Меню Рубрики

Биоматериал для исследования на бруцеллез

Возбудители бруцеллеза (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis и Brucella canis) высоко контагиозны и работа с ними проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. Постановку серологических реакций и аллерги­ческих проб для диагностики бруцеллеза производят соответственно в обычных микробиологических лабораториях и больничных условиях.

Главным резервуаром бруцелл являются домашние сельскохозяйственные животные, а также другие виды животных, от которых человек заражается преимущественно контактным или контактно-бытовым, реже алиментарным путем. Клинические проявления бруцеллеза многообразны, поражаются лимфатическая, сосудистая, гепато-лиенальная системы и особенно опорно-двигательный аппарат Методы микробиологической диагностики бруцеллеза представлены в схеме 7.

Схема 7. Микробиологическая диагностика бруцеллеза

Материал: кровь, костный мозг, моча, испражнения, грудное молоко у кормящих женщин

Серологический метод— постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА.

Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.

Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме по­следней дозы, в которую вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглюти­нации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) — сомнительная, во 2-й (0,04 мл) — слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) — положительная, во всех пробах — рез­ко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта.

РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM,которыев отличие от IgG по­являются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании.

Аллергический метод –постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положи­тельной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая ре­акция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перене­сенного бруцеллеза, а также после прививки.

Бактериологический метод— посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюко­зы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных резуль­татах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблю­дается в течение 1 года и более.

Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО2-инкубаторе) при температуре 37 0 С до 1 ме­сяца, делая пересевы на скошенный пече­ночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестя­щих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида.

Выполняются также посевы ис­следуемого материала в желток свежего куриного яйца или в жел­точный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 37 0 С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл.

Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 — грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг-

Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии.

леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспеци­фическими сыворотками против антигеновА, М, R), чувствительности к специфическому бактери­офагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8).

Таблица 8.Дифференциация основных видов бруцелл

Признак Вид бруцелл
Br. melitensis Br. abortus Br. suis
Условия культивирования аэробные 10% СО2 аэробные
Рост на средах с красителями:
фуксином 1:50000 + +
тионином 1:25000 + +
пиронином 1:200000 + +
Образование Н2S ± ±
РА с монорецепторными сыворотками
А ± ± +
М ± ± ±
Чувствительность к бруцеллезному фагу + ±

. Обозначения: «-« — отрицательная; «+» — положительная; «±» — непостоянная реакции.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Для студента самое главное не сдать экзамен, а вовремя вспомнить про него. 9772 — | 7383 — или читать все.

193.124.117.139 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

источник

Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.

Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.

Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.

Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО2.

БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.

АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.

Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека

Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.

Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).

Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.

Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.

С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.

Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.

Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.

Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.

Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.

Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.

Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.

источник

Разнообразные клинические проявления бруцеллеза приводят к необходимости широкого использования лабораторных методов исследования: бактериологического, биологического, сероло­гического и аллергического. Комплекс лабораторных исследований с обязательным учетом клинических, эпидемиологических и эпизоотологических данных обеспечивает правильную диагностику заболевания.

Работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в строгом соответ­ствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Бактериологический метод.Для исследования на бруцеллез в лабораторию поступает патологический материал от больных людей (кровь, мокрота, гной, суставная жидкость, пунктат из селезенки, моча), сельско­хозяйственных животных (абортированный плод, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, кровь, моча, молоко, молочные продукты) и различные объекты окружающей среды (вода, навоз). Материал для исследования забирают в стерильную посуду.

Для выделения культур бруцелл всех видов используют печеночные и мясопептонные агары в различных модификациях, агар Альбими, сухие питательные среды — агар «Д» и эритрит агар. Посев материала производят на качественные, предвари­тельно проверенные питательные среды, выращивают при 37 °С в аэробных условиях и с повышенным (5-10 %) со­держанием углекислого газа.

Исследование крови необходимо проводить во время лихо­радочного состояния больного до лечения антибиотиками, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона среды Кастанеда. Начиная с четвертого дня, посевы ежедневно просматривают и, при отсутствии роста культуры, поверхность агара орошают бульоном путем осторожного покачивания фла­кона. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца роста бруцелл не обнаруживают, то делают контрольный высев из бульона среды Кастанеда на твердую питательную среду.

При обследовании людей на бруцеллез для удобства доставки флаконов с кровью можно пользоваться транс­портной жидкой средой, которую готовят заранее и хранят в лаборатории в течение полугода. Кровь доставляют в лабораторию в транспортной среде, засевают на среду Каста­неда и исследуют по общепринятой схеме.

Бруцеллы можно выделить из костного мозга, мочи, спинно­мозговой жидкости, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т. д. Исследуемый материал по 0,1 мл засевают на плас­тинки питательного агара и по 5-10 мл на жидкие питатель­ные среды. Для задержки роста посторонней микрофлоры при исследовании загрязненного материала к среде добавляют генцианвиолет (1:200 000) или антибиотики (пенициллин 0,25 ед/мл и стрептомицин 0,05 ед/мл).

Особого внимания заслуживает получение культуры из моло­ка сельскохозяйственных животных. Забор молока у овец, коров, верблюдов и коз рекомендуется проводить путем сдаивания его последних порций из каждого соска вымени по 10 мл в стерильную посуду. Если исследовать молоко в течение первых суток не удается, то его консервируют добавлением сухой борной кислоты 1 %, генцианвиолета 1:25 000. Для исследования молока из больших емкостей забирают 100 мл верхнего слоя, затем перемешивают и набира­ют еще 100 мл.

Лучшие результаты дает посев сливок, полученных центри­фугированием молока при 2,5-3 тыс. об/мин в течение 3-5 мин или путем отстаивания в течение одних суток в холо­дильнике. Сливки в количестве 0,1-0,2 мл засевают на твердую питательную среду с подавителем посторонней микрофлоры (4-6 пробирок на 1 пробу).

Бактериологический метод считается самым достоверным, т. к. выделение бруцелл является неопровержимым доказа­тельством бруцеллезной инфекции. Отрицательные результаты бактериологического исследования не дают права для заключе­ния об отсутствии заболевания.

Биологический метод.Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посто­ронней микрофлорой или содержащего малые концентрации возбудителя, в качестве биологической пробы используют морских свинок (весом 250-300 г) или белых мышей (весом 17-18 г). Исследуемый материал в объеме не более 0,5 мл вводят под­кожно в паховую область белой мыши и 1 мл морской свинке.

Вскрытие белых мышей производят через 20-25 дней, а мор­ских свинок — через 30-35 дней после введения материала. Перед вскрытием у свинок кровь из сердца исследуют в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный), кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей — лимфатические узлы (пахо­вый, аксиллярный, парааортальный, подчелюстной), кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селе­зенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг извлекают пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательную среду (агар и бульон). Лимфа­тические узлы и органы перед посевом надсекают ножницами, берут стерильной деревянной палочкой, вносят первоначально в пробирку с агаром, раздавливают и тщательно втирают мате­риал в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. Палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом. После использования ее погру­жают на 1 час в дезраствор.

Все посевы дублируют (часть помещают в условия повышен­ного содержания углекислоты), выдерживают при 37 °С до 30 дней. Для предотвращения высыхания питатель­ных сред пробирки заливают парафином или закрывают резино­выми колпачками.

Посевы просматривают каждые 3-4 дня. Из помутневших бульонов делают высев в пробирки со скошенным агаром. Коло­нии бруцелл на пластинчатом агаре становятся видимыми на 5-7 сутки, иногда позднее. По истечении 30 дней наблюдение прекращают. Если за это время рост не появился, посевы уничто­жают, а результаты бактериологического исследования считают отрицательными.

Результат оценивают положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл. Идентификацию возбудителя бруцеллеза проводят по: по характеру роста культуры на плотных питательных средах; морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, Козловскому; агглютинации со специфической бруцеллезной сывороткой на стекле и объемным методом; свечению на 3-4+ культур, обработанных бруцеллез­ной люминесцирующей сывороткой.

Культуры предварительно проверяют на наличие признаков диссоциации, одним из перечисленных выше методов.

Дифференциации (определение видов и биоваров) подлежат культуры в S-форме после идентификации.

Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета номенклатуры бактерий и Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу в 1972 г. были определены единые тесты для проведения идентификации и дифференциации бруцелл для всех стран мира.

О видовой принадлежности культуры бруцелл и биоварах судят на основании результатов комплексного изучения отноше­ния выделенных культур к условиям выращивания (при повышенном содержании углекислоты или в обычных аэроб­ных условиях), чувствительности к анилиновым краскам (бактериостатическим методом), способности образовывать серо­водород, чувствительности к бруцеллезному фагу «Тb», окислительно-метаболических тестов, агглютинабельных свойств культур с использованием монорецепторных сывороток (антиабортус и антимелитензис) и дополнительного исследования уреазной активности, вирулентности и других признаков. Дифференциацию бруцелл на виды и биовары про­водят в параллельных опытах испытуемых штаммов с рефе­рентными всех трех видов бруцелл.

Серологические и аллергические методы исследования на бруцеллез.Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.

В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.

При проведении эпидемиологического исследования в очагах применяют реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и объемную (Райта), реакцию Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилакти­ческой вакцинацией населения можно ограничиться постанов­кой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза ставят реакцию Хеддльсона, Райта и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса.

При диагностике хронического бруцеллеза и проведении диспансерного наблюдения за переболевшими рекомендуют наряду с реакциями Хеддльсона, Райта, РПГА, использовать реакцию Кумбса и аллергическую пробу (Бюрне).

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменить друг друга. Это обусловливает необходимость применения комплексного серологического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

Читайте также:  Как передается бруцеллез от коровы к человеку

В ранние сроки от начала заболевания (первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического. Серологические реакции в этот период оказы­ваются положительными почти в 95 % случаев. По мере удлине­ния срока заболевания процент положительных серологических реакций начинает снижаться. При проведении обследования необходимо учитывать, что высокие титры антител всегда указывают на наличие инфекции, антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключает возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется про­водить повторные исследования с интервалом 1-2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Для постановки диагноза бруцеллеза у крупного рогатого скота применяют серологические и аллергические методы. Обследование начинают с постановки роз-бенгал пробы (РБП). Сыворотки, с которыми получена положительная РПБ, исследуют в РА Райта, РСК (РДСК), РПГА для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих анти­тел. Исследование проводят двукратно с промежутком в 30 дней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник

Определить это заболевание – непростая задача. Очень часто при вяло протекающих симптомах врачи могут спутать бруцеллез с раком, лейкозом, различными инфекциями. Большое значение имеют эпидемиологический анамнез и клиническая картина.

Анализ на обнаружение бруцеллеза.

Когда человек сталкивается с домашним рогатым скотом, то возникает большая вероятность заболевания бруцеллезом.

Основываясь на симптомах, нельзя с точностью подтвердить правдивость диагноза. Для того чтобы наверняка удостовериться в диагнозе, используются аллергологический, бактериологический и серологический анализы. Также актуальны стандартные анализы на бруцеллез, с использованием крови, мочи, пункции лимфатических узлов, суставной жидкости.

Бактериальное исследование имеет значительную отрицательную сторону – очень медленный рост бруцелл на питательных средах. Колонии вызревают лишь через 20–30 дней, что осложняет и замедляет диагностирование бруцеллеза. Такой анализ делать очень долго, поэтому сейчас актуально использовать серологические методы.

Для того чтобы убедиться, что у вас бруцеллез, необходимо провести следующие анализы. Важную информацию дает анализ крови на бруцеллез. Ее можно сдать практически в любом медицинском учреждении.

Биохимический анализ крови.

Сначала делают стандартный набор исследований:

  1. Общий анализ крови. В ней нужно определить содержание лейкоцитов. Если показатель повышен, это означает, что в организме присутствует воспалительный процесс. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) ускоряется, но не намного. Запущенная стадия заболевания приводит к понижению показателей всех элементов крови.
  2. Общий анализ мочи. Здесь необходимо определить, присутствует ли белок в моче, и в каких количествах. Для этого следует повторять такой анализ мочи несколько раз.
  3. Биохимический анализ крови. Здесь анализируют уровни печеночного цитолиза (АлАТ, АсАТ), если эти показатели становятся выше нормы, то это говорит о гипербилирубинемии, снижается уровень альбуминов (гипоальбуминемия), при этом общий белок остается на нормальном уровне.

Чтобы определить возбудителя заболевания, применяют следующие методы.

Он дает практически 100% достоверный результат.

Однако этот метод отличается сложностью и длительностью. В качестве биологического материала используются кровь, моча, спинномозговая, внутрисуставная жидкость, желчь, а также проба из лимфатических узлов. Эти жидкости засевают на питательные среды и ждут роста микроорганизмов. Длительность этого метода составляет чуть меньше месяца, а порой и целый месяц, все зависит от роста колониальных бруцелл.

Это самый популярный анализ для определения бруцеллеза. Результаты можно узнать уже через неделю. Принцип заключается в нахождении иммуноглобулинов (антител) в сыворотке к бруцеллезным антигенам. По их классу можно определить продолжительность и скорость процесса. Для определения используют реакции Райта и Хеддельсона.

Бруцеллы убивают при помощи нагревания, и эта взвесь реагирует с сывороткой крови пациента. Если в процессе реакции бруцеллы склеиваются в маленькие шарики и оседают – это означает, что в сыворотке содержатся антитела и, значит, человек действительно болеет бруцеллезом. При отрицательной реакции заболевание не диагностируется. Этот метод хорош тем, что уже на ранних стадиях заболевания он может дать положительный результат. При помощи такой реакции находят бруцеллез не только у человека, но и у животных.

Она не дает такого достоверного результата. Здесь агглютинация делается на стекле. Часто эта реакция дает ложный результат.

Его проводят для обнаружения антител, которые атакуют эритроциты.

Для обнаружения бруцеллеза используется прямая реакция. Эта реакция различает антитела, которые напрямую связаны с эритроцитами. Если антиглобулиновый тест показывает отрицательный результат, значит, кровь чистая, и антител нет. Положительный результат означает появление антител, которые активно борются с эритроцитами.

ПЦР-диагностика основывается на обнаружении ДНК-цепей бруцелл из биологического материла пациента. Для этого материал обеззараживают, добавляя метиолят натрия в концентрации 0,01% с дальнейшим прогреванием в течение получаса. Когда завершится инкубирование в лизирующем растворе, который содержит все необходимые реагенты для экстракции ДНК при поддержании температуры 66 °С на протяжении 10–15 минут, биологическая ткань обезвреживается.

ПЦР-диагностика на обнаружении ДНК-цепей бруцелл.

Этот анализ особенно приемлем в том плане, что можно использовать абсолютно любую биологическую ткань пациента.

К одним из популярных методов относится реакция Бюрне. Она основана на введении внутрикожно бруцеллина. Если есть бруцеллез, то на месте укола начинается покраснение и небольшая пастозность. Именно этот участок и оценивается как аллергологическая проба Бюрне. Пятно измеряют и делают заключение: если пятно превышает 6 сантиметров, то реакция считается положительной.

Такая проба действительна, когда бруцеллез в хронической форме. Также необходимо учитывать и тот факт, что положительная реакция может возникнуть у людей, которые проходили вакцинирование по профилактике бруцеллеза.

источник

Выявление ДНК возбудителя бруцеллеза (микроорганизмов рода Род Brucella: Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella ovis, Brucella canis методом ПЦР в реальном времени.

Чувствительность набора: до 103 мл геном эквивалентов вируса на 1 мл пробы.

Материал для исследовнаия: Материал НЕ требующий оформления пробоподготовки: — сперма, — молоко от абортировавших животных — содержимое бурс и гигром — выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта Материал требующий оформления дополнительной пробоподготовки. — Абортированный плод целиком или пат материал от него (содержимое брюшной полости и желудка, околоплодная жидкость или слизь между оболочками и плодом), парензиматозные органы (селезенка, печень, сердце, почки)). — плацента и плодовые оболочки от абортировавших животных; — в случае диагностического убоя животных для исследования отбирают парные лимфатические узлы (не менее 7 пар) подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые и кусочки паренхиматозных органов (печень, селезенка); — от самцов с признаками орхита или эпидидимита отбирают семенники с придатками. Для пат органов и абортированных плодов необходимо дополнительная утилизация отходов по весу на момент поступления в лабораторию Правила отбора проб для исследования: 1) Лимфоузлы берут целиком. 2) Жидкости для исследования, кроме молока, отбирают в объеме 5 — 10 мл в стерильные контейнеры. 3) Из органов и тканей вырезают кусочки не более 5 х 5 х 5 см, каждый орган помещается в отдельный герметичный пакет, подписывается. Органы, расфасованные в пакеты, от одного животного складываются в общий пакет и маркируются идентификатором животного. Доставляются в лабораторию в течение 2-х часов после отбора. При не возможности соблюсти данное требование, отобранный пат материал замораживается и через 1 сутки в замороженном виде доставляется в лабораторию, размораживание при транспортировке не допускается. 4) Взятие содержимого гигром, бурс. В области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы (бурсы) и переносят его в стерильную пробирку с плотной пробкой. 5) Молоко. Перед взятием проб молока у коров вымя обмывают теплой водой, соски обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в количестве 10 — 15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.У собак при взятии проб молока соски обмывают теплой водой и обрабатывают 70%-ным спиртом. Для исследования из каждого соска сцеживают около 0,5-1 мл молока в стерильнуюпробирку с крышкой без консервантов, без активаторов свертывания. У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70%-ным спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с крышкой без консервантов, без активаторов свертывания. Молоко должно быть доставлено в лабораторию в день взятия пробы. 6) Абортированные плоды весом до 1 кг берется целиком. Плод помещается в отдельный чистый пакет, маркируется. Если вес плода более 1 кг, то необходимо провести вскрытие плода и взятие органов для исследования. Хранение: в холодильнике не более 2 -х суток при температуре +2-+8⁰С более длительное хранение при температуре не выше -16⁰С, кроме крови. Молоко должно быть доставлено в лабораторию в день взятия пробы.

источник

Бруцелла, ДНК Brucella spp., качественный — определение ДНК Brucella species в крови, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией в режиме «реального времени».

Метод ПЦР позволяет идентифицировать в биологическом материале искомый участок генетического материала и обнаружить единичные молекулы ДНК микроорганизма, не выявляемые другими методами. Принцип метода основан на многократном увеличении числа копий, специфичных для данного возбудителя участка ДНК.

С помощью ПЦР-анализа можно диагностировать инфекцию в остром периоде и выявлять случаи носительства.

Brucella spp — это грамотрицательные аэробные коккобациллы, которые являются внутриклеточными паразитами человека и животных и вызывающие бруцеллёз.

Бруцеллёз — зоонозная инфекция, передающаяся от больных животных человеку, при которой поражаются практически все органы. Он характеризуется длительным течением, тяжелыми поражениями костно-суставного аппарата, сердечно-сосудистой и нервной систем. Передаётся человеку через мясо-молочные продукты и при непосредственном контакте с инфицированными тканями животных.

Диагностика бруцеллёза — достаточно сложная задача. Заболевание не имеет каких-либо специфических признаков, а также может протекать в бессимптомной, хронической и локализованной форме. Поэтому диагностика основана на лабораторном выявлении микроорганизма.

Около 20–40 % случаев бруцеллёза — это локализованные формы заболевания, характеризующиеся изолированным поражением какого-либо органа (наиболее часто это орган мочеполовой, нервной системы, сердца) а также поражением суставов. Как правило, локализованный бруцеллёз — это последствие нераспознанной ранее остросептической формы.

Благодаря высокой специфичности положительный результат исследования с помощью ПЦР у пациента с признаками заболевания позволяет подтвердить диагноз. С другой стороны, случайно выявленный положительный результат у пациента без каких-либо жалоб и симптомов требует дальнейшего, более полного клинического и лабораторного обследования.

Показания:

  • при симптомах бруцеллёза (остросептической формы): высокой лихорадке с температурой 39–40°С и выше (особенно при колебаниях температуры), ознобе, потливости, слабости, миалгии, артралгии или артрите;
  • при обследовании пациента с изолированным поражением мочеполовой системы и суставов при наличии в анамнезе указаний на употребление сырого козьего молока, особенно в эндемичных по бруцеллёзу районах, и профессиональных особенностей (как у ветеринаров, работников молочной и мясной промышленности);
  • при подозрении на бруцеллёз у новорождённого.

Подготовка
Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи.

Накануне сдачи исследования нужно исключить физические и психоэмоциональные нагрузки.

Забор крови производится в соответствующую пробирку строго до метки.

Интерпретация результатов
Единицы измерения: результат выдаётся в терминах «обнаружено» или «не обнаружено».

Референсные значения: не обнаружено.

Причины положительного результата:

  • бруцеллёз;
  • туберкулёз с поражением костно-суставной системы.

Причины отрицательного результата:

  • отсутствие бруцеллёза;
  • неправильное взятие биоматериала на исследование.

Что может влиять на результат?

Туберкулёз костно-суставной системы может приводить к ложноположительному результату.
Применение доксициклина, рифампицина, ципрофлоксацина и других фторхинолонов способствует ложноотрицательному результату.

источник

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Метод исследования: РА, реакция агглютинации.

Бруцеллез – острое инфекционно-аллергическое, зоонозное заболевание. Возбудитель бруцеллеза относится к роду Brucella. Род Brucella состоит из 9 самостоятельных видов, вызывающих заболевание у животных и людей. Заболевания людей преимущественно вызывают B. melitensis, B. abortus и B. suis биовары 1-4, реже B. сanis, B. сeti и B. рinnipedialis. Основные источники инфекции — овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи. Факторы передачи — сырье животного происхождения (шерсть, пух, шкуры), мясомолочные продукты. Болезнь начинается, как правило, с острой лихорадки с неспецифическими гриппоподобными проявлениями, склонна к хронизации и появлению осложнений в виде артритов, спондилитов, эндокардитов, менингитов, нейропатии, васкулитов, нефритов, лимфоаденопатии.

Референсные значения (вариант нормы):

Артикул Наименование услуг Цена, руб. Доступность экспресс Ед. измер. Материалы Заказать
003 Бруцеллез (ПЦР) 800 p (Время исполнения до 72 часов) 1 исслед. J N V E C C
Параметр Результат Референсные значения
Anti-Brucella species,РА (антитела к возбудителям бруцеллёза), качественное Обнаружено Не обнаружено

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

» [«serv_cost»]=> string(3) «560» [«cito_price»]=> NULL [«parent»]=> string(2) «25» [10]=> string(1) «1» [«limit»]=> NULL [«bmats»]=> array(1) array(3) string(1) «N» [«own_bmat»]=> string(2) «12» [«name»]=> string(31) «Кровь (сыворотка)» > > >

Биоматериал и доступные способы взятия:
Тип В офисе
Кровь (сыворотка)
Подготовка к исследованию:

Не менее 3 часов после последнего приема пищи. Можно пить воду без газа.

Метод исследования: РА, реакция агглютинации.

Бруцеллез – острое инфекционно-аллергическое, зоонозное заболевание. Возбудитель бруцеллеза относится к роду Brucella. Род Brucella состоит из 9 самостоятельных видов, вызывающих заболевание у животных и людей. Заболевания людей преимущественно вызывают B. melitensis, B. abortus и B. suis биовары 1-4, реже B. сanis, B. сeti и B. рinnipedialis. Основные источники инфекции — овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи. Факторы передачи — сырье животного происхождения (шерсть, пух, шкуры), мясомолочные продукты. Болезнь начинается, как правило, с острой лихорадки с неспецифическими гриппоподобными проявлениями, склонна к хронизации и появлению осложнений в виде артритов, спондилитов, эндокардитов, менингитов, нейропатии, васкулитов, нефритов, лимфоаденопатии.

Референсные значения (вариант нормы):

Параметр Результат Референсные значения
Anti-Brucella species,РА (антитела к возбудителям бруцеллёза), качественное Обнаружено Не обнаружено

Обращаем Ваше внимание на то, что интерпретация результатов исследований, установление диагноза, а также назначение лечения, в соответствии с Федеральным законом № 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21 ноября 2011 года, должны производиться врачом соответствующей специализации.

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

Copyright ФБУН Центральный НИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, 1998 — 2019

Центральный офис: 111123, Россия, Москва, ул. Новогиреевская, д.3а, метро «Шоссе Энтузиастов», «Перово»
+7 (495) 788-000-1, info@cmd-online.ru

! Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, пользовательских данных (сведения о местоположении; тип и версия ОС; тип и версия Браузера; тип устройства и разрешение его экрана; источник откуда пришел на сайт пользователь; с какого сайта или по какой рекламе; язык ОС и Браузера; какие страницы открывает и на какие кнопки нажимает пользователь; ip-адрес) в целях функционирования сайта, проведения ретаргетинга и проведения статистических исследований и обзоров. Если вы не хотите, чтобы ваши данные обрабатывались, покиньте сайт.

источник

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА

Animals. Laboratory Diagnostics of Brucellosis. Bacteriological methods

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. N 82-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97

Сокращенное наименование национального органа по стандартизации

Минэкономики Республики Армения

Госстандарт Республики Беларусь

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 24 ноября 2015 г. N 1949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33675-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

Настоящий стандарт распространяется на все виды млекопитающих животных и устанавливает бактериологические методы лабораторной диагностики бруцеллеза.

Примечания

1 Данные методы применимы ко всем представителям рода Brucella .

2 Бактерии рода Brucella относятся ко II группе патогенности.

Настоящий стандарт также устанавливает общие требования к проведению молекулярно-генетических методов диагностики бруцеллеза (ПЦР).

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 3-88 Перчатки хирургические резиновые. Технические условия

ГОСТ 12.0.004-90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения

ГОСТ 12.1.008-76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.4.011-89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 975-88 Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия

ГОСТ 2222-95 Метанол технический. Технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4159-79 Йод кристаллический. Технические условия

ГОСТ 4232-74 Калий йодистый. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 4919.1-77 Реактивы и особо чистые вещества. Методы приготовления растворов индикаторов

ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

ГОСТ 6259-75 Реактивы. Глицерин. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7864-2011 Иглы инъекционные однократного применения стерильные

ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования

ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13739-78 Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 13805-76 Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16280-2002 Агар пищевой. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 17206-96 Агар микробиологический. Технические условия

ГОСТ 18704-78 Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 21241-89 Пинцеты медицинские. Общие технические условия

ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 22280-76 Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия

ГОСТ 23519-93 Фенол синтетический технический. Технические условия

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29230-91 (ИСО 835-4-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 4. Пипетки выдувные

ГОСТ 32275-2013 Перчатки медицинские анатомические одноразовые. Технические требования

Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1.2 антиген бруцеллезный: Поверхностные или цитоплазматические полисахаридно-белковые структуры бруцелл, на которые животными вырабатываются специфические антитела.

3.1.3 реакция агглютинации: Метод выявления специфических агглютинирующих антител в сыворотке крови животных.

3.1.4 биовар: Внутривидовая систематическая категория для обозначения штамма или совокупности штаммов бактерий со сходными ферментативными или антигенными свойствами, отличающимися от других вариантов этого вида.

3.1.5 антитела бруцеллезные (иммуноглобулины, ИГ, lg ): Особый класс гликопротеинов в сыворотке крови и тканевой жидкости животных в виде растворимых молекул, присутствующих на поверхности В-лимфоцитов в виде мембраносвязанных рецепторов и обладающих способностью избирательно связываться с антигенами конкретных бруцелл, обусловленной предварительным взаимодействием иммунной системы организма с возбудителем.

3.1.6 полимеразная цепная реакция (ПЦР): Молекулярно-генетический метод увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

3.1.7 стандарт мутности: Взвесь частиц стекла Pyrex в запаянной стеклянной пробирке, соответствующая 10 (5) международным единицам мутности.

Примечание — Стандарт мутности используют для визуального определения оптической концентрации бактериальных взвесей.

3.1.8 сыворотки монорецепторные A и M : Антивидовые бруцеллезные сыворотки крови кроликов к рецепторам культур Brucella abortus и Brucella melitensis .

Примечание — Монорецепторные сыворотки A и M используют для дифференциации культур бруцелл в пробирочной реакции агглютинации.

3.1.9 сыворотка S-бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая S -бруцеллезные антитела.

Примечание — S -бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

3.1.10 сыворотка R -бруцеллезная: Сыворотка крови кроликов, содержащая R -бруцеллезные антитела.

Примечание — R -бруцеллезную сыворотку используют для идентификации культур бруцелл в пластинчатой реакции агглютинации.

3.1.11 бактериофаг: Ультрамикроскопический внутриклеточный вирус бактерии, заражающий бактериальную клетку, размножающийся в ней и часто вызывающий ее лизис.

3.1.12 корпускула бактериофага: Частица бактериофага, имеющая форму сперматозоида, состоящая из белковой оболочки и внутриклеточного содержимого, представляющего собой фибриллы дезоксирибонуклеиновой кислоты.

3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:

МППГГА — мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар;

МППГГБ — мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый бульон;

МППБ — мясо-пептонный печеночный бульон;

РА — реакция агглютинации;

ПЦР — полимеразная цепная реакция.

4.1 Условия выполнения исследований

4.1.1 Требования к лабораториям, проводящим работы по диагностике бруцеллеза, регламентируются нормативными и правовыми актами государства, принявшего стандарт.

4.1.2 Требования к персоналу — по ГОСТ ИСО/МЭК 17025.

4.1.3 К проведению исследований допускаются квалифицированные сотрудники, вакцинированные против бруцеллеза вакцинами, зарегистрированными на территории государства, принявшего стандарт, имеющие опыт работы с микроорганизмами II группы патогенности и владеющие методами бактериологических исследований.

4.2 Требования безопасности

4.2.1 Общие требования безопасности при проведении работ с биологическими объектами должны отвечать положениям ГОСТ 12.1.008.

4.2.2 Средства защиты работающих должны соответствовать требованиям ГОСТ 12.4.011.

4.2.3 Обучение персонала безопасности труда в соответствии с ГОСТ 12.0.004.

4.2.4. Обеззараживание биологического материала, а также использованных индивидуальных средств защиты, инструментов и т.д. проводят путем кипячения в течение 30 мин или автоклавирования в течение 1 ч при давлении 0,20 МПа и температуре (132±2)°С.

CO -инкубатор или эксикатор стеклянный (микроанаэростат) с содержанием углекислого газа от 10% до 15%.

Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20°С до 50°С.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от 0°С до 10°С по ГОСТ 16317.

Баня водяная с терморегулятором.

5.2 Питательные среды и реактивы

Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16280.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Акрифлавин.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Глицерин по ГОСТ 6259.

Глюкоза по ГОСТ 975.

Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Кислота борная по ГОСТ 9656 или ГОСТ 18704.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Кристаллический фиолетовый (генцианвиолет) по ГОСТ 4919.1.

Малахитовый зеленый по ГОСТ 4919.1.

Метанол технический по ГОСТ 2222.

Метиленовый синий по ГОСТ 4919.1.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.

Раствор антисептический.

Раствор натрия хлорида 0,9%-ный изотонический (физиологический раствор).

Физиологический раствор фенолизированный 0,5%-ный.

Сафранин, 2%-ный водный раствор по ГОСТ 4919.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Стандарт мутности оптический, эквивалентный 10 международным единицам.

Тиаминобромид.

Тионин.

Фенол по ГОСТ 23519.

Фуксин основной.

5.3 Посуда

Пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см по ГОСТ 29230.

Пипетки Мора вместимостью 100 см .

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пробирки серологические Флоринского по ГОСТ 25336.

Пипетки пастеровские.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

Чашки бактериологические одноразового использования или стеклянные по ГОСТ 25336.

5.5 Допускается применение других средств измерений и посуды с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше.

5.6 Допускается применение готовых питательных сред, а также других сред, приготовленных по прописи производителя, предназначенных для культивирования бруцелл с проверенными ростовыми свойствами.

5.7 Допускается применение готовых растворов генциан фиолетового, Люголя, фуксина Циля, малахитового зеленого и 5%-ной спиртовой настойки йода.

5.8 Допускается использовать другие селективные добавки, обладающие аналогичным действием, указанным в 5.4.

5.9 Допускается использовать посуду одноразового применения.

6.1.1 Материал для диагностики бруцеллеза отбирают от каждого животного в отдельности.

6.1.2 При взятии проб необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды в соответствии с требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

6.1.3 Пробы направляют в лабораторию и исследуют в день отбора или на следующий день.

6.2 Отбор проб патологического материала

6.2.1 Для бактериологического и молекулярно-генетического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от многоплодных животных берут не менее трех плодов). От плодов крупных животных направляют селезенку, печень, желудок с содержимым, перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

6.2.2 Если в течение 24-30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в четыре-пять раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

6.2.3 От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для молекулярно-генетического исследования на бруцеллез.

6.3 Отбор проб для прижизненной диагностики бруцеллеза

6.3.1 Общие требования

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут:

— кровь;

— молоко;

— содержимое гигром, бурс и абсцессов.

При диагностическом убое дополнительно берут:

— селезенку;

— печень;

— лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, предлопаточные, надколенные, подколенные, надвыменные, парааортальные, тазовые;

— семенники.

6.3.2.2 Приготовление сыворотки

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при температуре 30°С-38°С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8-10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают в холодильнике при температуре 4°С-10°С. Через 20-24 ч полученные сыворотки сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию.

6.3.2.3 Пробы крови от животных для бактериологического исследования берут стерильными шприцами в объеме 18-20 см , в которые предварительно набирают антикоагулянтное средство (глюгицир или аналогичное). Сразу после взятия крови иглы, не отсоединяя от шприцев, закрывают колпачками и перемешивают содержимое, переворачивая шприцы. Перед посевом использованные иглы заменяют стерильными.

6.3.5 Упаковка и маркировка проб

6.3.5.1 Отобранные в стерильные пробирки пробы крови и молока помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

Пробы патологического материала упаковывают в пергаментную бумагу, маркируют и помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

6.3.5.2 Пробы маркируют с указанием:

— наименования хозяйства;

— вида, пола и возраста животного;

— инвентарного номера животного;

— наименования пробы;

— цели и вида исследования.

7.1 Сущность метода

Сущность бактериоскопического метода заключается в окрашивании мазков и мазков-отпечатков из патологического материала и последующем микроскопическом выявлении клеток бруцелл.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка растворов для окраски

7.2.1.1 Приготовление кристаллического фиолетового и генцианового фиолетового

Берут 1 г кристаллического фиолетового или генцианового фиолетового и растирают в ступке с 2 г фенола, добавляя небольшими порциями 96%-ный этиловый спирт в объеме 10 см . После полного растворения краски в ступку при постоянном помешивании добавляют 100 см дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см .

Срок хранения растворов при температуре от 2°С до 10°С — не более 6 мес.

7.2.1.2 Приготовление раствора Люголя

Для приготовления раствора Люголя в 10 см дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают в течение 5-6 ч до полного растворения йода и добавляют 290 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2°С до 10°С в склянке из темного стекла — не более 30 сут.

7.2.1.3 Приготовление карболового фуксина Циля

Для приготовления карболового фуксина Циля 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллического фенола и 0,5 см глицерина, добавляя небольшими порциями 96%-ный этиловый спирт в объеме 10 см , а затем при постоянном помешивании в ступку добавляют 100 см дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см .

Срок хранения раствора при температуре 18°С-22°С во флаконах из темного стекла с притертой пробкой — не более 6 мес.

Непосредственно перед работой к одной части полученного раствора карболового фуксина Циля добавляют девять частей дистиллированной воды.

7.2.1.5 Приготовление 0,5%-ного раствора уксусной кислоты

Берут 0,5 см уксусной кислоты и добавляют 99,5 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2°С до 8°С — не более 1 мес.

7.2.1.8 Приготовление 5%-ного спиртового раствора йода

Берут 5 г кристаллического йода и переносят в мерную колбу вместимостью 250 см , добавляют 10 г калия иодида и равные объемы дистиллированной воды и 96%-ного этилового спирта, доводя раствор до объема 100 см .

Срок хранения раствора при температуре не выше от 2°С до 25°С в склянке из темного стекла — не более пяти лет.

7.2.1.9 Приготовление 3%-ного спиртового раствора гидроокиси калия

Берут 3 г гидроокиси калия, растворяют в 5 см дистиллированной воды и в мерной колбе вместимостью 200 см доводят объем раствора 96%-ным этиловым спиртом до 100 см . Декантируют прозрачный раствор.

Срок хранения раствора при температуре не выше 25°С не более одного года.

7.2.2.1 Из проб патологического материала по 6.2 делают по два мазка. При исследовании абортированных плодов готовят мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (печени, селезенки), котиледонов плодовых оболочек и другого плотного материала, а жидкий материал (содержимое желудка, жидкости брюшной и грудной полостей, околоплодную жидкость) наносят на предметные стекла пастеровской пипеткой.

7.3 Проведение исследования

7.3.1 Окрашивание по Граму

Для окраски мазков по Граму на фиксированный мазок по 7.2.2 кладут кусочек фильтровальной бумаги, наносят кристаллический фиолетовый или генциан фиолетовый и выдерживают в течение 2 мин, после чего снимают бумагу, сливают краску, промывают дистиллированной водой и наносят на мазок раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1-2 мин раствор сливают и наносят 96%-ный этиловый спирт на 0,5-1,0 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают разведенным в соотношении 1:10 фуксином Циля в течение 1-2 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

Если после нанесения раствора Люголя мазок не чернеет, то необходимо приготовить новый раствор.

7.3.2 Окрашивание по Козловскому

Для окраски по Козловскому фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина с подогреванием на водяной бане до появления пузырьков. Мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают 0,75%-ным или 1%-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 0,5-1,0 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.3 Окрашивание по Стампу

Для окраски по Стампу фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают в течение 10 мин карболовым фуксином Циля, разведенным по 7.2.1.3 в соотношении 1:10. Мазок промывают дистиллированной водой, а затем 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают 1%-ным раствором метиленового синего в течение 20-30 с. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.4 Полученные по 7.3.1-7.3.3 мазки микроскопируют под иммерсионным маслом.

7.4 Обработка результатов

При микроскопии окрашенных мазков, содержащих бруцеллы, должны наблюдаться мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии, окрашенные в красный цвет.

8.1 Сущность метода

Сущность культурального метода заключается в посеве патологического материала на питательные среды с последующим культивированием, идентификацией и дифференциацией выделенной культуры.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 дм водопроводной воды и выдерживают в течение 15-18 ч в прохладном месте. Затем сливают полученный настой в колбу вместимостью 2 дм или кастрюлю из нержавеющей стали вместимостью 3 дм и кипятят в течение 30-40 мин на электрической или газовой плите, доливают дистиллированную воду до объема 1 дм и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную мясную воду стерилизуют в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 мин.

Срок хранения мясной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5-15 дм при температуре от 2°С до 25°С — не более одного года.

8.2.2 Приготовление печеночной воды

Для приготовления печеночной воды свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм вносят 500 г фарша, заливают 1 дм водопроводной воды, настаивают в течение 1 ч и кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин. После отстаивания фарш удаляют, а полученную жидкость доводят до 1 дм дистиллированной водой и фильтруют через ватно-марлевый фильтр или тканевый фильтр. Полученную печеночную воду разливают по колбам и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин.

Срок хранения печеночной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5-15 дм при температуре от 2°С до 25°С — не более одного года.

8.2.3 Приготовление МППГГБ

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм наливают 610 см мясной воды по 8.2.1 и 305 см печеночной воды по 8.2.2, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 20-30 г пищевого или микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 30 мин, устанавливают рН 7,2-7,4 10%-ным раствором натрия гидроокиси, добавляют 10 г глюкозы и 20 см глицерина и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки по 7-8 см или во флаконы по 250-300 см соответствующей вместимости и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин. рН среды после стерилизации составляет 6,8-7,0.

Срок хранения МППГГБ в пробирках и флаконах при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

8.2.4 Приготовление МППГГА

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм наливают 610 см мясной воды по 8.2.1 и 305 см печеночной воды по 8.2.2, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 20-30 г микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 1 ч, устанавливают рН 7,2-7,4 10%-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют 10 г глюкозы и 20 см глицерина и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки или флаконы вместимостью 500 см и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин. рН среды после стерилизации составляет 6,8-7,0.

Срок хранения МППГГА в пробирках и флаконах при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

8.2.5 Приготовление МППБ

МППБ готовят аналогично МППГГА по 8.2.3 без добавления агара, глюкозы и глицерина.

Срок хранения МППБ при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

8.2.6 Приготовление сывороточно-декстрозного агара

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм наливают 835 см дистиллированной воды, добавляют 20 г пищевого или микробиологического агара, 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 165 см мясной воды по 8.2.1. Полученную смесь кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин до расплавления агара, рН до стерилизации — 7,8. Затем стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 ч, затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят рН среды до 7,2-7,4 10%-ным раствором гидроокиси натрия, разливают в колбы (пробирки, флаконы) и стерилизуют при температуре 115°С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин. После стерилизации рН среды составляет 6,8 -7,0.

Срок хранения сывороточно-декстрозного агара при температуре от 2°С до 8°С — не более 3 мес.

Перед применением среду в колбах (пробирках, флаконах) расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до температуры 50°С-60°С и добавляют 40%-ный стерильный раствор глюкозы в количестве 1% к объему питательной среды во флаконе (например, 2,5 см 40%-ного стерильного раствора глюкозы добавляют к 97,5 см питательной среды).

8.2.7 Приготовление селективной добавки для внесения в питательные среды

Содержимое флакона по 5.4 растворяют в 5 см 50%-ного метилового спирта и перемешивают до образования гомогенной суспензии.

Раствор используют свежеприготовленным.

Полученное количество селективной добавки стерильно добавляют к 500 см расплавленной питательной среды.

8.3 Проведение исследования

8.3.1 Перед посевом материала кожу абортированного плода по белой линии живота протирают тампоном, смоченным 5%-ным раствором фенола, приготовленного путем растворения 5 г кристаллического фенола в 100 см дистиллированной воды. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей пастеровскими пипетками высевают в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь переносят в объеме по 1,0-1,5 см на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в двух пробирках. Содержимое желудка в объеме по 1-2 см высевают в две пробирки с МППГББ и в пять пробирок на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6.

8.3.2 Лимфатические узлы, очищенные от жира и мышечных волокон, кусочки печени и селезенки размером 2,0 1,5 2,5 см погружают в 96%-ный этиловый спирт на 1 с и обжигают, проведя над пламенем спиртовки. После обработки от лимфоузлов стерильными ножницами отрезают кусочки размером 1-2 см. Подготовленный материал помещают в пакет для гомогенезации с фильтром, добавляют 4-5 см физиологического раствора и гомогенезируют с использованием гомогенизатора по 5.1.

Допускается приготовление суспензии путем растирания материала в стерильной фарфоровой ступке с добавлением физиологического раствора до получения однородной гомогенной суспензии.

Полученный гомогенат высевают пастеровской пипеткой по 0,1-0,2 см на поверхность предварительно подсушенных после скашивания плотных питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 в пробирках и на чашки Петри.

Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из лимфатических узлов и органов. Для этого место прокола пастеровской пипеткой предварительно прижигают шпателем, нагретым над пламенем спиртовки. Из каждого объекта проводят посев в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь в объеме по 1,0-1,5 см переносят на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в две пробирки.

8.3.3 Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем в десять пробирок на среды по 8.2.4-8.2.6.

8.3.4 При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

8.3.6 Содержимое бурс, гигром и абсцессов высевают на три-четыре чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6, содержащей бактериостатические красители. Во всех случаях вместо бактериостатических красителей допускается применение селективных добавок.

8.3.8 Для выделения культуры бруцелл, в том числе и Brucella canis , кровь от животных с антикоагулянтом вносят по 10-18 см во флаконы, содержащие по 100 см МППГГБ, и по 0,3-0,5 см в чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. Посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды. Через 25-30 мин чашки Петри помещают в термостат при температуре 37°С-38°С агаром вверх. Туда же помещают и флаконы с посевами.

Через семь суток инкубирования из посевов во флаконах делают пересев на три пробирки с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6 и инкубируют при тех же условиях.

8.3.9 При исследовании материала от крупного рогатого скота половину пробирок и чашек Петри культивируют в термостате при температуре 37°С-38°С, другую — в CO -инкубаторе с содержанием 5%-10% углекислого газа или эксикаторе (микроанаэростате).

Примечание — Допускается культивирование в пробирках, которые плотно укупоривают резиновыми пробками и заливают парафином или обертывают ватно-марлевые пробки парафильмом.

8.3.10 Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

— внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 см 25%-ного раствора кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 см концентрированной соляной кислоты на 1 дм объема);

— сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

8.3.11 Посевы, полученные по 8.3.1-8.3.9, выдерживают в термостате при температуре 37°С-38°С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 48-72 ч. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

В последующем посевы просматривают каждые 4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

8.4.1 При просмотре посевов обращают внимание на характер роста бактерий.

8.4.2 На поверхности твердых питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью бесцветные колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем свете — сероватый. При длительном культивировании колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

8.4.3 В жидких питательных средах по 8.2.1, 8.2.3 и 8.2.5 бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над поверхностью бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

8.4.4 При обнаружении роста на жидких питательных средах и отсутствии характерного роста на твердых питательных средах из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из методов по 7.3.1-7.3.2, и делают пересев на чашки Петри с твердой питательной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках Петри культивируют так же, как и высевы из патологического материала. При отсутствии роста культуры бруцелл наблюдение за посевами прекращают по истечении 30 сут.

9.1 Пластинчатая реакция агглютинация

9.1.1 Подготовка к исследованию

9.1.1.1 Подготовка двухсуточных культур бруцелл

Для идентификации используют двухсуточные агаровые культуры (изоляты) бруцелл, выделенные из патологического материала. С этой целью выделенные культуры пересевают бактериологической петлей штрихом на поверхность плотной питательной среды по 8.2.4, 8.2.6, скошенной в пробирках. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С-38°С в течение двух суток. Выращенные культуры исследуют непосредственно после извлечения из термостата.

Примечание — Допустимый срок хранения культур при температуре от 2°С до 8°С — не более 14 сут.

9.1.1.2 Подготовка R — и S -бруцеллезных агглютинирующих сывороток

R — и S -бруцеллезные агглютинирующие сыворотки разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения. Разведенные сыворотки хранят при температуре от 2°С до 8°С и используют в течение 30 сут.

9.1.2 Проведение исследования

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R — и S -бруцеллезных сывороток по 9.1.1 и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно перемешивают в капле S -, R -бруцеллезной сыворотки и физиологического раствора. Параллельно ставят контроли: со стандартными S — и R -бруцеллезными сыворотками и гомологичными антигенами.

9.1.3 Учет и оценка результатов реакции агглютинации

При положительной РА в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

Реакцию учитывают визуально в течение 1-3 мин и оценивают в крестах:

— «++++» (четыре креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината — положительная реакция;

— «+++» (три креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

— «++» (два креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

— «+» (один крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом — сомнительная реакция;

— «-» (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная — отрицательная реакция.

Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R — и S -бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем на два креста, а с физиологическим раствором — отсутствует.

9.1.4 Обработка результатов

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными (см. раздел 8) и тинкториальными свойствами (см. раздел 7), а также дающие положительную реакцию агглютинации с S — или R -бруцеллезной сывороткой или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, считают бруцеллами.

9.2 Методы определения диссоциации культур бруцелл

9.2.1 Проба на стекле с раствором акрифлавина

На предметное стекло наносят каплю раствора акрифлавина в разведении 1:1000 в дистиллированной воде, в которой суспензируют с помощью бактериологической петли испытуемую культуру. У диссоциированных культур ( R -форма) в течение 1-2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культур бруцелл в S -форме остается гомогенной.

9.2.2 Реакция термоагглютинации

Взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с содержанием по оптическому стандарту мутности 1 млрд/см микробных клеток в объеме 4-5 см прогревают в пробирке вместимостью 20 см на водяной бане при температуре 90°С в течение 30 мин.

Результаты учитывают через 30 мин, 1 ч и через 24 ч при комнатной температуре.

При наличии диссоциации наступает выраженная агглютинация клеток бруцелл с формированием осадка, тогда как суспензия недиссоциированной культуры бруцелл в S -форме остается гомогенной.

9.2.3 Окраска колоний по Уайт-Вилсону

Двухсуточную агаровую культуру бруцелл по 9.1.1 разводят физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы она по мутности соответствовала 10 ЕД оптического стандарта мутности. Полученную суспензию в объеме 3 см смешивают с 2 см физиологического раствора и делают десятикратные разведения до 10 , используя для каждого разведения отдельную пипетку, и высевают по 0,1 см на четыре-шесть чашек Петри с МППГГА. Поверхность агара в чашках равномерно орошают посевным материалом, выдерживают на горизонтальной поверхности стола в течение 20-30 мин и инкубируют при температуре 37°С-38°С агаром вверх в течение 4-5 сут.

Окраску колоний проводят рабочим раствором кристаллического фиолетового, приготовленного по 7.2.1.1 в разведении 1:2000. В чашку Петри с изолированными колониями бруцелл пастеровской пипеткой с грушей вносят осторожно без напора рабочий раствор кристалвиолета. Через 30 с раствор краски удаляют с помощью пипетки с грушей, сливая в дезинфицирующую жидкость (3%-ный раствор фенола или 5%-ный раствор хлорамина). Колонии просматривают под бинокулярной лупой.

Колонии бруцелл в R -форме (диссоциированные) имеют равномерно окрашенный широкий периферический ободок синего или фиолетового цвета и менее интенсивно окрашенную поверхность такого же цвета, иногда с исчерченностью.

Колонии бруцелл в S -форме имеют тонкий периферический ободок, окрашенный в синий или фиолетовый цвет. Центральная часть колоний светло-желтого цвета (не окрашивается).

9.3.1.1 Подготовка к исследованию

В качестве реактива применяют насыщенный водный раствор уксуснокислого свинца (30 г свинца растворяют в 100 см дистиллированной воды), которым пропитывают полоски фильтровальной бумаги размером 1 8 см. Пропитанные полоски фильтровальной бумаги высушивают при температуре 18°С-20°С в течение 20 мин.

Срок хранения пропитанных полосок фильтровальной бумаги в банке из темного стекла с притертой пробкой — не более 2 мес.

9.3.1.2 Проведение исследования

Двухсуточную взвесь культуры бруцелл по 9.1.1 в физиологическом растворе концентрацией 2 10 /см микробных клеток по оптическому стандарту мутности на 10 ЕД засевают в пробирку бактериологической петлей на скошенную поверхность печеночного агара по 8.2.4. Полоску фильтровальной бумаги зажимают между пробиркой и ватной пробкой так, чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался поверхности питательной среды.

Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.

Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37°С-38°С на 6 сут.

9.3.1.3 Учет результатов

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего конца полоски, которое измеряют в миллиметрах.

Результаты учитывают через каждые 2 сут в течение 6 сут. При каждом учете тест-полоску заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода полученные три значения суммируют.

Суммарное значение почернения тест-полосок, свидетельствующее о продуцировании сероводорода, составляет для культур:

— B. suis (биовар 1) — 12-20 мм;

— B. abortus (биовар 1) — 5-7 мм;

— B. neotomae — 5-8 мм.

Культура B. melitensis (биовар 1), как правило, не образует сероводорода или вызывает только слабо выраженное почернение тест-полоски. Культуры B. ovis и B. canis сероводород не продуцируют.

9.3.2 Определение редуцирующей активности в отношении красок

9.3.2.1 Подготовка к исследованию

Для приготовления исходных растворов фуксина и тионина в разведении 1:1000 во флаконах вместимостью 200 см смешивают 0,1 г краски, 20 см 96%-ного этилового спирта и 80 см дистиллированной воды.

Срок хранения исходных растворов фуксина и тионина в темном месте — не более 6-10 мес.

Для приготовления питательной среды МППГГА с красками к 100 см охлажденного до температуры 50°С-60°С агара с соблюдением правил асептики добавляют 2 см исходного раствора краски для получения разведения 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20-25 см в чашки Петри и подсушивают при комнатной температуре, не открывая чашки.

Срок хранения среды с красками в холодильнике при температуре от 2°С до 8°С — не более 10-15 сут.

Обесцвеченные среды для тестирования не используют.

9.3.2.2 Проведение исследования

Взвесь бруцелл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы испытуемых культур проводят бактериологической петлей из взвеси, содержащей 2 млрд/см микробных клеток, на среду МППГГА с фуксином и тионином по 9.4.2.1 и на среду МППГГА без добавления красок (контроль). Одну петлю взвеси засевают путем нанесения пяти отдельных штрихов на поверхность агара. На одну чашку Петри можно одновременно засевать четыре-шесть культур, предварительно разделив чашку Петри на четыре-шесть секторов.

Чашки с посевами переворачивают агаром вверх и выдерживают в термостате при температуре 37°С-38°С в течение 3 сут.

9.3.2.3 Учет результатов

Учет результатов проводят через трое суток инкубации по следующей схеме:

— выраженный рост культуры во всех штрихах «++++»;

— выраженный рост в первых двух и более слабый в последующих штрихах «+++»;

— умеренно выраженный рост в первых двух штрихах и слабый или отсутствие роста в остальных штрихах «++»;

— слабый сплошной рост или отдельные колонии в первых двух штрихах «+».

9.3.3 Реакция агглютинации с монорецепторными A и M бруцеллезными сыворотками

9.3.3.1 Проведение испытания

Для проведения РА монорецепторные A и M бруцеллезные сыворотки разводят последовательно двукратно, получая соотношения 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 и 1:80 в объеме 0,5 см . В качестве антигена используют взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе в концентрации 2 млрд/см микробных клеток по оптическому стандарту мутности.

Антиген добавляют по 0,5 см во все пробирки таким образом, разведение сыворотки удваивается (1:10, 1:20 и т.д.).

Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-8 ч, а затем в течение 1 ч при комнатной температуре.

9.3.3.2 Учет результатов

Положительная РА в разведении сыворотки 1:20 с оценкой не менее чем на два креста позволяет отнести культуру бруцеллы к виду B. abortus или B. melitensis .

9.3.4 Определение чувствительности культур бруцелл к фагу Tb

Бруцеллезный фаг Tb избирательно лизирует бруцеллы вида B. abortus , находящиеся в S -форме.

9.3.4.1 Подготовка к исследованию

Для определения чувствительности бруцелл к лизису бактериофагом используют два его разведения: 1 10 корпускул/см и 1 10 корпускул/см . Разведения бактериофага готовят путем десятикратных разведений исходной культуры в физиологическом растворе.

9.3.4.2 Проведение исследования

Для исследования используют МППГГА в чашках Петри с концентрацией агара 1,5%-1,8%. Среду и взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с концентрацией 1 млрд/см микробных клеток по ОСО мутности на 10Е подсушивают при комнатной температуре в течение 18-20 ч.

Взвесь культуры бруцелл подсушивают при комнатной температуре в течение 18- 20 ч в объеме 0,4-0,5 см наносят на поверхность МППГГА в чашках Петри и тщательно распределяют по его поверхности. Избыток посевного материала удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки Петри подсушивают в течение 1 ч при температуре 37°С-38°С до полного впитывания в агар посевного материала. После чего на поверхность питательной среды в два разных места наносят пастеровской пипеткой по одной капле 0,05 см бактериофага каждого разведения. Чашки наклоняют, чтобы капли бактериофага стекли по поверхности питательной среды двумя дорожками. Контролем являются посевы культуры бруцелл на среде без внесения бактериофага. Посевы помещают в термостат агаром вверх и инкубируют в течение четырех-пяти суток при температуре 37°С-38°С.

9.3.4.3 Учет результатов

Результаты исследования учитывают в крестах:

— полный лизис культуры на месте нанесения фага (или линии стекания) «++++»;

— лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки (участок лизиса) в виде сот «+++»;

— резко ослабленный рост культуры бруцелл и небольшое количество бляшек «++»;

— очень слабый лизис культуры бруцелл «+»;

— отсутствие лизиса культуры бруцелл «-«.

За положительный результат чувствительности к лизису фагом принимают лизис культуры бруцелл не менее чем на два креста.

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella приведены в приложении А.

10.1 Подготовка к исследованию

Для постановки биологической пробы используют морских свинок (не менее двух животных), не реагирующих на бруцеллез при серологическом исследовании в пробирочной РА. Пробы сыворотки крови от животных в разведении 1:5 не должны агглютинировать S -бруцеллезный антиген.

10.2 Проведение исследования

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 см .

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0,5 0,5 см, фламбируют на пламени горелки, растирают в фарфоровой ступке со стерильным песком или гомогенизируют и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке подкожно в объеме 1 см .

Содержимое гигром, бурс вводят морским свинкам подкожно в объеме 0,2-0,3 см . При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2-3 см материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

Через 15, 25 и 40 сут после заражения у морских свинок берут кровь в объеме 1-2 см из ушной вены путем надреза или из сердца путем пункции и готовят сыворотку, которую исследуют в РА в пробирках в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически (раздел 8). Высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку с бульоном и две пробирки с агаром из паховых, подчелюстных, заглоточных, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (два высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют по 8.3.8.

10.3 Учет результатов

При отрицательной РА у морских свинок биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бактериологическое исследование не проводят.

При выделении культуры бруцелл на питательных средах биологическое исследование прекращают, а ранее зараженных морских свинок убивают.

Результат исследования на бруцеллез считают положительным при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, даже если из исходного материала культура бруцелл не выделена.

11.1 Молекулярно-генетическое исследование на бруцеллез проводят в полимеразной цепной реакции (ПЦР), руководствуясь инструкциями по применению конкретных тест-систем.

11.2 Молекулярно-генетическое исследование методом ПЦР проводят в случае аборта и (или) при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и (или) сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами из хозяйств, благополучных по данному заболеванию и для идентификации культур бруцелл (изолятов), выделенных при исследовании патологического материала.

11.3 Для исследования в ПЦР используют тот же патологический материал, что и для бактериологической диагностики.

________________
* В бумажном оригинале слово «Brucella» в наименовании приложения А выделено курсивом. — Примечание изготовителя базы данных.

А.1 Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella приведены в таблице А.1.

Таблица А.1

источник