Бактериологический метод диагностики бруцеллеза

Разнообразные клинические проявления бруцеллеза приводят к необходимости широкого использования лабораторных методов исследования: бактериологического, биологического, сероло­гического и аллергического. Комплекс лабораторных исследований с обязательным учетом клинических, эпидемиологических и эпизоотологических данных обеспечивает правильную диагностику заболевания.

Работа по выделению и дифференциации бруцелл из любого исследуемого материала должна проводиться в строгом соответ­ствии с санитарными правилами СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».

Бактериологический метод.Для исследования на бруцеллез в лабораторию поступает патологический материал от больных людей (кровь, мокрота, гной, суставная жидкость, пунктат из селезенки, моча), сельско­хозяйственных животных (абортированный плод, лимфатические узлы, паренхиматозные органы, кровь, моча, молоко, молочные продукты) и различные объекты окружающей среды (вода, навоз). Материал для исследования забирают в стерильную посуду.

Для выделения культур бруцелл всех видов используют печеночные и мясопептонные агары в различных модификациях, агар Альбими, сухие питательные среды — агар «Д» и эритрит агар. Посев материала производят на качественные, предвари­тельно проверенные питательные среды, выращивают при 37 °С в аэробных условиях и с повышенным (5-10 %) со­держанием углекислого газа.

Исследование крови необходимо проводить во время лихо­радочного состояния больного до лечения антибиотиками, так как в этот период наблюдается наибольший процент выделения культур. Кровь в количестве не менее 10 мл стерильно берут из локтевой вены и засевают по 5 мл в два флакона среды Кастанеда. Начиная с четвертого дня, посевы ежедневно просматривают и, при отсутствии роста культуры, поверхность агара орошают бульоном путем осторожного покачивания фла­кона. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца роста бруцелл не обнаруживают, то делают контрольный высев из бульона среды Кастанеда на твердую питательную среду.

При обследовании людей на бруцеллез для удобства доставки флаконов с кровью можно пользоваться транс­портной жидкой средой, которую готовят заранее и хранят в лаборатории в течение полугода. Кровь доставляют в лабораторию в транспортной среде, засевают на среду Каста­неда и исследуют по общепринятой схеме.

Бруцеллы можно выделить из костного мозга, мочи, спинно­мозговой жидкости, грудного молока, желчи, мокроты, трупного материала и т. д. Исследуемый материал по 0,1 мл засевают на плас­тинки питательного агара и по 5-10 мл на жидкие питатель­ные среды. Для задержки роста посторонней микрофлоры при исследовании загрязненного материала к среде добавляют генцианвиолет (1:200 000) или антибиотики (пенициллин 0,25 ед/мл и стрептомицин 0,05 ед/мл).

Особого внимания заслуживает получение культуры из моло­ка сельскохозяйственных животных. Забор молока у овец, коров, верблюдов и коз рекомендуется проводить путем сдаивания его последних порций из каждого соска вымени по 10 мл в стерильную посуду. Если исследовать молоко в течение первых суток не удается, то его консервируют добавлением сухой борной кислоты 1 %, генцианвиолета 1:25 000. Для исследования молока из больших емкостей забирают 100 мл верхнего слоя, затем перемешивают и набира­ют еще 100 мл.

Лучшие результаты дает посев сливок, полученных центри­фугированием молока при 2,5-3 тыс. об/мин в течение 3-5 мин или путем отстаивания в течение одних суток в холо­дильнике. Сливки в количестве 0,1-0,2 мл засевают на твердую питательную среду с подавителем посторонней микрофлоры (4-6 пробирок на 1 пробу).

Бактериологический метод считается самым достоверным, т. к. выделение бруцелл является неопровержимым доказа­тельством бруцеллезной инфекции. Отрицательные результаты бактериологического исследования не дают права для заключе­ния об отсутствии заболевания.

Биологический метод.Для выделения бруцелл из материала, загрязненного посто­ронней микрофлорой или содержащего малые концентрации возбудителя, в качестве биологической пробы используют морских свинок (весом 250-300 г) или белых мышей (весом 17-18 г). Исследуемый материал в объеме не более 0,5 мл вводят под­кожно в паховую область белой мыши и 1 мл морской свинке.

Вскрытие белых мышей производят через 20-25 дней, а мор­ских свинок — через 30-35 дней после введения материала. Перед вскрытием у свинок кровь из сердца исследуют в реакции агглютинации. Для посевов у морских свинок берут лимфатические узлы (паховый, подчелюстной, шейный, парааортальный), кусочки селезенки, печени, костный мозг, кровь, мочу; у белых мышей — лимфатические узлы (пахо­вый, аксиллярный, парааортальный, подчелюстной), кусочки селезенки и печени. Лимфатические узлы, кусочки печени и селе­зенки помещают в стерильную чашку. Костный мозг извлекают пипеткой из рассеченной бедренной кости. Посевы крови из сердца, мочи и костного мозга производят стерильной пипеткой непосредственно на питательную среду (агар и бульон). Лимфа­тические узлы и органы перед посевом надсекают ножницами, берут стерильной деревянной палочкой, вносят первоначально в пробирку с агаром, раздавливают и тщательно втирают мате­риал в поверхность питательной среды. Затем остатки посевного материала переносят в пробирку с бульоном. Палочка должна быть длиной 25-30 см, диаметром 4-5 мм, хорошо отструганная, с несколько заостренным концом. После использования ее погру­жают на 1 час в дезраствор.

Все посевы дублируют (часть помещают в условия повышен­ного содержания углекислоты), выдерживают при 37 °С до 30 дней. Для предотвращения высыхания питатель­ных сред пробирки заливают парафином или закрывают резино­выми колпачками.

Посевы просматривают каждые 3-4 дня. Из помутневших бульонов делают высев в пробирки со скошенным агаром. Коло­нии бруцелл на пластинчатом агаре становятся видимыми на 5-7 сутки, иногда позднее. По истечении 30 дней наблюдение прекращают. Если за это время рост не появился, посевы уничто­жают, а результаты бактериологического исследования считают отрицательными.

Результат оценивают положительно при выделении хотя бы одной колонии бруцелл. Идентификацию возбудителя бруцеллеза проводят по: по характеру роста культуры на плотных питательных средах; морфологии микроба в мазках, окрашенных по Граму, Козловскому; агглютинации со специфической бруцеллезной сывороткой на стекле и объемным методом; свечению на 3-4+ культур, обработанных бруцеллез­ной люминесцирующей сывороткой.

Культуры предварительно проверяют на наличие признаков диссоциации, одним из перечисленных выше методов.

Дифференциации (определение видов и биоваров) подлежат культуры в S-форме после идентификации.

Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета номенклатуры бактерий и Объединенным комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу в 1972 г. были определены единые тесты для проведения идентификации и дифференциации бруцелл для всех стран мира.

О видовой принадлежности культуры бруцелл и биоварах судят на основании результатов комплексного изучения отноше­ния выделенных культур к условиям выращивания (при повышенном содержании углекислоты или в обычных аэроб­ных условиях), чувствительности к анилиновым краскам (бактериостатическим методом), способности образовывать серо­водород, чувствительности к бруцеллезному фагу «Тb», окислительно-метаболических тестов, агглютинабельных свойств культур с использованием монорецепторных сывороток (антиабортус и антимелитензис) и дополнительного исследования уреазной активности, вирулентности и других признаков. Дифференциацию бруцелл на виды и биовары про­водят в параллельных опытах испытуемых штаммов с рефе­рентными всех трех видов бруцелл.

Серологические и аллергические методы исследования на бруцеллез.Серологические реакции и аллергическая проба являются общедоступными методами и применяются для диагностики бруцеллеза наряду с бактериологическим и биологическим методами.

В случае малой обсемененности пробы и отрицательных результатов, полученных при посеве исследуемого материала на питательные среды и заражении лабораторных животных, серологический метод может быть единственным, позволяющим диагностировать бруцеллез. В зависимости от целей исследования используют те или иные серологические методы.

При проведении эпидемиологического исследования в очагах применяют реакцию агглютинации пластинчатую (Хеддльсона) и объемную (Райта), реакцию Кумбса, РСК, РДСК, РПГА, кожную аллергическую пробу, иммуноферментный анализ (ИФА). Перед профилакти­ческой вакцинацией населения можно ограничиться постанов­кой пластинчатой реакции агглютинации (Хеддльсона) и кожной аллергической пробы.

Для диагностики острого и подострого бруцеллеза ставят реакцию Хеддльсона, Райта и РПГА. В случаях отрицательного результата используют реакцию Кумбса.

При диагностике хронического бруцеллеза и проведении диспансерного наблюдения за переболевшими рекомендуют наряду с реакциями Хеддльсона, Райта, РПГА, использовать реакцию Кумбса и аллергическую пробу (Бюрне).

Серологические реакции и аллергическая кожная проба по своему диагностическому значению в различные периоды заболевания не равноценны, вследствие чего не могут заменить друг друга. Это обусловливает необходимость применения комплексного серологического метода, являющегося наиболее надежным способом диагностики бруцеллеза.

В ранние сроки от начала заболевания (первые 6 месяцев) диагностическая ценность серологического метода выше, чем аллергического. Серологические реакции в этот период оказы­ваются положительными почти в 95 % случаев. По мере удлине­ния срока заболевания процент положительных серологических реакций начинает снижаться. При проведении обследования необходимо учитывать, что высокие титры антител всегда указывают на наличие инфекции, антитела в низких титрах или их полное отсутствие не исключает возможности заболевания. В связи с этим рекомендуется про­водить повторные исследования с интервалом 1-2 недели, особенно при подозрении на острую форму бруцеллеза.

Для постановки диагноза бруцеллеза у крупного рогатого скота применяют серологические и аллергические методы. Обследование начинают с постановки роз-бенгал пробы (РБП). Сыворотки, с которыми получена положительная РПБ, исследуют в РА Райта, РСК (РДСК), РПГА для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих анти­тел. Исследование проводят двукратно с промежутком в 30 дней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Последнее изменение этой страницы: 2016-12-30; Нарушение авторского права страницы

источник

3.1. Бактериологическую диагностику бруцеллеза проводят в случае аборта или при появлении у животных других признаков (бурситы, гигромы, орхиты, эпидидимиты и проч.), вызывающих подозрение на данное заболевание.

3.2. Бруцеллы обнаруживают тремя методами: бактериоскопией мазков из патологического

материала, выделением культуры бруцелл на питательных средах и, при необходимости, путем постановки биологической пробы на морских свинках.

3.3. Бактериоскопическое исследование.

Из доставленного на исследование патологического материала делают по 2 мазка из каждого объекта. При исследовании абортированных плодов мазки готовят из содержимого желудка,

жидкости брюшной и грудной полостей, печени, селезенки, а также котиледонов плодовых оболочек.

Из паренхиматозных органов, котиледонов и другого плотного материала делают мазки-отпечатки, жидкий материал наносят на предметные стекла пипеткой.

Мазки, фиксированные на пламени, окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шин (см.

Приложение N 1, п. 1). При микроскопии мазков учитывают, что бруцеллы — мелкие,

грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно кокко-бактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин в красный цвет.

3.4. Бактериологическое исследование.

3.4.1. Для культивирования бруцелл используют мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ), печеночно-глюкозно-глицериновый бульон (ПГГБ), мясо-пептонный печеночно-глюкозно- глицериновый агар (МППГГА), печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА), картофельный агар, эритрит-агар или сывороточно-декстрозный агар (см. Приложение N 1, п. 2).

Культивирование возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) проводят на плотных или полужидких печеночно-сывороточном или печеночно-аминопептидном агарах, а также на сывороточно-декстрозном агаре (см. Приложение N 1, п. 2).

3.4.2. Перед посевом материала кожу абортированного плода с поверхности по белой линии

протирают тампонами, смоченными 5-процентным раствором фенола. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей набирают пастеровскими пипетками и высевают в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка — в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром.

Из печенки и селезенки вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5 х 2,5 см, увлажняют их спиртом, обжигают с поверхности и растирают в стерильной ступке с песком. Затем в ступку добавляют равное количество стерильного физиологического раствора и вновь растирают. Полученную взвесь пастеровской пипеткой по 0,1 — 0,2 мл высевают на поверхность предварительно

подсушенных плотных сред (в пробирках или чашках). Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из органов (место прокола органа предварительно прижигают

раскаленным шпателем). Из каждого органа делают посев на 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром.

Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем на 10

пробирок агара. При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

Из плодовой оболочки, плаценты вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и

стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений). Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3-процентным раствором гидроокиси калия на 30 минут. Затем их обмывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала

суспензию в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой на чашки со средой, содержащей бактериостатические препараты: генцианвиолет 1:200000 (0,1 мл 0,5- процентного спиртового раствора на 100 мл среды) или кристаллвиолет 1:100000, генцианвиолет и малахитовую зелень в концентрации каждой краски 1:200000, уксуснокислый натрий из расчета 0,125 мг на 1 мл среды.

Содержимое бурс, гигром высевают на 3 — 4 чашки с плотной питательной средой, содержащей бактериостатические препараты.

Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 оборотов в минуту. Верхний слой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0,1 — 0,2 мл вносят на 3 — 4 чашки с агаром, содержащим бактериостатические препараты. Молоко, консервированное генцианвиолетом, высевают на среды без бактериостатических веществ.

3.4.3. Для выращивания культур посевы помещают в термостат при 37 — 38 °С.

При исследовании материала от крупного рогатого скота половину засеянных пробирок и чашек инкубируют в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (10 — 15%), другую — в обычных атмосферных условиях.

Для выделения возбудителя инфекционного эпидидимита баранов (бруцелла овис) все посевы инкубируют в атмосфере, содержащей 10 — 15% углекислого газа.

Для создания атмосферы с повышенным содержанием углекислого газа засеянные пробирки заливают парафином или помещают в эксикатор (микроанаэростат).

Перед парафинированием пробирки закрывают горящими ватными пробками, пронося

последние над пламенем горелки. Затем верхнюю часть пробки обрезают, а оставшуюся часть углубляют на 0,5 — 1 см внутрь пробирки и заливают расплавленным парафином.

Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0,48 г бикарбоната натрия и 5 мл 25-процентного раствора серной кислоты или 0,4 г бикарбоната натрия и 0,35 мл

концентрированной соляной кислоты на 1 л объема);

сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

Для определения концентрации углекислого газа в эксикаторе можно использовать химический

метод (см. Приложение N 1, п. 3).

3.4.4. Посевы выдерживают в термостате при 37 — 38 °С в течение 30 дней. Первый просмотр посевов проводят через 18 — 24 часа. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, отбраковывают.

В дальнейшем для обнаружения роста бруцелл посевы просматривают каждые 3 — 4 дня

визуально, при необходимости через лупу или при малом увеличении микроскопа. При отсутствии

роста часть поверхности агара орошают конденсационной жидкостью.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80% и более засеянных пробирок)

бактериологическое исследование прекращают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара

бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью

просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем —

сероватый. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с

В бульоне бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо,

возвышающееся над уровнем бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В

отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре из каждой

пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов и делают пересев на

чашку с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы на чашках культивируют так же,

как и высевы из патологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним

из специальных методов), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на

стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой.

При постановке реакции агглютинации на обезжиренное предметное стекло наносят каплю

бруцеллезной сыворотки в разведении 1:50 и каплю той же сыворотки в разведении 1:2 (для

выявления слабоагглютинабельных культур). В каждую каплю сыворотки бактериологической петлей

вносят агаровую культуру и тщательно растирают ее. Одновременно ставят контроль с негативной

сывороткой в тех же разведениях.

При положительной реакции через 1 — 3 мин. в капле позитивной сыворотки образуются хлопья

или комочки, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В

контроле наблюдается равномерное помутнение без образования хлопьев.

При отрицательной реакции агглютинации с культурой из одной колонии дополнительно

исследуют не менее трех-четырех подозрительных колоний.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, тинкториальными и

культуральными свойствами и дающие положительную реакцию агглютинации с позитивной

сывороткой, относят к бруцеллам.

Первичные культуры возбудителя инфекционного эпидидимита баранов подвергают

серологической идентификации. Для этого проводят гипериммунизацию двух кроликов массой 2 — 3

кг путем двукратного с интервалом 7 — 8 дней внутривенного введения им по 2 мл взвеси

двухсуточной исследуемой культуры, содержащей 3 — 4 млрд. микробных клеток в 1 мл

физиологического раствора. Через 10 — 12 дней после второго введения от кроликов получают

сыворотку крови и исследуют ее в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с овисным

Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов вызывает образование антител в

крови кроликов (положительная РДСК). Отрицательный результат РДСК с овисным антигеном

означает, что изучаемая культура не относится к возбудителю инфекционного эпидидимита баранов.

3.5. Биологическое исследование.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

3.5.1. Биологическое исследование проводят на морских свинках (не менее двух) массой 350 —

400 г, предварительно проверенных на бруцеллез исследованием сыворотки их крови в РА с

отрицательным результатом в разведении 1:5.

3.5.2. Для постановки биологической пробы используют тот же материал, что и для

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном

физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят подкожно с внутренней стороны бедра

морской свинке в дозе 1 мл.

Из плаценты и плодовых оболочек (предварительно обработанных тампонами, смоченными

дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами) вырезают кусочки

размером 0,5 х 0,5 см, фламбируют их на пламени горелки, растирают в ступке со стерильным песком

и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской

Содержимое гигром, бурс вводят морской свинке подкожно в дозе 0,2 — 0,3 мл. При этом

необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно

Пробы молока центрифугируют 30 минут при 3000 об./мин. Морской свинке вводят подкожно 2

— 3 мл материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

3.5.3. На 15-й, 25-й и 40-й дни после заражения у морских свинок берут кровь в количестве 1 — 2

мл из ушной вены путем надреза или из сердца — путем пункции и сыворотку крови исследуют в

пробирочной РА в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации (в разведении 1:10 и выше) морских свинок

убивают, в случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют

бактериологически. Высевы делают пастеровскими пипетками в 1 пробирку бульона и 2 пробирки

агара из паховых, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (2 высева),

печени и костного мозга. Посевы культивируют, как описано в подпунктах 3.4.3 и 3.4.4.

При отрицательной РА у морских свинок в указанные выше сроки биопробу считают

отрицательной, подопытных животных убивают.

3.5.4. При выделении культуры бруцелл на питательных средах из исходного материала

биологическое исследование по данной экспертизе прекращают, а ранее зараженных морских свинок

3.6. Результат исследования на бруцеллез считают положительным при выделении культуры

возбудителя или при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови

1:10 и выше, если из исходного материала культура не выделена.

При положительных результатах бактериоскопии и отрицательных результатах

бактериологического исследования и биопробы материал считают подозрительным на бруцеллез.

бактериологического — до 1 месяца;

биологического — до 2 месяцев.

3.8. В районных и межрайонных ветеринарных лабораториях все выделенные культуры бруцелл

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

после их идентификации подлежат уничтожению путем автоклавирования при 1,5 атмосферах в

3.9. При необходимости определения вида бруцелл, а также в целях дифференциации полевых

штаммов от вакцинных выделенные от животных культуры направляют в республиканские,

областные, зональные ветеринарные лаборатории или ветеринарные научно-исследовательские

учреждения, в которых имеются лаборатории или отделы, занимающиеся изучением бруцеллеза

животных и имеющие разрешение органов здравоохранения на работу с микроорганизмами второй

источник

Возбудители бруцеллеза (Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis и Brucella canis) высоко контагиозны и работа с ними проводится в специализированных лабораториях особо опасных инфекций. Постановку серологических реакций и аллерги­ческих проб для диагностики бруцеллеза производят соответственно в обычных микробиологических лабораториях и больничных условиях.

Главным резервуаром бруцелл являются домашние сельскохозяйственные животные, а также другие виды животных, от которых человек заражается преимущественно контактным или контактно-бытовым, реже алиментарным путем. Клинические проявления бруцеллеза многообразны, поражаются лимфатическая, сосудистая, гепато-лиенальная системы и особенно опорно-двигательный аппарат Методы микробиологической диагностики бруцеллеза представлены в схеме 7.

Схема 7. Микробиологическая диагностика бруцеллеза

Серологический метод— постановка РА с сывороткой крови больного (реакция Райта, ставят в начале 2-й недели болезни, диагностический титр 1:200 и выше), ускоренной РА на стекле (реакция Хеддльсона), РСК и ИФА.

Диагностикумом в реакции Райта и Хеддльсона является взвесь убитых бруцелл с красителем генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.

Реакцию агглютинации Хеддльсона ставят на стеклянной пластинке, на которую наносят микропипеткой неразведенную исследуемую сыворотку в количествах 0,08; 0,04; 0,02; 0,01 и 0,02 мл, добавляют по 0,03 мл бруцеллезного диагностикума, кроме по­следней дозы, в которую вносят 0,03 мл ФР (контроль сыворотки). Контролем диагностикума является смесь из 0,03 мл антигена и 0,03 мл ФР. Все капли перемешивают стеклянной палочкой или бактериологической петлей и после легкого покачивания стекла наблюдают за появлением мелкозернистого окрашенного агглютината. Отсутствие агглюти­нации во всех пробах сыворотки оценивается как отрицательная реакция, наличие агглютинации в 1-й пробе (0,08 мл сыворотки) — сомнительная, во 2-й (0,04 мл) — слабоположительная, в 3-й или 4-й пробах (0,02-0,01 мл) — положительная, во всех пробах — рез­ко положительная реакция. Поскольку реакция агглютинации Хеддльсона иногда бывает положительной у здоровых людей за счет нормальных антител, она обязательно подтверждается реакцией Райта.

РИФ, РНГА, РСК и особенно ИФА более чувствительны, чем реакция агглютинации. Для ранней диагностики бруцеллеза особую ценность имеет ИФА, позволяющий выявить в сыворотке больных антибруцеллезные антитела класса IgM,которыев отличие от IgG по­являются в ранние сроки болезни, свидетельствуя о свежем инфицировании.

Аллергический метод –постановка внутрикожной аллергической пробы Бюрне с 15-20 дня заболевания. Учет реакции проводится через 24-48 часов, положи­тельной считается реакция в случае появления на месте введения аллергена (бруцеллина) болезненности, гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 3 см и более. Положительная аллергическая ре­акция на бруцеллин сохраняется в течение длительного времени после перене­сенного бруцеллеза, а также после прививки.

Бактериологический метод— посев крови для выделения гемокультуры в 2 флакона с 50 мл печеночного или асцитического бульона (рН 7,1-7,2) или МПБ с добавлением 1 % глюко­зы, 2 % глицерина и антифаговой сыворотки (для инактивации бруцеллезного бактериофага) в первые дни болезни при наличии лихорадки. При отрицательных резуль­татах исследование повторяют, т.к. бактериемия наблю­дается в течение 1 года и более.

Один флакон выращивают в обычных аэробных условиях, другой — в герметично закрытом сосуде с 10 % углекислого газа (или СО₂-инкубаторе) при температуре 37 0 С до 1 ме­сяца, делая пересевы на скошенный пече­ночный агар или эритрит-агар каждые 4-5 дней. На жидких средах бруцеллы растут с образованием легкого помутнения и небольшого слизистого осадка, на плотных средах в виде округлых, диаметром до 5 мм, серовато-белых, блестя­щих, прозрачных с янтарным оттенком в проходящем свете колоний. Типичные колонии пересевают на скошенный агар и идентифицируют выделенную культуру до уровня вида.

Выполняются также посевы ис­следуемого материала в желток свежего куриного яйца или в жел­точный мешок куриного эмбриона с последующей их инкубацией в течение 5 дней при 37 0 С и пересевом содержимого желточного мешка на плотные и жидкие питательные среды для выделения чистой культуры бруцелл.

Бруцеллы идентифицируют на основании изучения морфологических (рис. 13 — грамотрицательные коккобактерии), культуральных, биохимических (они не ферментируют уг-

Рис. 13. Возбудитель бруцеллеза (Brucella melitensis). Окраска по Граму. Мелкие грамотрицательные коккобактерии.

леводы, не свертывают молоко и не разжижают желатину, выделяют сероводород), антигенных свойств (постановка РА с моноспеци­фическими сыворотками против антигеновА, М, R), чувствительности к специфическому бактери­офагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (табл. 8).

Таблица 8.Дифференциация основных видов бруцелл

. Обозначения: «-« — отрицательная; «+» — положительная; «±» — непостоянная реакции.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Бруцеллы (род Brucella) – возбудители бруцеллеза человека и животных. В. melitensis, В. abortus и В. suis – вызывают заболевание у человека; B. ovis, B. canis, B. neotomae заболевания человека не вызывают.

Морфология, физиология. Мелкие Гр– коккобактерии размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм. Также могут быть палочковидной формы; в мазках обычно расположены беспорядочно. Жгутиков не имеют. Спор не образуют. Свежевыделенные штаммы могут образовывать нежную капсулу при культивировании на средах, содержащих 10% иммунной сыворотки барана или лошади, а также при выращивании на куриных эмбрионах.

Требовательны к питательным средам. Для выращивания обычно применяют триптозный, триптозо-казеиново-соевый и кровяной (5% овечьей крови) агары; оптимальная среда для культивирования — печёночный агар Хеддльсона. Выделяемые из организма больных они размножаются очень медленно, рост может быть обнаружен только через 1–3 недели после посева исходного материала. Многократное пересевание в лабораторных условиях делает культуры способными расти в течение 1–2 дней. На плотных питательных средах образуют мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S-формы (жемчужины), легко переходят в мукоидную и шероховатую. В жидких средах возникает равномерное помутнение. Под влиянием антибиотиков образуют L-формы.

Бруцеллы строгие аэробы, а В. abortus в первых поколениях требует увеличенной концентрации (5–10%) СО₂.

БХ: расщепляют глюкозу и некоторые другие углеводы, разлагать мочевину и аспарагин, гидролизовать белок, пептоны, аминокислоты, выделять каталазу, гиалуронидазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу и другие ферменты. Внутри видов бруцелл различают биовары. Их дифференциация основана как на биохимических различиях, так и на способности расти на средах с фуксином и тионином, лизабельности фагом Т6, агглютинабельности моноспецифическими сыворотками.

АГ. Содержат поверхностно расположенный Vi-АГ и соматические видоспецифические АГ А и М, количественное соотношение которых различно у разных видов. У В.melitensis преобладают М-АГы. у В. abortus и В. suis – А-АГ. Для идентификации бруцелл по антигенным свойствам используют реакцию адсорбции агглютининов или монорецепторные сыворотки.

Экология и распространение. Зоонозная инфекция. Возбудители разных видов циркулируют среди животных, от которых заражаются и люди. В.melitensis вызывает заболевания мелкого рогатого скота, В. abortus – КРС, В.suis – свиней. Непатогенные для человека

Бруцеллы устойчивы к действию факторов окружающей среды. Они длительно сохраняют жизнеспособность при низкой температуре. В почве, моче, испражнениях животных, больных бруцеллезом, в навозе, сенной трухе возбудители выживают 4–5 мес., в шерсти– 3– 4 мес., в пыли – 1 мес., в замороженном мясе – до 5 мес. К высокой температуре и дезинфицирующим веществам бруцеллы высокочувствительны: при 60°С погибают за 30 мин, при кипячении – мгновенно. Все дезинфектанты губят бруцелл в течение нескольких минут.

Патогенность и патогенез. Проникновение – алиментарным, контактным и воздушно-капельным путями. Алиментарный путь заражения связан с употреблением в пищу продуктов животноводства (масла, молока, мяса), полученных от больных животных. Контактным путем заражаются чаще ветеринары, зоотехники, работники мясокомбинатов при уходе за больными животными, обработке сырья. Заражение возможно при работе с инфицированной шерстью, ветошью, когда имеет место распыление, попадание бруцелл в воздух. Для человека наиболее патогенными являются В.melitensis – возбудитель болезни мелкого рогатого скота (овец, коз).

Выраженные инвазивные и агрессивные свойства бруцелл обусловливают способность возбудителя проникать в организм через неповрежденные слизистые оболочки. После проникновения в организм распространяются лимфогенным путем, попадают в кровь, а из крови – в селезенку, костный мозг, лимфоузлы, где, локализуясь внутриклеточно, могут длительно сохраняться.

Болезнетворность бруцелл определяется действием эндотоксина. Выделяющиеся ферменты (гиалуронидаза и др.) способствуют распространению микробов в тканях. В патогенезе бруцеллеза имеет значение способность возбудителя размножаться в клетках лимфоидно-макрофагальной системы.

С первых дней болезни возникает реакций ГЗТ, которая сохраняется в течение всей болезни и длительное время после выздоровления.

Иммунитет. В основе иммунитета при бруцеллезе лежит активность системы Т-лимфоцитов. Важную роль играет фагоцитоз и состояние аллергии. Обезвреживание бруцелл происходит при участии антител – опсонинов, агглютининов.

Лабораторная диагностика. Проводится бактериологическим и серологическим методами. Материалом для бактериологического исследования служат кровь, испражнения и моча больных, иногда – спинномозговая жидкость. Выделением возбудителя занимается специальная режимная лаборатория.

Образцы инкубируют в МПБ или бульоне Мартена (можно использовать соевый бульон) при 37°С. При проведении исследования засевают 2 порции среды и в одной создают повышенную концентрацию СО. Через 4-5 сут наблюдают рост бруцелл, нередко в виде мелких колоний, вкрапленных в тяжи фибрина; среда остаётся слегка мутной или прозрачной. После пересева на твёрдые среды отмечают характерный рост колоний, из которых отвивают чистые культуры с последующими идентификацией биохимических свойств, определением способности расти на средах с добавлением некоторых анилиновых красителей (бактериостатический метод Хеддльсона) и определением биотипа реакциями агглютинации.

Серологические исследования. Реакция агглютинации (реакция Райта) — один из основных методов диагностики бруцеллёза. Динамика реакции может быть различной, для неё характерно колебание титров в течение суток; положительная реакция с первого дня заболевания; наиболее высокие титры отмечают через 1-2 мес. Для получения адекватных результатов необходимо использовать негемолизированную сыворотку и Аг, приготовленный из S-форм бруцелл (применять Аг диссоциированных форм нельзя); в эндемичных очагах, вызванных Brucella melitensis, рекомендуют применять гомологичный Аг. Следует помнить, что для реакции Райта характерны проагглютинационные зоны, или прозоны (отсутствие агглютинации в первых разведениях и чёткое её проявление в более высоких разведениях сыворотки). Часто применяют микрометод реакции агглютинации на стекле (реакция Хеддльсона). В острой фазе заболевания диагностическую ценность имеет иммуноферментный метод, выявляющий IgM в сыворотке больного. Выявление неполных AT (реакция Кумбса) с применением антиглобулиновой сыворотки. Для диагностики, особенно при отрицательных результатах бактериологических и серологических исследований, используют аллергические кожные пробы (проба Бюрне), обычно положительные у 70-85% пациентов к концу 1 мес заболевания. В качестве Аг применяют бруцеллин (мелитин, абортин) — протеиновый экстракт культуры бруцелл. Пробу также применяют для проведения эпидемиологических обследований; бывает положительной после вакцинации.

Для выявления возбудителя в молоке широко применяется кольцевая проба Банга.

Профилактика и лечение. Общие и специфические мероприятия ветеринарной службы. Выявляют и ликвидируют бруцеллез среди сельскохозяйственных животных, обезвреживают продукты и сырье животного происхождения. Людей, подвергающихся опасности заражения, вакцинируют живой бруцеллезной вакциной. Лечение бруцеллёза затруднено внутриклеточным паразитизмом бруцелл, что защищает их от действия антимикробных препаратов и AT. Препаратами выбора считают тетрациклин и стрептомицин. В тяжёлых и упорных случаях можно назначить рифампин (рифамицин). Смертность без лечения может достигать 5-10%.

источник

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стан» дартиэации установлены ГОСТ 1.0—92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2—2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «8ГНКИ»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстан-

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 12 ноября 2015 г. № 82-П)

‘ а принятие проголосовали:_

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004—97

Код страны по МК 3 и позволяющий получать частицы суспензии диаметром 10 — 50 мкм.

Микроскоп иммерсионный или стереоскопический по ГОСТ 8074.

Центрифуга лабораторная со скоростью вращения до 6000 об./мин.

СОг-инкубатор или эксикатор стеклянный (микроанаэростат) с содержанием углекислого газа от 10% до 15%.

Термостат, обеспечивающий поддержание температуры от 20 -‘С до 50 °С.

Холодильник бытовой, обеспечивающий поддержание температуры от О °С до 10 °С по ГОСТ 16317.

Баня водяная с терморегулятором.

5.2 Питательные среды и реактивы

Агар микробиологический по ГОСТ 17206 или агар пищевой по ГОСТ 16260.

Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Йод кристаллический по ГОСТ 4159.

Калий йодистый по ГОСТ 4232.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Кислота борная по ГОСТ 9656 или ГОСТ 18704.

Кислота соляная по ГОСТ 3118.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Кристаллический фиолетовый (генцианеиолет) по ГОСТ 4919.1.

Малахитовый зеленый по ГОСТ 4919.1.

Метанол технический по ГОСТ 2222.

Метиленовый синий по ГОСТ 4919.1.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.

Натрий лимоннокислый по ГОСТ 22280.

Раствор натрия хлорида 0.9 %-ный изотонический (физиологический раствор).

Физиологический раствор фенолиэированный 0.5 %-ный.

Сафранин. 2 %-ный водный раствор по ГОСТ 4919.1.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.

Стандарт мутности оптический, эквивалентный 10 международным единицам.

Пипетки градуированные вместимостью 1.2.5 и 10 см 3 по ГОСТ 29230.

Пипетки Мора вместимостью 100 см 3 .

Пробирки бактериологические по ГОСТ 25336.

Пробирки серологические Флоринского по ГОСТ 25336.

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147.

Чашки бактериологические одноразового использования или стеклянные по ГОСТ 25336.

5.4 Животные и материалы Бактериофаг бруцеллезный*.

Бумага фильтровальная марок ФБ-II или ФБ-HI по ГОСТ 12026.

Добавки селективные, ингибирующие рост посторонней микрофлоры и не влияющие на рост бруцелл**.

Дозаторы одкоканальные пипеточные переменного объема.

Иглы ветеринарные для взятия крови.

Иглы инъекционные по ГОСТ ISO 7864.

Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739.

Наконечники для дозаторов вместимостью 0.2. 0.5 и 1.0 см 3 .

Пакет для гомогенизации с фильтром.

Перчатки анатомические медицинские одноразовые по ГОСТ 32275.

Перчатки хирургические резиновые по ГОСТ 3.

* Примером может служить бактериофаг Тбилиси (76). Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

’* Примером селективной добавки служит добавка, содержащая во флаконе: полимиксин В — 2500 ME. 6а-цитрацин — 12500 ME. циклогексимид — 50.0 ME. нистатин — 50000 ME. натамицин — 50,0 мг. налидиксоеую кислоту — 2.5 мг. ванкомицин — 10.0 мг. Содержимое флакона может не содержать циклогексимид. Данная информация является рекомендуемой и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.

Пинцеты медицинские по ГОСТ 21241.

Свинки морские массой 300 —400 г.

Сыворотка крови крупного рогатого скота или лошади (нормальная, стерильная).

Шприцы медицинские инъекционные многократного применения по ГОСТ 22967.

Шприцы медицинские инъекционные однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.

Штативы 100-гнеэдмые для пробирок Флоринского.

5.5 Допускается применение других средств измерений и посуды с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных выше.

5.6 Допускается применение готовых питательных сред, а также других сред, приготовленных по прописи производителя, предназначенных для культивирования бруцелл с проверенными ростовыми свойствами.

5.7 Допускается применение готовых растворов генциан фиолетового. Люголя, фуксина Циля, малахитового зеленого и 5%-ной спиртовой настойки йода.

5.8 Допускается использовать другие селективные добавки, обладающие аналогичным действием, указанным в 5.4.

5.9 Допускается использовать посуду одноразового применения.

6.1.1 Материал для диагностики бруцеллеза отбирают от каждого животного в отдельности.

6.1.2 При взятии проб необходимо соблюдать меры, предупреждающие заражение людей и обсеменение объектов внешней среды в соответствии с требованиями, действующими на территории государства, принявшего стандарт.

6.1.3 Пробы направляют в лабораторию и исследуют в день отбора или на следующий день.

6.2 Отбор проб патологического материала

6.2.1 Для бактериологического и молекулярно-генетического исследования на бруцеллез направляют абортированный плод с плодовыми оболочками (от многоплодных животных берут не менее трех плодов). От плодов крупных животных направляют селезенку, печень, желудок с содержимым. перевязанный со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки, и околоплодную жидкость.

6.2.2 Если в течение 24 —30 ч взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30 %-ным водным раствором химически чистого глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в четыре —пять раз. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

6.2.3 От абортировавшего животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь (сыворотку крови) для молекулярно-генетического исследования на бруцеллез.

6.3 Отбор проб для прижизненной диагностики бруцеллеза

Для прижизненной диагностики бруцеллеза от животных берут:

• содержимое гигром, бурс и абсцессов.

При диагностическом убое дополнительно берут:

• лимфатические узлы: подчелюстные, заглоточные, предлопаточные. надколенные, подколенные. надвыменные. парааортальные. тазовые;

6.3.2.1 Кровь морских свинок для получения сыворотки с последующим исследованием при постановке биопробы берут из краевой ушной вены или из сердца по 1—3 см 3 стерильными шприцами в стерильные пробирки подходящей вместимости.

6.3.2.2 Приготовление сыворотки

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают в термостате при температуре 30 °С — 38 °С в течение 1 ч или при комнатной температуре в течение 8 — 10 ч, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С — 10 °С. Через 20 — 24 ч полученные сыворотки сливают в сухие стерильные пробирки и направляют для исследования в лабораторию.

6.3.2.3 Пробы крови от животных для бактериологического исследования берут стерильными шприцами в объеме 18 — 20 см 3 , в которые предварительно набирают антикоагулянтное средство (глюгицир или аналогичное>. Сразу после взятия крови иглы, не отсоединяя от шприцев, закрывают колпачками и перемешивают содержимое, переворачивая шприцы. Перед посевом использованные иглы заменяют стерильными.

6.3.3.1 Перед взятием проб молока у коров (буйволиц) вымя обмывают теплой водой, соски об* рабатывают 70 %-ным этиловым спиртом. Для исследования из каждой доли вымени берут последние порции молока в объеме 10 —15 см 3 в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками.

6.3.3.2 У овец и коз пробы молока берут путем пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70 %-ным этиловым спиртом и смазывают 5 %-ным раствором йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко в объеме 10 см 3 и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

6.3.4 Отбор проб содержимого гигром, бурс и абсцессов

При взятии содержимого гигром, бурс и абсцессов в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70 %-ным этиловым спиртом и смазывают 5%-ным раствором йода. Затем стерильным шприцем с ветеринарной иглой для взятия крови делают пункцию, отбирают содержимое гигромы, бурсы или абсцесса и переносят его в стерильную бактериологическую пробирку вместимостью 16—18 см 3 с резиновой пробкой.

6.3.5 Упаковка и маркировка проб

6.3.5.1 Отобранные в стерильные пробирки пробы крови и молока помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

Пробы патологического материала упаковывают в пергаментную бумагу, маркируют и помещают во влагонепроницаемую тару (полиэтиленовые пакеты или полистироловые контейнеры с крышками).

6.3.5.2 Пробы маркируют с указанием:

— вида, попа и возраста животного;

— инвентарного номера животного;

7 Бактериоскопический метод

Сущность бактериоскопического метода заключается в окрашивании мазков и мазков-отпечатков из патологического материала и последующем микроскопическом выявлении клеток бруцелл.

7.2 Подготовка к исследованию

7.2.1 Подготовка растворов для окраски

7.2.1.1 Приготовление кристаллического фиолетового и генцианового фиолетового

Берут 1 г кристаллического фиопетоеого или генцианового фиолетового и растирают в ступке с 2 г фенола, добавляя небольшими порциями 96 %-ный этиловый спирт в объеме 10 см 3 . После полного растворения краски в ступку при постоянном помешивании добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см 3 .

Срок хранения растворов при температуре от 2 °С до 10°С — не более 6 мес.

7.2.1.2 Приготовление раствора Люголя

Для приготовления раствора Люголя в 10 см 3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают в течение 5 — 6 ч до полного растворения йода и добавляют 290 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 10 °С а склянке из темного стекла — не более 30 сут.

7.2.1.3 Приготовление карболового фуксина Циля

Для приготовления карболового фуксина Циля 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллического фенола и 0.5 см 3 глицерина, добавляя небольшими порциями 96 %-ный этиловый спирт в объеме 10 см 3 , а затем при постоянном помешивании в ступку добавляют 100 см 3 дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в колбу вместимостью 200 см 3 .

Срок хранения раствора при температуре 18 °С —- 22 °С во флаконах из темного стекла с при* тертой пробкой —не более 6 мес.

Непосредственно перед работой к одной части полученного раствора карболового фуксина Циля добавляют девять частей дистиллированной воды.

7.2.1.4 Приготовление 0,75 %-ного и 1.0 %-ного водных растворов малахитового зеленого Берут 0.75 или 1.00 г малахитового зеленого и растворяют в 100 см 3 кипящей дистиллирован*

Срок хранения раствора при температуре от2 0 Сдо8′ : ‘С — не более 1 мес.

7.2.1.5 Приготовление 0.5 %*ного раствора уксусной кислоты

Берут 0.5 см 3 уксусной кислоты и добавляют 99.5 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 1 мес.

7.2.1.6 Приготовление 1 %-ного водного раствора метиленового синего

Берут 1 г метиленового синего и растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранешя раствора при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 1 мес.

7.2.1.7 Приготовление 2 %-ного водного раствора сафранина

Берут 2 г сафранина и растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора при температуре от 2 0 С до 8 °С — не более 1 мес.

7.2.1.8 Приготовление 5 %-ного спиртового раствора йода

Берут 5 г кристаллического йода и переносят в мерную колбу вместимостью 250 см 3 , добавляют 10 г калия иодида и равные объемы дистиллированной воды и 96 %*ного этилового спирта, доводя раствор до объема 100 см 3 .

Срок хранения раствора при температуре не выше от 2 °С до 25 °С в склянке из темного стекла — не более пяти лет.

7.2.1.9 Приготовление 3 %-ного слиртоаого раствора гидроокиси калия

Берут 3 г гидроокиси калия, растворяют в 5 см 3 дистиллированной воды и в мерной колбе вместимостью 200 см 3 доводят объем раствора 96 %-ным этиловым спиртом до 100 см 3 . Декантируют прозрачный раствор.

Срок хранения раствора при температуре не выше 25 °С не более одного года.

7.2.2.1 Из проб патологического материала по 6.2 делают по два мазка. При исследовании абортированных плодов готовят мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (печени, селезенки), котиледонов плодовых оболочек и другого плотного материала, а жидкий материал (содержимое желудка. жидкости брюшной и грудной полостей, околоплодную жидкость) наносят на предметные стекла пастеровской пипеткой.

7.2.2.2 Для приготовления мазкое-отпечатков используют чистые обезжиренные предметные стекла. Абортированный плод вскрывают, поверхность паренхиматозных органов, котиледонов плодовых оболочек и другого плодного материала стерилизуют, прикладывая раскаленный шпатель или обжигая факелом, смоченным 95 %-ным этиловым спиртом. Стерильными ножницами вырезают кусочки размером 1.5 * 1.0 * 1.5 см и прикладывают поверхности срезов к предметному стеклу (по три отпечатка на два предметных стекла). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе в течение 5 мин и фиксируют над пламенем горелки. Мазки-отпечатки на одном предметном стекле окрашивают по Козловскому или Стампу, на другом — по Г раму.

7.3 Проведение исследования

Для окраски мазкое по Граму на фиксированный мазок по 7.2.2 кладут кусочек фильтровальной бумаги, наносят кристаллический фиолетовый или генциан фиолетовый и выдерживают в течение 2 мин. после чего снимают бумагу, сливают краску, промывают дистиллированной водой и наносят на мазок раствор Люто ля (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наносят 96 %-ный этиловый спирт на 0.5 —1.0 мин. Затем мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают разведенным в соотношении 1:10 фуксином Циля в течение 1-2 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

Если после нанесения раствора Люголя мазок не чернеет, то необходимо приготовить новый раствор.

7.3.2 Окрашивание по Козловскому

Для окраски по Козловскому фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают 2 %-ным водным раствором сафранина с подогреванием на водяной бане до появления пузырьков. Мазок промывают дистиллированной водой и дополнительно окрашивают 0.75 %-ным или 1 %-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 0.5 —1.0 мин. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.3 Окрашивание по Стампу

Для окраски по Стампу фиксированный мазок по 7.2.2 окрашивают в течение 10 мин карболо-вым фуксином Циля, разведенным no 7.2.1.3 в соотношении 1:10. Мазок промывают дистиллированной водой, а затем 0.5 %-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают дистиллированной водой и докрашивают 1 %-ным раствором метиленового синего в течение 20 — 30 с. Краску сливают, промывают дистиллированной водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.

7.3.4 Полученные по 7.3.1 — 7.3.3 мазки микроскопируют под иммерсионным маслом.

При микроскопии окрашенных мазков, содержащих бруиеллы. должны наблюдаться мелкие, грамотрицательныв. расположенные отдельно, попарно или кучно коккобактерии. окрашенные в красный цвет.

Сущность культурального метода заключается в посеве патологического материала на питательные среды с последующим культивированием, идентификацией и дифференциацией выделенной культуры.

8.2 Подготовка к исследованию

8.2.1 Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 дм 3 водопроводной воды и выдерживают в течение 15 — 18 ч в прохладном месте. Затем сливают полученный настой в колбу вместимостью 2 дм 3 или кастрюлю из нержавеющей стали вместимостью 3 дм 3 и кипятят в течение 30 — 40 мин на электрической или газовой плите, доливают дистиллированную воду до объема 1 дм 3 и фильтруют через ватко-марлевый или тканевый фильтр. Полученную мясную воду стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 мин.

Срок хранения мясной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5 — 15 дм 3 при температуре от 2 °С до 25 “С — не более одного года.

8.2.2 Приготовление печеночной воды

Для приготовления печеночной воды свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 вносят 500 г фарша, заливают 1 дм 3 водопроводной воды, настаивают в течение 1 ч и кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин. После отстаивания фарш удаляют, а полученную жидкость доводят до 1 дм 3 дистиллированной водой и фильтруют через ватко-марлевый фильтр или тканевый фильтр. Полученную печеночную воду разливают по колбам и стерилизуют при температуре 11S °С и давлении 0,07 МПа в течение 30 мин.

Срок хранения печеночной воды в стеклянных бутылях вместимостью 5 — 15 дм 3 при температуре от 2 °С до 25 °С — не более одного года.

В емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 наливают 610 см 3 мясной воды по 8.2.1 и 305 см 3 печеночной воды по 8.2.2.10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 20 — 30 г пищевого или микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 30 мин. устанавливают pH 7.2 — 7.4 10 %-ным раствором натрия гидроокиси, добавляют 10 г глюкозы и 20 см 3 глицерина и фильтруют через ватно-марлевый или тканевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки по 7-8 см 3 или во флаконы по 250 —300 см 3 соответствующей вместимости и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. pH среды после стерилизации составляет 6.8 —7.0.

Срок хранения МППГТБ в пробирках и флаконах при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 3 мес.

6 емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью 3 дм 3 наливают 610 см 3 мясной во-ды по 8.2.1 и 305 см 5 печеночной воды по 8.2.2. 10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 20 —30 г микробиологического агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь кипятят на электрической или газовой плите в течение 1 ч. устанавливают pH 7.2 —7.4 10 %-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют 10 г глюкозы и 20 см 3 глицерина и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Полученную среду разливают в пробирки или флаконы вместимостью 500 см 3 и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. pH среды после стерилизации составляет 6.8 —7.0.

Срок хранения МППГГА в пробирках и флаконах при температуре от 2 °С до 8 °С — не более 3 мес.

МППБ готовят аналогично МППГГА по 8.2.3 без добавления агара, глюкозы и глицерина.

Срок хранения МППБ при температуре от 2 °С до 8 *С — не более 3 мес

8.2.6 Приготовление сывороточко-декстрозного агара

8 емкость из нержавеющей стали с крышкой вместимостью Здм 3 наливают 835 см 3 дистиллированной воды, добавляют 20 г пищевого или микробиологического агара. 10 г пептона. 5 г хлорида натрия и 165 см 3 мясной воды по 8.2.1. Полученную смесь кипятят на электрической или газовой плите при периодическом помешивании в течение 30 мин до расплавления агара. pH до стерилизации — 7.8. Затем стерилизуют в автоклаве текучим паром в течение 1 ч. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 ч. затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят pH среды до 7,2-7.4 10 %*ным раствором гидроокиси натрия, разливают в колбы (пробирки, флаконы) и стерилизуют при температуре 115 °С и давлении 0.07 МПа в течение 30 мин. После стерилизации pH среды составляет 6.8 —7.0.

Срок хранения сывороточно-декстрозного агара при температуре от 2 °С до 8 *С —не более 3 мес.

Перед применением среду в колбах (пробирках, флаконах) расплавляют в кипящей водяной бане. охлаждают до температуры 50 °С —60 °С и добавляют 40 %-ный стерильный раствор глюкозы в количестве 1 % к объему питательной среды во флаконе (например. 2.5 см 3 40 %-ного стерильного раствора глюкозы добавляют к 97.5 см 3 питательной среды).

8.2.7 Приготовление селективной добавки для внесения в питательные среды

Содержимое флакона по 5.4 растворяют в 5 см 3 50 %-ного метилового спирта и перемешивают

до образования гомогенной суспензии.

Раствор используют свежеприготовленным.

Полученное количество селективной добавки стерильно добавляют к 500 см 3 расплавленной питательной среды.

8.3 Проведение исследования

8.3.1 Перед посевом материала кожу абортированного плода по белой линии живота протирают тампоном, смоченным 5 %-ным раствором фенола, приготовленного путем растворения 5 г кристаллического фенола в 100 см 3 дистиллированной воды. Стерильными ножницами вскрывают брюшную стенку и грудную клетку плода, содержимое грудной и брюшной полостей пастеровскими пипетками высевают в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь переносят в объеме по 1.0-1.5 см 3 на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 в двух пробирках. Содержимое желудка в объеме по 1 —2 см 3 высевают в две пробирки с МППГББ и в пять пробирок на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6.

8.3.2 Лимфатические узлы, очищенные от жира и мышечных волокон, кусочки печени и селезенки размером 2.0 * 1,5» 2.5 см погружают в 96 %-ный этиловый спирт на 1 с и обжигают, проведя над пламенем спиртовки. После обработки от лимфоузлов стерильными ножницами отрезают кусочки размером 1 —2 см. Подготовленный материал помещают в пакет для гомогенеэации с фильтром, добавляют 4 —5 см 3 физиологического раствора и гомогенезируюг с использованием гомогенизатора по 5.1.

Допускается приготовление суспензии путем растирания материала в стерильной фарфоровой ступке с добавлением физиологического раствора до получения однородной гомогенной суспензии.

Полученный гомогенат высевают пастеровской пипеткой по 0.1 —0,2 см 3 на поверхность предварительно подсушенных после скашивания плотных питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 в пробирках и на чашки Петри.

Допускается высев материала пастеровской пипеткой непосредственно из лимфатических узлов и органов. Для этого место прокола пастеровской пипеткой предварительно прижигают шпателем.

нагретым над пламенем спиртовки. Из каждого объекта проводят посев в одну бактериологическую пробирку с МППГГБ и после пипетирования полученную взвесь в объеме по 1.0 —1.5 см 3 переносят на скошенную плотную питательную среду по 8.2.4 и 8.2.6 едва пробирки.

8.3.3 Если в лабораторию доставлен только желудок плода, высев проводят не менее чем в десять пробирок на среды по 8.2.4-8.2.6.

8.3.4 При поступлении нескольких плодов от одного животного посевы делают из органов и тканей каждого плода отдельно.

8.3.5 Из плодовых оболочек вырезают кусочки тканей с утолщенными ворсинками и стенками, наличием на поверхности фибрина или гнойного экссудата (выбирают менее загрязненные участки без некротических изменений).

Для уничтожения посторонней микрофлоры кусочки плаценты помещают в чашку Петри и заливают 3 %-ным раствором гидроокиси калия на 30 мин. Затем их промывают стерильным физиологическим раствором, готовят из этого материала суспензию в гомогенизаторе или в ступке со стерильным песком и делают посев пастеровской пипеткой в пробирки со средами по 8.2.3. 8.2.4 или 8.2.6. содержащими бактериостатические красители: генцианвиолет в разведении 1:200000 (0.1 см 3 0.5 %• ного слиртоводного раствора генцианвиолета на 100 см 3 среды) или кристаллвиолет в разведении 1:100000. генцианвиолет и малахитовую зелень в разведении каждой краски 1:200000. уксуснокислый натрий из расчета 12.5 мг на 100 см 3 среды, или селективную добавку, ингибирующую рост посторонней микрофлоры и грибов.

8.3.6 Содержимое бурс, гигром и абсцессов высевают на три-четыре чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. содержащей бактериостатические красители Во всех случаях вместо бактериостатических красителей допускается применение селективных добавок.

8.3.7 Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об./мин. Верхний спой (сливки) и осадок набирают в пастеровскую пипетку и по 0.1 —0.2 см 3 вносят в три-четыре чашки Петри со средами по 8.2.4 и 8.2.6. содержащими бактериостатические красители или селективные добавки.

8.3.8 Для выделения культуры бруцелл. в том числе и Brucella canls. кровь от животных с антикоагулянтом вносят по 10 —18 см 3 во флаконы, содержащие по 100 см 3 МППГГБ. и по 0.3 —0.5 см э в чашки Петри с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6. Посевной материал равномерно распределяют по поверхности питательной среды. Через 25 —30 мин чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С — 38 °С агаром вверх. Туда же помещают и флаконы с посевами.

Через семь суток инкубирования из посевов во флаконах делают пересев на три пробирки с плотной питательной средой по 8.2.4 и 8.2.6 и инкубируют при тех же условиях.

8.3.9 При исследовании материала от крупного рогатого скота половину пробирок и чашек Петри культивируют в термостате при температуре 37 °С — 38 °С. другую — в СОг-инкубаторе с содержанием 5 % —10 % углекислого газа или эксикаторе (микроакаэростате).

Примечание — Допускается культивирование в пробирках, которые плотно укупоривают резиновыми пробками и заливают парафином или обертывают ватно-марлевые пробки парафильмом.

8.3.10 Необходимое содержание углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

• внесения бикарбоната натрия и серной или соляной кислоты (0.48 г бикарбоната натрия и 5 см 3 25 %-ного раствора кислоты или 0.4 г бикарбоната натрия и 0.35 см 3 концентрированной соляной кислоты на 1 дм 3 объема):

• сжигания ваты, смоченной спиртом. При этом пробирки и чашки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

8.3.11 Посевы, полученные по 8.3.1 —8.3.9. выдерживают в термостате при температуре 37 °С — 38 °С в течение 30 сут. Первичный осмотр посевов проводят через 48 — 72 ч. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают посевным материалом.

В последующем посевы просматривают каждые 4 сут визуально, при необходимости через лупу или малом увеличении микроскопа.

При значительном росте посторонней микрофлоры (80 % и более засеянных пробирок) бактериологическое исследование прекращают.

8.4.1 При просмотре посевов обращают внимание на характер роста бактерий.

8.4.2 На поверхности твердых питательных сред по 8.2.4 и 8.2.6 бруцеллы образуют мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью бесцветные колонии, имеющие в отраженном сеете голубоватый оттенок, в падающем свете —сероватый. При длительном культивировании колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

8.4.3 В жидких питагепьных средах по 8.2.1. 8.2.3 и 8.2.5 бруцеллы образуют равномерное помутнение и пристеночное кольцо, возвышающееся над поверхностью бульона, а в дальнейшем небольшой осадок на дне пробирки. В отраженном свете пристеночное кольцо имеет голубоватый оттенок.

8.4.4 При обнаружении роста на жидких питательных средах и отсутствии характерного роста на твердых питательных средах из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из методов по 7.3.1— 7.3.2. и делают пересев на чашки Петри с твердой питательной средой для выделе* ния чистой культуры. Пересевы на чашках Петри культивируют так же. как и высевы из патологического материала. При отсутствии роста культуры бруцелл наблюдение за посевами прекращают по истечении 30 сут.

9 Идентификация выделенных культур

9.1 Пластинчатая реакция агглютинация

9.1.1 Подготовка к исследованию

9.1.1.1 Подготовка двухсуточных культур бруцелл

Для идентификации используют двухсуточные агаровые культуры (иэоляты) бруцелл. выделенные из патологического материала. С этой целью выделенные культуры пересевают бактериологической петлей штрихом на поверхность плотной питательной среды по 8.2.4. 8.2.6, скошенной в пробирках. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С —38 °С в течение двух суток. Выращенные культуры исследуют непосредственно после извлечения из термостата.

Примечание —Допустимый срок хранения культур при температуре от 2°С до 8*С—не более 14 сут.

9.1.1.2 Подготовка Я• и S-бруцеллеэных агглютинирующих сывороток

R. и 5- бруцеллезные агглютинирующие сыворотки разводят 0,5 %-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения. Разведенные сыворотки хранят при температуре от 2 °С до 8 °С и используют в течение 30 сут.

9.1.2 Проведение исследования

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле Я- и S-бруцеллезных сывороток по

9.1.1 и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно перемешивают в капле S-. Я-бруцеллезной сыворотки и физиологического раствора. Параллельно ставят контроли: со стандартными S- и Я-бруцеллеэными сыворотками и гомологичными антигенами.

9.1.3 Учет и оценка результатов реакции агглютинации

При положительной РА в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

Реакцию учитывают визуально в течение 1-3 мин и оценивают в крестах:

• ■♦+♦+* (четыре креста) — полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината —положительная реакция;

• «+♦+» (три креста) — неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом — положительная реакция;

• «++» (два креста) — неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом — положительная реакция;

•«+» (один крест) — жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом —сомнительная реакция;

• «•» (минус) — просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная —отрицательная реакция.

Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях Я- и

S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем на два креста, а с физиологическим раствором — отсутствует.

9.1.4 Обработка результатов

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными (см. раздел 8) и тинкгориальными свойствами (см. раздел 7), а также дающие положительную реакцию агглютинации с S- или Я-бруцеллезной сывороткой или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, считают бруцеллами.

9.2 Методы определения диссоциации культур бруцелл

9.2.1 Проба на стекле с раствором акрифлавина

На предметное стекло наносят каплю раствора акрифлавина в разведении 1:1000 в дистиллированной воде, в которой суспензируют с помощью бактериологической петли испытуемую культуру. У диссоциированных культур (Я- форма) в течение 1—2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культур бруцелл в S-форме остается гомогенной.

9.2.2 Реакция термоаггтотииации

Взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе ло 9.1.1 с со» держанием ло оптическому стандарту мутности 1 млрд/см 3 микробных клеток в объеме 4-5 см 3 про» гревают в пробирке вместимостью 20 см 3 на водяной бане при температуре 90 °С в течение 30 мин.

Результаты учитывают через 30 мин. 1 ч и через 24 ч при комнатной температуре.

При наличии диссоциации наступает выраженная агглютинация клеток бруцелл с формированием осадка, тогда как суспензия недиссоциированной культуры бруцелл в S-форме остается гомогенной.

9.2.3 Окраска колоний по Уайт-Билсону

Двухсуточную агаровую культуру бруцелл по 9.1.1 разводят физиопогическим раствором с таким расчетом, чтобы она по мутности соответствовала 10 ЕД оптического стандарта мутности. Полученную суспензию в объеме 3 см 3 смешивают с 2 см 3 физиологического раствора и делают десятикратные разведения до 10*. используя для каждого разведения отдельную пипетку, и высевают по 0.1см э на четыре-шесть чашек Петри с МППГГА. Поверхность агара в чашках равномерно орошают посевным материалом, выдерживают на горизонтальной поверхности стола в течение 20-30 мин и инкубируют при температуре 37 °С — 38 «С агаром вверх в течение 4-S сут.

Окраску колоний проводят рабочим раствором кристаллического фиолетового, приготовленного ло 7.2.1.1 в разведении 1:2000. В чашку Петри с изолированными колониями бруцелл пастеровской пипеткой с грушей вносят осторожно без напора рабочий раствор кристалвиолета. Через 30 с раствор краски удаляют с помощью пипетки с грушей, сливая в дезинфицирующую жидкость (3 %-ный раствор фенола или 5 %-ный раствор хлорамина). Колонии просматривают под бинокулярной лупой.

Колонии бруцелл в Я-форме (диссоциированные) имеют равномерно окрашенный широкий периферический ободок синего или фиолетового цвета и менее интенсивно окрашенную поверхность такого же цвета, иногда с исчерченностью.

Колонии бруцелл в S-форме имеют тонкий периферический ободок, окрашенный в синий или фиолетовый цвет. Центральная часть колоний светло-желтого цвета (не окрашивается).

9.3 Методы дифференциации бруцелл

Для дифференциации бруцелл используют следующие тесты:

— устойчивость к фуксину и тионину;

• способность аглютинироваться монорецепторными A.MuRбруцеллезными сыворотками:

9.3.1 Образование сероводорода (H₂S)

9.3.1.1 Подготовка к исследованию

В качестве реактива применяют насыщенный водный раствор уксуснокислого свинца (30 г свинца растворяют в 100 см 3 дистиллированной воды), которым пропитывают полоски фильтровальной бумаги размером 1 * 8 см. Пропитанные полоски фильтровальной бумаги высушивают при температуре ^ С — 20 °С в течение 20 мин.

Срок хранения пропитанных полосок фильтровальной бумаги в банке из темного стекла с притертой пробкой — не более 2 мес.

9.3.1.2 Проведение исследования

Двухсуточную взвесь культуры бруцелл по 9.1.1 в физиологическом растворе концентрацией 2 * 10*/см 3 микробных клеток по оптическому стандарту мутности на 10 ЕД засевают в пробирку бактериологической петлей на скошенную поверхность печеночного агара ло 6.2.4. Полоску фильтровальной бумаги зажимают между пробиркой и ватной пробкой так. чтобы нижний ее конец свободно свисал над верхним краем посева и не касался поверхности питательной среды.

Ватная пробка должна быть рыхлой, не задерживать выхода из пробирки углекислоты.

Пробирки с посевами помещают в термостат при температуре 37 °С — 38 Л С на 6 сут.

Показателем интенсивности образования сероводорода является почернение нижнего конца полоски, которое измеряют в миллиметрах.

Результаты учитывают через каждые 2 сут в течение 6 сут. При каждом учете тест-полоску заменяют новой. Для окончательной оценки способности культуры к образованию сероводорода полученные три значения суммируют.

Суммарное значение почернения тест-полосок, свидетельствующее о продуцировании сероводорода. составляет для культур:

• В. abortus (биовар 1) — 5-7 мм:

Культура В. metoensis (биоеар 1), как правило, не образует сероводорода или вызывает только слабо выраженное почернение тест-лолосхи. Культуры В. ovis и в .canis сероводород не продуцируют.

9.3.2 Определение редуцирующей активности в отношении красок

9.3.2.1 Подготовка к исследованию

Для приготовления исходных растворов фуксина и тионика в разведении 1:1000 во флаконах вместимостью 200 см 3 смешивают 0.1 г краски. 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 80 см Ь дистиллированной воды.

Срок хранения исходных растворов фуксина и тионина в темном месте — не более 6 — 10 мес.

Для приготовления питательной среды МППГГА с красками к 100 см 3 охлажденного до температуры 50 °С — 60 °С агара с соблюдением правил асептики добавляют 2 см 3 исходного раствора краски для получения разведения 1:50000.

Питательную среду с краской разливают пипеткой по 20 — 25 см 3 в чашки Петри и подсушивают при комнатной температуре, не открывая чашки.

Срок хранения среды с красками в холодильнике при температуре от 2 9 С до 8 “С — не более 10— 15сут.

Обесцвеченные среды для тестирования не используют.

9.3.2.2 Проведение исследования

Взвесь бруцепл готовят из двухсуточной агаровой культуры. Посевы испытуемых культур проводят бактериологической петлей из взвеси, содержащей 2 млрд/см 3 микробных клеток, на среду МППГГА с фуксином и тиоником по 9.4.2.1 и на среду МППГГА без добавления красок (контроль). Одну петлю взвеси засевают путем нанесения пяти отдельных штрихов на поверхность агара. На одну чашку Петри можно одновременно засевать четыре—шесть культур, предварительно разделив чашку Петри на четыре—шесть секторов.

Чашки с посевами переворачивают агаром вверх и выдерживают в термостате при температуре 37 °С — 38 9 С в течение 3 сут.

Учет результатов проводят через трое суток инкубации по следующей схеме:

• выраженный рост культуры во всех штрихах «♦+♦+»;

• выраженный рост в первых двух и более слабый в последующих штрихах «++♦»;

• умеренно выраженный рост в первых двух штрихах и слабый или отсутствие роста в остальных штрихах «++»:

• слабый сплошной рост или отдельные колонии в первых двух штрихах «+».

9.3.3 Реакция агглютинации с монорецепторными А и М бруцеллезными сыворотками

9.3.3.1 Проведение испытания

Для проведения РА монорецепторные А и М бруцеллезные сыворотки разводят последовательно двукратно, получая соотношения 1:5,1:10.1:20.1:40 и 1:80 в объеме 0.5 см 3 . В качестве антигена используют взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе е концентрации 2 млрд/см 3 микробных клеток по оптическому стандарту мутности.

Антиген добавляют по 0.5 см 3 во все пробирки таким образом, разведение сыворотки удваивается (1:10.1:20 ит. д.).

Пробирки со смесью сыворотки и антигена выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16 —18 ч. а затем в течение 1 ч при комнатной температуре.

Положительная РА в разведении сыворотки 1:20 с оценкой не менее чем на два креста позволяет отнести культуру бруцеллы к виду B.abortus или В. malitensis.

9.3.4 Определение чувствительности культур бруцелл к фагу ТЪ

Бруцеллезный фаг ТЬ избирательно лизирует бруцеллы вида В. abortus, находящиеся в S-форме.

9.3.4.1 Подготовка к исследованию

Для определения чувствительности бруцелл к лизису бактериофагом используют два его разведения: 1 * 10 s корпускул/см 3 и 1 ■ 10 е корпускуп/см 3 . Разведения бактериофага готовят путем десятикратных разведений исходной культуры в физиологическом растворе.

9.3.4.2 Проведение исследования

Для исследования используют МППГГА в чашках Петри с концентрацией агара 1.5 % —1.8 %. Среду и взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с концентрацией 1 млрд/см 3 микробных клеток по ОСО мутности на 10Е подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 ч.

Взвесь культуры бруцепл подсушивают при комнатной температуре в течение 18 — 20 ч. в объеме 0.4 • 0.5 см 3 наносят на поверхность МППГТА в чашках Петри и тщательно распределяют по его поверхности. Избыток посевного материала удаляют пастеровской пипеткой.

Засеянные чашки Петри подсушивают в течение 1 ч при температуре 37 °С — 38 °С до полного впитывания в агар посевного материала. После чего на поверхность питательной среды в два разных места наносят пастеровской пипеткой по одной капле 0.05 см 3 бактериофага каждого разведения. Чашки наклоняют, чтобы капли бактериофага стекли по поверхности питательной среды двумя дорожками. Контролем являются посевы культуры бруцелл на среде без внесения бактериофага. Посевы помещают в термостат агаром вверх и инкубируют в течение четырех —пяти суток при температуре 37 °С — 38 °С.

Результаты исследования учитывают в крестах:

• полный лизис культуры на месте нанесения фага (или линии стекания)

• лизис с небольшим количеством отдельных колоний бруцелл или слившиеся бляшки (участок лизиса) в виде сот

• резко ослабленный рост культуры бруцелл и небольшое количество бляшек «+•*■»;

• очень слабый лизис культуры бруцелл «+»:

— отсутствие лизиса культуры бруцелл «-».

За положительный результат чувствительности к лизису фагом принимают лизис культуры бруцелл не менее чем на два креста.

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода вгисеНа приведены в приложении А.

10.1 Подготовка к исследованию

Для постановки биологической пробы используют морских свинок (не менее двух животных), не реагирующих на бруцеллез при серологическом исследовании в пробирочной РА. Пробы сыворотки крови от животных в разведении 1:5 не должны агглютинировать S-бруцеллезный антиген.

10.2 Проведение исследования

Из органов и содержимого желудка абортированного плода готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе в соотношении 1:10 и вводят морской свинке подкожно с внутренней стороны бедра в объеме 1 см 3 .

Из плаценты и плодовых оболочек, предварительно обработанных тампонами, смоченными дезинфицирующим раствором, и подсушенных сухими стерильными тампонами, вырезают кусочки размером 0.5 х 0.5 см. фламбируют на пламени горелки, растирают в фарфоровой ступке со стерильным песком или гомогенизируют и заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят морской свинке подкожно в объеме 1 см 3 .

Содержимое гигром, бурс вводят морским свинкам подкожно в объеме 0.2 — 0.3 см 3 . При этом необходимо учитывать возможность гибели животного от сопутствующей микрофлоры, особенно стрептококков.

Пробы молока центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об7мин. Морской свинке вводят подкожно 2 — 3 см 3 материала из верхнего слоя (сливки) и осадка молока после центрифугирования.

Через 15, 25 и 40 сут после заражения у морских свинок берут кровь в объеме 1—2 см 3 из ушной вены путем надреза или из сердца путем пункции и готовят сыворотку, которую исследуют в РА в пробирках в разведениях от 1:10 до 1:80.

При положительной реакции агглютинации в разведении 1:10 и выше морских свинок убивают. В случае необходимости получения культуры возбудителя материал от них исследуют бактериологически (раздел 8). высевы делают пастеровскими пипетками в одну пробирку с бульоном и две пробирки с агаром из паховых, подчелюстных, заглоточных, парааортальных лимфатических узлов (правых и левых), селезенки (два высева), печени и костного мозга. Посевы культивируют по 8.3.8.

При отрицательной РА у морских свинок биопробу считают отрицательной, подопытных животных убивают, бактериологическое исследование не проводят.

При выделении культуры бруцелл на питательных средах биологическое исследование прекращают. а ранее зараженных морских свинок убивают.

Результат исследования на бруцеллез считают положительным при получении у морской свинки положительной РА в разведении сыворотки крови 1:10 и выше, даже если из исходного материала культура бруцелл не выделена.

11 Молекулярно-генетический метод исследований

11.1 Молекулярно-генетическое исследование на бруцеллез проводят е полимеразной цепной реакции (ПЦР). руководствуясь инструкциями по применению конкретных тест-систем.

11.2 Молекулярно-генетическое исследование методом ПЦР проводят в случае аборта и (или) при появлении у животных других клинических признаков, вызывающих подозрение на бруцеллез, а также при получении положительных и (или) сомнительных результатов серологического исследования на бруцеллез животных, не иммунизированных противобруцеллезными вакцинами из хозяйств, благополучных по данному заболеванию и для идентификации культур бруцепл (изолятов), выделенных при исследовании патологического материала.

11.3 Для исследования в ПЦР используют тот же патологический материал, что и для бактериологической диагностики.

Дифференциальные свойства видов и биоваров рода Brucella А.1 Дифференциальные свойства видов и биоваров рода ВгисоНо приведены в таблице А.1.

источник