0,1 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия (разведение 1:10).
Инактивирование разведенных сывороток проводят в порядке, указанном в 7.5.3.3.
Сыворотку. 0.85%-ный раствор хлористого натрия и другие компоненты реакции вносят при помощи индивидуальных пипеток, (дозаторов), групповых дозаторов Флоринского или одноканальных пи-петочных дозаторов с наконечником.
Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
При массовом исследовании
При исследовании в двух разведениях
пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)
пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)
Исследуемая сыворотка, см 3
0,85 %-ный раствор хлористого натрия, см 3
Водяная баня 30 мин при 58 е С—65 °С
0,85 %-ный раствор хлористого натрия, см 3
Антиген в рабочем разведении, см 3
Комплемент в рабочем разведении, см 3
Водяная баня 20 мин при 37 X—38 *С
Гемолитическая система, см 3
Водяная баня 20 мин при 37 *С — 38 *С
Примечание —Допускается смешивание равных объемов рабочих разведений антигена и комплемента непосредственно перед внесением в пробирки
При постановке реакции ставят следующие контроля:
— негативной и бруцеллезной сывороток в разведении 1:5 и 1:10 сантигеном и 1:5 без антигена (по схеме реакции);
— гемолитической системы (0,4 см 3 гемолитической системы и 0,6 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия) — полная задержка гемолиза:
— комплемента (0.2 см 3 комплемента в рабочем разведении. 0.4 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия и 0.4 см 3 гемолитической системы) — полный гемолиз;
— антигена (0.2 см 3 антигена в рабочем разведении. 0.2 см 3 комплемента в рабочем разведении. 0,2 см 3 0,85 %-ный раствор хлористого натрия и 0.4 см 3 гемолитической системы) — полный гемолиз.
При необходимости определения титра исследуемых проб сыворотки, разведения готовят следующим образом: в пробирки первого ряда (разведение 1:5) вносят по 0.8 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. 0.2 см 3 пробы сыворотки и смешивают пипетированием. В пробирки третьего, четвертого. пятого и шестого рядов вносят по 0.2 см 3 0.85 %-ного раствора хлористого натрия. Пробы сыворотки из первого ряда пробирок вносят по 0.2 см 3 в пробирки второго и третьего рядов. В пробирках третьего ряда сыворотку смешивают, получая разведение 1:10; 0.2 см 3 разведения сыворотки вносят в пробирки четвертого ряда, смешивают, получая разведение 1:20. и так далее до шестого разведения 1:80 Из пробирок последнего ряда по 0.2 см 3 разведений сыворотки удаляют. В пробирки второго ряда вносят по 0.2 см 3 0,85 %-ного раствора хлористого натрия (ряд без внесения антигена — контроль антикомпле-ментарных свойств сыворотки). Постановку реакции проводят по схеме, представленной в таблице 2.
7.5.5 Реакция длительного связывания комплемента на холоде (РДСК)
7.5.5.1 Подготовка к исследованию
Сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и в разведении 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном. Инактивирование разведенных сывороток крови и приготовление гемолитической системы проводят по 7.5.3.3.
Комплемент применяют в рабочем разведении 1:25 ипи 1:20 при титре 0.06—0.1 ипи в разведении 1:20—1:15 при титре 0.1—0.14
Одновременно определяют титр гемолитической системы с использованием свежей или консервированной сыворотки по схеме, приведенной в таблице 3.
Учет результатов титрования проводят немедпенно после выемки штатива из водяной бани.
Сыворотка в разведении 1 5,см 3
ная баня 30 мин при 63 *С—64 С
0,85 %-ный раствор хлористого натрия,
Антиген в рабочем разведении, см 3
Комплемент в рабочем разведении, см 3
Гемолитическая система, см 3
Водяная баня 20 мин при 37
Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной сывороткой или в безантигенном ряду, если исследуемая сыворотка оказалась позитивной. Рабочая доза на один интервал ниже (например, при титре гемолитической системы 0.7 см 3 , рабочая доза — 0.6 см 3 ).
7.5.5.2 Проведение исследования
Внесение компонентов и последовательность постановки реакции проводят по схеме, приведенной в таблице 4
При массовом исследовании
При исследовании в трех пробирках
пробирки с исследуемыми сыворотками (разведение)
пробирки для каждой исследуемой сыворотки (разведение)
0.85 %-ный раствор хлористого натрия
Водяная баня 30 мин при 63 °С—64 °С
0.85 %-ный раствор хлористого натрия
Антиген в рабочем раведе-нии
Комплемент в рабочем разведении
Холодильник 2—6 *С 16—18 ч и 20 мин при комнатной температуре
Гемолитическая система в рабочей дозе
Водяная баня 20 мин при 37 °С—38 ®С
3 Термины, определения и сокращения. 2
4 Условия выполнения исследований и требования безопасности. 3
5 Средства измерений, оборудование, материалы, реактивы и животные. 3
7 Методы серологической диагностики бруцеллеза. 6
8 Интерпретация результатов исследований. 21
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА Серологические методы
Animals Laboratory diagnostics of brucellosis Serological methods
Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает следующие методы серологической диагностики бруцеллеза:
— реакция агглютинации с S- и R-бруцеллезными антигенами;
— пластинчатая реакция агглютинации с антигеном, окрашенным бенгальской розовой (роз бенгал проба);
— реакция связывания комплемента;
— реакция длительного связывания комплемента на холоде;
— реакция непрямой гемагглютинации;
— реакция иммунодиффузии в геле агара с олигополисахаридным антигеном;
— реакция иммунодиффузии в геле агара с ft-бруцеллезным антигеном;
— кольцевая реакция с молоком;
Примечание — Методы применимы ко всем видам бактерий рода Brucella
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.0 004—2015 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация
ГОСТ 1625-2016 Формалин технический. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИС01042—83. ИС04788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2651-78 Натрия бихромат технический. Технические условия ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия ГОСТ 4220-75 Реактивы. Калий двухромовокислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2015 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия ГОСТ 16445-2012 Сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ 16446-2012 Комплемент сухой для реакции связывания комплемента. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025—2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия ГОСТ 25134-2013 Бруцеллин ВИЭВ Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1-83 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4—81) Посуда лабораторная стеклянная Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные
ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку
3.1 В настоящем стандарте применены термины с соответствующими определениями по ГОСТ 33675.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
— РСК — реакция связывания комплемента;
— РБП — пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном;
— РДСК — реакция длительного связывания комплемента;
— РИД— реакция иммунодиффузии;
— ЛПС — липополисахаридный антиген;
— О-ПС — олигополисахаридный антиген;
— РИГА — реакция непрямой гемагглютинации;
— КР с молоком — кольцевая реакция с молоком;
— ИФА — иммуноферментный анализ;
— ИХА — иммунохроматографический анализ;
— PKr-G — раствор коньюгата. конъюгированного с пероксидазой;
— ФСБ-Т — фосфатно-солевой буферный раствор с тайном;
— РБР-С — разводящий буферный раствор для сывороток;
— К+ — инактивированная сыворотка крови животных, содержащая специфические антитела класса G к бактериям рода Brucella (положительный контрольный образец);
— К- — инактивированная сыворотка крови животных, не содержащая специфических антител к бактериям рода Brucella (отрицательный контрольный образец).
4.1 Условия выполнения исследований
4.1.1 Общие требования к помещениям — по ГОСТ ISO 7218.
4.1.2 Требования к персоналу — по ГОСТ ISO 7218. ГОСТ ИСО/МЭК 17025.
4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности 1 , изучившие методики микробиологических работ. В зонах неблагополучных по бруцеллезу сотрудники должны быть вакцинированы против бруцеллеза.
4.2 Требования безопасности
4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с микроорганизмами — согласно ГОСТ 12.1.008
4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12 4 011.
4.2.3 Воздух рабочей зоны должен соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.005.
4.2.4 Обучение персонала безопасности труда — в соответствии с ГОСТ 12.0 004
4.2.5 Обеззараживание материала после исследований, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т. д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 2 атм (0.2) МПа и температуре (132 ± 2) °С.
При проведении исследований используют следующие средства измерений, оборудование, материалы. реактивы и животных:
— pH-метр с точностью калибровки ± 0.1 ед. pH при температуре от 20 °С до 55 в С;
— спектрофотометр с диапазоном длины волны от 198 до 1000 нм. разрешением 1 нм и точностью ± 2 нм;
— пипетки градуированные выдувные вместимостью от 1 до 10 см 3 по ГОСТ 29230;
— колбы мерные по ГОСТ 1770 исполнения 2 различной вместимости 1-го класса точности;
— центрифуга лабораторная со скоростью вращения ротора 2000—3000 об/мин;
— термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 °С до 50 «С;
— баня водяная с терморегулятором с температурой нагрева до 100 °С;
— холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0 X до 10 °С по ГОСТ 16317;
— штамп для формирования лунок в агаре;
— осветитель настольный с пределом поворота фонаря вокруг горизонтальной и вертикальной осей 0—360 и источником света — лампой В/Ватт-8/20;
— чашки биологические (Петри) с крышками ЧБН 2 по ГОСТ 25336;
— чашка и ступка фарфоровые по ГОСТ 9147;
— комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез, в который входят:
1) шприц-полуавтомат (капельница) для дозирования сыворотки;
2) пипетка-капельница для дозирования антигена;
3) ручной смеситель на 25 лунок диагностической пластины;
4) аппарат для автоматического покачивания диагностических пластин;
— пластины с лунками 72-гнездные полистироловые (планшеты);
— штативы 100-гнездные для пробирок Флоринского;
— групповые дозаторы Флоринского;
— пробирки серологические Флоринского.
— микропипетки вместимостью от 0.1 до 0.5 см 3 ;
— дозаторы одноканальные пипеточные переменного объема;
— наконечники для дозаторов вместимостью 0.2; 0,5; 1.0 см 3 ;
— фильтры бумажные из бумаги фильтровальной по ГОСТ 12026;
— спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962;
— формалин по ГОСТ 1625 — 1 %-ный и 10 %-ный растворы;
— кислота борная по ГОСТ 18704 — 3 %-ный раствор;
— калий двухромовокислый по ГОСТ 4220;
— сыворотка гемолитическая по ГОСТ 16445;
— комплемент сухой для РСК по ГОСТ 16446;
— свинки морские массой 300—400 г;
— набор для ИФА. содержащий в своем составе:
1) планшет полистироловый 96-луночный с адсорбированной в лунках планшета смесью специфических антигенов Brucella:
2) флакон № 1 — ФСБ-Т объемом 26 см 3 ;
3) флакон № 2 — РБР-С объемом 12 см 3 ;
4) флакон № 3 — PKr-G объемом 12 см 3 ;
5) флакон № 4 — К+ объемом 1,5 см 3 ;
6) флакон № 5 — К- объемом 2.5 см 3 ;
8) флакон № 7 — стол-реагент объемом 6 см 3 ;
— тест-система для определения антител к ЛПС антигену В abortus и 8 melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец методом ИФА. содержащая в своем составе компоненты;
1) К, — иммунохроматографические тест-полоски, нитроцеллюлозные мембраны на полимерной основе белого цвета, ламинированные защитными этикетками с обозначениями разного цвета: в нижней части — стрелки, указывающие направления погружения полоски в тестируемую пробу; в верхней части — название рода и вида возбудителя исключаемой болезни;
2) К2 — буферный раствор для разведения проб объемом 0.8 см 3 ;
— негативная сыворотка (сыворотка крови здоровых животных),
— антиген бруцеллезный для РА и РСК (РДСК);
— роз бенгал антиген для РБП;
— антиген бруцеллезный для КР с молоком;
— 0.85 %-ный раствор хлористого натрия;
— 0.85 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;
— 5 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;
— 10 %-ный раствор хлористого натрия с 0.5 % фенола;
— взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
— молоко от здоровой коровы (буйволицы);
— набор для РИД. содержащий в своем составе:
1) О-ПС бруцеллезный антиген:
3) микробиологический агар-агар по ГОСТ 17206;
— набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота, содержащий в своем составе:
1) антиген бруцеллезный эритроцитарный для РИГА;
2) взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов;
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов, дезинфицирующих средств и материалов по качеству не ниже указанных. Допускается использование посуды одноразового применения.
6.1 Забор крови у животных для получения сыворотки проводят:
— из яремной, ушной или хвостовой вены у свиней;
— головной вены, вены предплечья или латеральной подколенной вены голени у собак;
— из бедренной вены у лисиц и песцов;
— путем отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста у норок.
Кровь берут в стерильные пробирки по 5—7 см 3 (от пушных зверей — по 1—2 см 3 ). Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
6.1.1 Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при 30 °С—38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8—10 ч. сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4 °С—10 °С. Через 20—24 ч после взятия крови отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию в свежем или консервированном виде (сыворотку крови собак сливают через 3—4 ч и повторно через 10—12 ч).
6.1.2 Консервирование сывороток проводят:
— добавлением 0,05 см 3 (1 капля) 5 %-ного раствора фенола на 1 см 3 сыворотки при тщательном перемешивании;
— сухой борной кислотой (3—4 % к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка;
— путем однократного замораживания.
Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 сут со дня взятия крови при условии хранения их при температуре от 2 °С до 8 °С.
Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 сут. замороженные сыворотки — в течение 3 сут после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки к исследованию на бруцеллез не пригодны.
6.2 Для исследования молока на бруцеллез в кольцевой реакции пробу цельного свежего молока от коровы (буйволицы) берут из каждой доли вымени одного удоя в одну бактериологическую пробирку в количестве 10—15 см 3 . При этом если молоко берут перед дойкой, то первые порции молока сдаивают. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и др.) после тщательного его перемешивания. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.
6.2.1 Молоко исследуют свежее или консервированное добавлением в каждую пробу одной капли 10 %-ного раствора формалина на 5 см 3 молока. Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 2—3 сут. Перед исследованием молоко тщательно перемешивают для равномерного распределения сливок.
6.2.2 При массовом исследовании молока работу по отбору проб и постановке кольцевой реакции можно проводить непосредственно на ферме в специально отведенном помещении.
6.2.3 Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от коров (буйволиц), больных маститом или болезнями, сопровождающимися повышением температуры тела, а также молоко животных в первые две недели после родов. Молоко, имеющее повышенную кислотность (30° по Тернеру и выше), исследованию не подлежит, т. к. антиген обесцвечивается.
6.3 На направляемый в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ.
7.1 Сущность методов заключается в выявлении в сыворотке крови животных специфических антител к бруцеллезным антигенам.
7.2 Пластинчатая реакция агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)
Сущность метода заклинается в выявлении специфических антител в сыворотке крови животных, основанном на способности антител сыворотки агглютинировать бруцеллезный антиген, результатом чего является формирование выраженной агглютинации окрашенных бруцелл антигена в виде крупных или мелких хлопьев розового цвета.
7.2.2 Подготовка к исследованию
7.2.2.1 Приготовление 5 %-ного раствора хлорамина
Для приготовления 5 %-ного раствора хлорамина 5 г хлорамина растворяют в 100 см 3 водопроводной воды. Раствор используют свежеприготовленным.
Примечание — Могут применяться другие растворы дезинфицирующих средств, эффективные в отношении бактерий рода Brucella, которые готовят в соответствии с инструкциями к ним
7.22.2 Для массовых диагностических исследований используют комплект инструментов и приспособлений для серологических исследований крови животных на бруцеллез в соответствии с разделом 5.
Перед постановкой реакции роз бенгал антиген и исследуемые сыворотки выдерживают 30—40 мин при комнатной температуре и встряхивают для получения однородной смеси.
Реакцию проводят на чистых, сухих эмалированных диагностических пластинах с лунками при температуре не ниже 18 °С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки.
7.2.3 Проведение исследования
7.2.3.1 РБП применяют как экспресс-метод диагностики бруцеллеза у не иммунизированного про-тивобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, лошадей, северных оленей (маралов), свиней и собак.
Для исследования применяют тест-системы, используемые для диагностики бруцеллеза животных в РБП.
Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 см 3 (две капли) вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата. или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником.
7.2.3 2 После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают фенолизированным 0,85 %-ным раствором хлористого натрия по 7.4.2 и кончик подсушивают фильтровальной бумагой. При исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов в каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы для антигена, или микропипетки, или одноканального дозатора с наконечником вносят 0.03 ал 3 антигена (две капли), а при исследовании сывороток крови овец, коз и северных оленей (маралов), свиней и собак — 0.015 с»л 3 антигена (одну каплю). Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой активными движениями ручного смесителя до получения однородной жидкости, распределяя ее при этом по всей поверхности лунки. После смешивания сывороток во всех лунках пластинки смеситель ополаскивают 0.85 %-ным фенолизированным раствором хлористого натрия по 7 4 2 и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.
Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата, предназначенного для этой цели. При положительной реакции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.
В начале работы ставят контроль антигена с негативной и бруцеллезной сыворотками в тех же дозах, а также антигена на спонтанную агглютинацию (к 0.03 см 3 0.85 %-ного фенолизированного раствора хлористого натрия добавляют 0.03 см 3 роз бенгал антигена).
По окончании работы диагностические пластинки дезинфицируют погружением на 5 мин в 5 %-ный раствор хлорамина либо другого дезинфицирующего средства в концентрации и экспозиции, определенной для возбудителя данного вида, затем обрабатывают любым моющим средством, промывают водопроводной, затем дистиллированной водой, высушивают на воздухе или в термостате при температуре 37 °С—38 °С и используют повторно.
7.2.4 Обработка результатов
Учет результатов реакции проводят визуально в течение 4 мин после смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
Реакцию считают положительной при наличии агглютината в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета.
Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенная и равномерно окрашенная).
При не четко выраженной агглютинации проводят повторное исследование сыворотки и по его результатам дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).
При получении отрицательных результатов РБП по всему стаду его считают благополучным по бруцеллезу.
Сыворотки крови животных стада (фермы, населенного пункта), положительно реагирующие в РБП, исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК). или в РА и РИД. или в РИГА, или в ИФА, или в ИХА
7.3 Кольцевая реакция (КР) с молоком
Сущность метода состоит в выявлении антигеном специфических антител в молоке больных бруцеллезом или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами коров Положительная реакция проявляется в образовании синего кольца в верхнем слое сливок.
КР с молоком применяют с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для проверки молока при продаже его на рынках.
Исследование молока на бруцеллез в КР можно проводить в лабораториях или непосредственно в хозяйствах.
7.3.1 Подготовка к исследованию
Для постановки КР с молоком применяют тест-системы или наборы для диагностики бруцеллеза в кольцевой реакции (КР), используемые на территории государств, принявших стандарт, в состав которых входят антиген бруцеллезный для КР с молоком и сыворотка бруцеллезная Реакцию ставят в серологических пробирках Флоринского, которые нумеруют в соответствии с описью проб молока, пробы которого отбирают по 6.1.
7.3.2 Проведение исследования
В пробирки вносят по 2 см 3 молока пипеткой или дозатором. После каждой пробы пипетку двукратно промывают теплой водопроводной водой. Антиген вносят по 0.1 см 3 в каждую пробирку с пробой молока. После внесения антигена в пробирки одного ряда штатив энергично встряхивают и т. д. После внесения антигена во все пробирки штатив встряхивают дополнительно.
При исследовании каждой партии молока ставят контрольные пробы:
— молоко от заведомо здоровой коровы (буйволицы);
— смесь молока здоровой коровы (буйволицы) с бруцеллезной сывороткой (0.1 см 3 сыворотки на 2 см 3 молока).
Штативы с исследуемыми контрольными пробами молока выдерживают на водяной бане при температуре 37 *С—38 °С в течение 1 ч или в термостате в течение 2 ч.
Результаты реакции учитывают визуально через 30—40 мин после извлечения штативов из водяной бани (термостата) и оценивают в крестах по следующей схеме:
«♦♦♦» (три креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока остается белой;
(два креста) — четко выраженное синее кольцо в верхней части столбика молока в слое сливок, остальная часть молока имеет синеватый цвет;
«♦» (один крест) — синее кольцо в слое сливок выражено слабо, и весь столбик молока имеет синий цвет:
«-» (минус) — столбик молока остается равномерно окрашенным в первоначальный синий цвет, который был получен сразу после смешивания с антигеном, а слой сливок — белого или слегка желтоватого цвета.
7.3.3 Обработка результатов
Все пробы молока с оценкой в «♦++» (три креста) и е++» (два креста) считают положительными. «♦» (один крест) — сомнительными.
Группу патогенности устанавливают в соответствии с нормативными правовыми актами, действующими на территории государства, принявшего стандарт
источник