Ботулизм— пищевое отравление, вызываемое токсином (экзотоксином) Cl.Botulinum. Характеризуется тяжелым течением с поражением центральной нервной системы и высокой летальностью. Токсин палочки ботулизма превосходит по интенсивности воздействия все известные человеку природные яды. Он является основным патогенетическим фактором при этом заболевании. Экспертами ВОЗ ботулизм отнесен к группе бактериальных пищевых интоксикаций.
Характеристика возбудителя — продуцента экзотоксина. В настоящее время известно 7 типов возбудителя ботулизма: A, B, C,D, E, F, I. Они близки но морфологическим, культуральным свойствам к действию токсинов на организм человека, но обладают различными антигенными качествами. Токсин каждого типа нейтрализуется лишь соответствующей типоспецифической антитоксической сывороткой.
В пищевых продуктах, почве, кормах, искусственных питательных средах возбудитель ботулизма образует споры, обладающие выраженной резистентностью к воздействию факторов внешней среды. Они могут выдерживать кипячение в течение 5-6 ч. Наиболее устойчивы к высокой температуре споры типов A, B, F, наименее — типа Е. При температуре 120° С споры погибают через 20 минут экспозиции. Замораживание даже при температуре -190°С не оказывает на них губительного действия. В продуктах содержащих 14% поваренной соли, споры остаются жизнеспособными в течение 2 мес.
Для роста и размножения бактерий типа А, В, С, D оптимальной является температура 35° С, для типов Е и F 28 — 30° С. Ботулинический токсин активно образуется при температуре выше 22° С. Оптимальная температура — 30 — 35° С. Эти микроорганизмы могут размножаться и вырабатывать токсины и при более низких температурах: 10° С (типы А и В) и даже 4° С (типы Е и F). В этих условиях значительное количество токсинов накапливаются за 30-45 дней.
Важным фактором, ограничивающим размножение бактерий, является кислотность среды. До недавнего времени считали, что величина рН продукта, ограничивающая развитие Сl. Botulinum типов А и В, соответствует 4,5, CI. Botulinum типа Е — 4,7. Однако в последние годы появились сообщения о возможности развития возбудителей ботулизма в пюре из абрикосов при рН 3,8, в грибном соусе при рН 4,1, в солянке овоще-грибной и картофеле тушеном с грибами при рН 4,2. Образование ботулинического токсина задерживается при наличии в продукте более 11% поваренной соли. Токсины возбудителя ботулизма устойчивы к температурному воздействию: они разрушаются при температуре 58° С за 3 ч, при 80° С — за 30 мин, при кипячении за 10-15 мин.
Споры после длительного хранения в замороженном состоянии сохраняют способность прорастать и образовывать токсин.
Палочка ботулизма широко распространена в природе — в почве, кишечнике животных и рыб, на овощах, фруктах. В различных географических зонах она обнаружена в 0,9-46,5% исследуемых проб почвы. По данным зарубежных авторов, количество образцов почвы, содержащих возбудитель ботулизма, достигает 70%.
Эпидемиология. Возбудитель ботулизма — типичный анаэроб, он интенсивно размножается с накоплением экзотоксина в анаэробных условиях — в герметически закрытых банках, внутри больших кусков рыбы, копченостей, колбасы, ветчины. Анаэробные условия могут создаться в продуктах и при доступе воздуха в тех случаях, когда последние обильно обсеменены размножающейся и использующей тканевой кислород аэробной микрофлорой.
Большинство консервов (мясных, рыбных, овощных) являются благоприятной средой для размножения и токсинообразования палочки ботулизма.
Согласно данным литературы, консервы, в которых образовался ботулинический токсин чаще имеет вид испорченных, в них происходит деструкция тканей, появляется неприятный запах, образуется газ, в герметически укупоренных банках возникает деформация — бомбаж. Однако развитие анаэробных бактерий не всегда сопровождается газообразованием и бомбажом, часто консервы сохраняют нормальный внешний вид. Имеются наблюдения, свидетельствующие об отсутствии изменений органолептических свойств и бомбажа у консервов, вызвавших ботулизм.
Ботулизм может вызвать употребление соленой, копченой, вяленой, маринованной рыбы частиковых пород (подлещик, окунь, карась и др.) домашней заготовки. Нередко причиной отравления бывает употребление изготовленных в домашних условиях сырокопченых окороков, сала, ветчины. Регистрируются заболевания ботулизмом, связанные с разнообразными консервами домашнего изготовления (маринованные баклажаны, баклажанная икра, свекла, помидоры, черешня, томатный сок, абрикосовый компот и др.) в герметически укупоренных банках. Значительная часть отравлений связана с употреблением грибов, консервированных в домашних условиях.
Наиболее часто отмечаются заболевания, обусловленные CI.botulinum типов А, В, Е. Штаммы CI. botulinum типа Е и некоторые штаммы типов В кроме токсинов могут вырабатывать протоксин, который под действием ферментов трипсина, панкреатина или микробных протеаз становится в 100 раз активнее. Обладая низкой токсичностью в лабораторных условиях, CI.botulinum типа Е приобретает способность вызывать заболевания с летальным исходом при вспышке ботулизма.
Клиника. Заболевания ботулизмом в большинстве случаев протекают тяжело и нередко заканчиваются летально. Смертельные исходы связаны с глубокими поражениями нервной системы, которые интенсивно нарастают и требуют безотлагательного комплекса терапевтических мероприятий. Для клинической картины ботулизма характерны расстройства зрения, глотания, артикуляции, фонации, дыхания и сердечной деятельности. Первыми поражаются мышцы, иннервируемые черепно-мозговыми нервами. Характерно развитие нисходящих параличей, начинающихся чаще всего с поражения мускулатуры глаз.
Признаки заболевания возникают через 12-36 ч и раньше. Иногда инкубационный период составляет 8- 10 дней. Больные отмечают недомогание, слабость, головную боль, головокружение. Первые признаки — ослабление зрения, «туман», «сетка», двоение предметов. Появляется нистагм, расстройство аккомодации. Затем наступает затруднение глотания и речи. Сознание сохранено. Температура нормальная или субфибрильная. Смерть может наступить через 2-3 дня. Летальность при отсутствии специфической терапии составляет 40-50%. Наиболее тяжелые отравления связаны с ботулиническим токсином типа А, летальность при котором достигает 60-70%. Летальность, связанная с воздействием токсина типа В, составляет 10-30%.
Диагностика. Симптомы начального периода заболевания разнообразны, поэтому диагностика ботулизма особенно трудна в его первые часы, а иногда и дни, что очень важно для своевременного применения типоспецифической противоботулинической сыворотки.
Лабораторная диагностика базируется на обнаружении ботулинического токсина или возбудителя ботулизма в пищевых продуктах, которые вызвали отравление, а также биологических субстратах, взятых от больного (кровь, рвотные массы, промывные воды, испражнения), или в материале, полученном при патологоанатомическом исследовании. Важно не только установить присутствие ботулинического токсина или микроорганизма, но и определить их тип.
Для обнаружения ботулинического токсина ставят реакцию нейтрализации с антитоксической сывороткой.
Профилактика. Мероприятия по предупреждению отравлений ботулизмом при изготовлении продуктов питания в промышленных и домашних условиях можно объединить в три группы: 1) защита от попадания возбудителя; 2) правильная тепловая обработка: 3) предупреждение возможности прорастания спор (стерилизация) и инактивация токсина в готовом продукте.
Широкое распространение возбудителя ботулизма в окружающей среде, а также условия размножения и токсинообразования требуют осуществления постоянного санитарного надзора за производством консервов, особенно низкокислотной продукции, строгого выполнения существующих технологических инструкций и санитарных правил. Основные меры предупреждения ботулизма при промышленном производстве баночных консервов заключается в следующем: поддержание хорошего санитарного состояния аппаратуры и оборудования; использование питьевой воды, не содержащей анаэробных микроорганизмов; тщательная мойка сырья и вспомогательных материалов, переработка продуктов в условиях исключающих развитие возбудителей ботулизма; установление кислотности готовых продуктов не ниже определенного уровня; упаковка продуктов в проверенную на герметичность тару и контроль работы закаточных машин; применение режимов стерилизации, обеспечивающих гибель спор возбудителя ботулизма.
Консервы, приготовленные в домашних условиях, хранящиеся в герметической упаковке, перед едой необходимо прокипятить в течение 15-20 мин. и употреблять в тот же день. Сырокопченые окорока домашней заготовки перед употреблением следует обязательно подвергать тепловой обработке (отваривать или прожаривать). Если консервы после вскрытия имеют изменения органолептических свойств, указывающих на порчу, употреблять их нельзя.
Необходимо проводить широкую пропаганду среди населения знаний о гигиенических требованиях к домашнему консервированию продуктов питания. При этом следует делать акцент на недопустимость консервирования в домашних условиях с герметичной упаковкой мяса, рыбы, а также стелющихся по земле растений, зелени, овощей, которые трудно отмыть от почвы (укроп, морковь и др.). Недопустимо также герметически укупоривать банки с грибами в домашних условиях.
Засолку и маринование грибов необходимо производить в кадках или бочонках в кислом маринаде с добавлением поваренной соли из расчета 2 столовые ложки на 1 л воды и 2 столовые ложки 80% уксусной эссенции на 1 л грибов с рассолом. Перед употреблением грибы промывают горячей водой, затем для них готовят свежий маринад по вкусу или жарят. Консервировать овощи (огурцы, зеленый горошек и др.), не содержащие естественной кислоты можно только при добавлении кислоты по рецептуре. Необходимо строго соблюдать чистоту при обработке сырья, недопустимо консервировать лежалые, подвергшиеся порче овощи и фрукты. Нужно строго соблюдать правила обработки банок, крышек и режим тепловой обработки продуктов в домашних условиях. Хранить домашние консервы обязательно на холоде (0 -3°С) с отбраковкой и уничтожением бомбажных банок.
Меры по профилактике ботулизма при производстве рыбопродуктов сводятся к переработке свежей, не загрязненной рыбы и соблюдению установленных соответствующими инструкциями санитарных и технологических режимов производства. Балыки из рыбы осетровых пород следует готовить только из специально приготовленной живой, здоровой, выпотрошенной немедденно после улова рыбы. Домашний посол рыбы осетровых пород не разрешается. Необходимо вести пропаганду знаний о рыбном ботулизме среди населения.
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
источник
Возбудитель ботулизма (лат. botulus — колбаса, botulism — отравление колбасным ядом) — Clostridium botulinum был открыт в Голландии Э. ван Эрменгемом в 1896 г. Он был выделен из ветчины, послужившей источником отравления 34 человек, и органов умерших людей.В Западной Европе ботулизм в прошлом был связан с употреблением колбасных изделий, в Америке — овощных консервов, в России — красной рыбы и грибов домашнего консервирования.
Морфология. Возбудитель ботулизма представляет собой крупную с закругленными концами полиморфную палочку длиной 4,4 — 8,6 мкм и шириной 0,3 — 1,3 мкм, которая иногда образует короткие формы или длинные нити; слабоподвижна, имеет от 4 до 30 жгутиков; во внешней среде продуцирует овальные споры, расположенные субтерминально, придающие микробу вид теннисной ракетки; грамположительна.
Культивирование. Клостридии ботулизма — строгие анаэробы, оптимальная температура роста для сероваров А, В, С, D, F — 30 – 40 °С, для серовара Е — 25 – 37 °С, для серовара G — 30 – 37 °С; выращиваются в обычных средах, рН 7,3 — 7,6, лучше в мясной или мозговой кашице, которая темнеет; культуры издают острый запах прогорклого масла. На глюкозо-кровяном агаре Цейсслера микробы развиваются в виде неправильной формы колоний с отростками или тонкими нитевидными ответвлениями; вокруг колоний образуются зоны гемолиза. В агаре столбиком колонии напоминают комочки ваты или компактные скопления с нитевидными отростками.На желатине возбудители ботулизма образуют круглые прозрачные колонии, окруженные небольшими зонами разжижения; в дальнейшем колонии становятся мутными, бурыми, с отростками в виде шипов.В печеночном бульоне клостридии вначале растут с образованием мути, затем появляется компактный осадок на дне и жидкость просветляется.
Ферментативные свойства. Клостридии ботулизма (серовары А и В) обладают лецитиназной активноью, расщепляют в жидкой среде кусочки тканей и яичный белок, разжижают желатин, образуют сероводород, аммиак, молоко пептонизируют, ферментируют с выделением кислоты и газа глюкозу, мальтозу, глицерин.
Токсинообразование. Клостридии ботулизма продуцируют экзотоксин (нейротоксин) очень большой силы действия. Токсинообразование происходит при благоприятных условиях в культурах и пищевых продуктах (мясные, рыбные, овощные), а также в организме животных и человека. Содержание хлорида натрия в концентрации 6 – 8 %, а также кислая среда препятствуют размножению микроба и накоплению токсина. Нагревание до 90 (С 40 мин или кипячение в течение 10 мин разрушают токсин.Ботулинический экзотоксин в отличие от столбнячного и дифтерийного устойчив к действию желудочного сока и всасывается неизмененным. Экзотоксин типа Е активируется трипсином, в результате чего биологическая его активность в кишечнике возрастает во много раз. Очищенный токсин возбудителя ботулизма типа А в 1 мг содержит 10 — 100 млн. Dlm для белой мыши. Экзотоксин ботулизма получен в кристаллическом состоянии, сила его действия превосходит все известные до сих пор биологические яды. Ботулинический токсин является глобулином и не изменяется при рекристаллизации.
Антигенная структура и класификация. Установлено наличие семи сероваров возбудителя ботулизма: А, В, С , D, Е, F и G. Наибольшей силой токсического действия для человека обладают серовары А, В, Е, F. Каждый серовар характеризуется специфической иммуногенностью и нейтрализуется соответствующим антитоксином. O-антиген является общим для всех сероваров.
Резистентность. Вегетативные формы возбудителя погибают при 80 °С за 30 мин, споры выдерживают кипячение от 90 мин до 6 ч, при температуре 115°С они гибнут в продолжение 5 — 40 мин, при 120°С — за 3 — 22 мин. В больших кусках мяса, в банках большой емкости они могут оставаться живыми и после автоклавирования их при 120°С в течение 15 мин. В 5 % растворе фенола споры сохраняются до 1 сут, в культурах — до 1 года.
Патогенность для животных. К токсину возбудителя ботулизма чувствительны лошади, крупный рогатый и мелкий скот, норки, птицы, которые с испражнениями выделяют во внешнюю среду споры клостридии ботулизма; из экспериментальных животных восприимчивы морские свинки, белые мыши, кошки, кролики, собаки.
Патогенез заболевания у человека. Причиной отравления является употребление в пищу мясных продуктов, овощных и рыбных консервов, колбасы, ветчины, соленой и копченой красной рыбы, кур, уток и других продуктов, инфицированных возбудителями ботулизма. Микроорганизмы попадают в почву с фекалиями животных (лошадей, крупного рогатого скота, норок, а также домашних и диких птиц) и рыб и выживают там в виде спор.
Были установлены естественные заболевания ботулизмом среди уток и других диких птиц. Обширные эпизоотии бывают в западных областях Канады, в Уругвае, и в США.
Природные очаги возникают на территориях, где имеются стоячие водоемы, богатые фитопланктоном, который обеспечивает благоприятные условия для анаэробиоза при теплой погоде. Интенсивные процессы распада сопровождаются поглощением кислорода, которое способствует росту серовара C клостридий ботулизма и продукции высоких концентраций экзотоксина в воде и щелочном иле болот. Помимо птиц, ботулизмом могут также поражаться ондатры и лягушки. Миграция птиц приводит к распространению возбудителя ботулизма из природных очагов во время их перелетов.
Споры клостридии ботулизма обнаруживают не только в культивированной, но и в необработанной почве. Они выделены в 70% проб почвы в Калифорнии, в 40% — на Северном Кавказе, их находили в прибрежной почве Азовского моря, в иле и морской воде, на поверхности овощей и фруктов, в кишечнике здоровых животных, в 5,4 % случаев — в кищечнике свежей красной рыбы (осетр, белуга и др.), в 15 — 20% — в кишечнике и в 20% случаев — в тканях уснувшей рыбы.
Патологический процесс обусловливается экзотоксином, который всасывается через кишечник, поступает в кровь, поражает ядра продолговатого мозга, сердечно-сосудистую систему и мышцы. Установлено проникновение через раневую поверхность спор клостридии ботулизма. Раньше ботулизм считали чистым токсикозом. В настоящее время доказано, что клостридии обнаруживаются в различных органах погибших от ботулизма людей; споры, проникшие в раны, вызывают клиническую картину ботулизма, такую же, как и при пищевой интоксикации.
При ботулизме инкубационный период продолжается от 2 ч до 10 сут, чаще всего 18 — 24 ч.
Симптомы ботулизма включают головокружение, головную боль, и, иногда, рвоту. Наступает паралич глазных мышц, нарушение аккомодации, расширение зрачков и двоение в глазах. Также развиваются затруднения при глотании, афония и глухота. Смертность очень высока (40-60 процентов).
Иммунитет. Болезнь не оставляет устойчивого антиинфекционного иммунитета (антитоксического и антибактериального).
Лабораторная диагностика. Объектами исследования служат остатки пищи, обусловившей отравление, кровь, моча, рвотаые массы, испражнения, промывные воды, а от трупа — содержимое желудка, отрезки тонких и толстых кишок, лимфатические узлы, головной и спинной мозг.
Исследуемый материал засевают на питательную среду Китта — Тароцци. Половину пробирок с посевами для освобождения от посторонней аспорогенной микрофлоры прогревают при 80 °С в течение 20 мин и создают анаэробные условия. Выделенную чистую культуру идентифицируют по культуральным, биохимическим и токсигенным свойствам.
Для обнаружения токсина подкожно или внутрибрюшинно вводят белым мышам или морским свинкам фильтрат бульонных культур, кровь, мочу больных или вытяжки из остатков пищи, причем одну группу контрольных животных заражают негретым материалом, вторую — гретым на водяной бане при 100°С в течение 30 мин.
Кроме этого, трем подопытным животным вводят соответственно фильтрат и антитоксическую сыворотку А, фильтрат и антитоксическую сыворотку В, фильтрат и антитоксическую сыворотку Е. Не гибнут животные, получившие прогретый материал и смесь, нейтрализованную антитоксином.
Применяют также реакцию непрямой гемагглютинации и метод фагоцитарного показателя по Минервину.
Лечение. Больным ботулизмом промывают желудок раствором перманганата калия. Внутримышечно (внутривенно или в спинномозговой канал) дробно вводят поливалентную сыворотку трех сероваров (А, В, Е), после установления серовара возбудителя впрыскивают по 10 000 ME сыворотки сероваров А, Ей 5000 ME сыворотки серовара В; при отсутствии улучшения инъекции сыворотки делают через 5 — 10 ч в тех же дозах. Всем остальным лицам, принимавшим пищу, явившуюся причиной заболевания хотя бы одного человека, сыворотку назначают с профилактической целью в дозе 1000 или 2000 ME каждого типа. Для выработки активного иммунитета одновременно с сывороткой вводят и ботулинический анатоксин по 0,5 мл каждого типа, троекратно, с интервалом в 3 — 5 дней. Из антибиотиков рекомендуют пенициллин, тетрациклин.
Профилактика. В предупреждении ботулизма большое значение имеет правильная технология обработки продуктов на предприятиях пищевой промышленности, особенно консервов из мяса, рыбы и овощей, а также при копчении и солении рыбы, изготовлении колбасных изделий. Весьма опасны рыбные продукты домашнего копчения и соления, а также консервированные грибы, низкокислотные консервы (огурцы, перец, баклажанная икра), компоты абрикосовые и др.
Варить мясо, рыбу рекомендуется небольшими кусками, не допускать хранения продуктов (окороки, балыки) большим объемом и многослойно, не производить консервов массой более 0,5 кг. Клостридии ботулизма, сохранившиеся после стерилизации, вызывают вздутие банок (бомбаж). Содержимое их издает запах прогорклого масла. Такие консервы нельзя выпускать в продажу, они подлежат изъятию и тщательному исследованию. Засолку рыбы производят в крепком солевом растворе (тузлук) не ниже 10 %. Консервы хранят в холодном месте.
В связи с широким распространением возбудителей ботулизма в природе некоторые авторы рекомендуют проводить активную иммунизацию ботулиническим анатоксином людей, лошадей и коров.
Благодаря непрерывному повышению материального благосостояния, совершенствованию технологических процессов по обработке и консервированию пищевых продуктов, соблюдению санитарно-гигиенических правил и строгому государственному и санитарному контролю за производством, хранением и реализацией пищевых продуктов ботулизм в Украине стал исключительно редким заболеванием.
источник
Глава VI
Лабораторная диагностика ботулизма
Лабораторная диагностика преследует цель обнаружить ботулинический токсин или возбудителя ботулизма в материалах, взятых от больного (кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, кал и др.) или в органах из трупа (печень, желудок и кишечник с содержимым), а также в пищевых продуктах, которые вызвали отравление. При этом важно установить не только присутствие токсина или микроба, но и определить их тип, чтобы подтвердить клинический диагноз, назначить правильное лечение.
Быстрая и точная лабораторная диагностика ботулизма важна для начала раннего специфического лечения, для профилактики ботулизма у лиц, употреблявших продукты, которые вызвали отравление, а также для изучения эпидемиологии ботулизма. Чем быстрее при лабораторных наследовалиях крови, выделений больных и пищевых продуктов, послуживших причиной отравления, будет обнаружен ботулинический токсин и определен его тип, тем раньше больному будет введена типоспецифическая противоботулиническая сыворотка.
Материал для исследования, отбор проб
Во всех случаях заболевания с симптомами, характерными для ботулизма, исследуют промывные воды желудка, рвотные массы, кал и кровь.
Кровь от больного необходимо брать до введения ему лечебной сыворотки в количестве 6-8 мл из вены в стерильную пробирку. Для лучшего формирования сгустка кровь нужно обвести по стенкам пробирки капилляром пастеровской пипетки, после чего выдержать в термостате 20 минут. Кровь можно брать также с 4% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 3 : 1.
Промывные воды желудка берутся в объеме 50-100 мл, а кал — в количестве 50-60 г в стеклянные банки, закрывающиеся резиновыми или корковыми пробками; консервирующие вещества добавлять нельзя. На банки с пробками наклеиваются этикетки: какой материал посылается, от кого взят и дата взятия материала. Банки при транспортировке должны быть тщательно упакованы. В сопроводительном документе необходимо указать фамилию, имя, отчество и возраст пострадавшего, дату заболевания, предполагаемый диагноз, кратко клинические симптомы, дату взятия пробы и подпись лица, направляющего материал.
Материал, подлежащий исследованию, должен храниться на холоде, так как ботулинический токсин частично разрушается при комнатной температуре.
Из трупов на исследование необходимо брать кусочек печени весом 50-60 г, обрезки тонкого кишечника и желудка с содержимым, кровь (8-10 мл). Пробы из органов берут в стерильных условиях: поверхность органа прижигается раскаленным шпателем и затем стерильными ножницами из глубины вырезается кусочек органа. Пробы из каждого органа берутся в отдельные банки, закрытые пробками или крышками.
Сырье и готовую продукцию на предприятиях консервной промышленности проверяют на наличие возбудителей ботулизма согласно действующей «Инструкции о порядке санитарно-технического контроля производства консервов», утвержденной Министерством здравоохранения СССР от 28 ноября 1963 г. N 456-63.
Лабораторно проверяются на содержание возбудителя и токсина ботулизма также продукты, остатки продукта после употребления при всех случаях пищевых отравлений с симптомами, напоминающими ботулизм, даже при легких формах клинического течения, а также при всех случаях тяжелых пищевых отравлений наряду с исследованиями на сальмонеллы, стафилококки и группу Cl. perfringens.
Следует иметь в виду, что пищевые продукты, вызвавшие отравление и зараженные возбудителем ботулизма, часто бывают не изменены по виду, запаху и вкусу. Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла. Банки с консервами могут быть вздуты («бомбаж»).
Материал для исследования берется с соблюдением условий стерильности в стеклянную посуду и закрывается плотно пригнанными стеклянными, резиновыми, корковыми или завинчивающимися пробками. Твердые объекты могут пересылаться завернутыми в несколько слоев вощаной или пергаментной бумаги.
При отсутствии стерильной посуды образцы отбирают в любые банки после предварительного 15-минутного кипячения их. Материал для исследования берут в количестве не менее 100 г. По возможности следует брать несколько проб из различных мест.
При невозможности отбора образцов в рекомендованных количествах выемка проб может производиться и в меньших количествах. К взятым пробам нельзя добавлять консервирующие вещества.
На пробы наклеивают этикетки, пробы нумеруют, опечатывают и тщательно упаковывают. Пересылка проб должна производиться в кратчайший срок и материал до исследования должен сохраняться на холоде.
Пробы, поступившие в лабораторию, исследуются одновременно по двум направлениям: производится обнаружение ботулинических токсинов и выделение ботулинических микробов. Одновременно эти же пробы должны исследоваться на группу Cl. perfringens.
Обнаружение ботулинических токсинов
Промывные воды желудка при наличии в них комочков пищи растираются в стерильной ступке. Две трети этой растертой пробы предназначаются для обнаружения ботулинических токсинов, одна треть — для выделения ботулинических микробов.
Первую часть растертой пробы выдерживают при комнатной температуре 1-1 1/2 часа для экстрагирования. Затем экстрат фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 оборотах в минуту (об/мин) в течение 15-20 минут. Полученный фильтрат или центрифугат используется для постановки реакции нейтрализации.
Цитратная кровь или сыворотка крови больного без предварительного разведения исследуется на наличие ботулинических токсинов с помощью реакции нейтрализации, причем цитратную кровь можно вводить мышам только внутрибрюшинно.
Для обнаружения токсинов в испражнениях больного кал берется в количестве 10-15 г, растирается в стерильной ступке с двойным объемом физиологического раствора и выдерживается при комнатной температуре в течение 1-1 1/2 часов для экстрагирования токсинов. Затем жидкость фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется и используется для постановки реакции нейтрализации. Экстраты из органов трупа приготовляются аналогично.
Для обнаружения токсина следует взять 4 мышей весом 16-18 г. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один из известных типов ботулинических токсинов, то предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типов А, В, С, Е, F.
Двум мышам вводится исследуемый фильтрат или центрифугат в количестве 0,5-0,8 мл. внутрибрюшинно или внутривенно в хвостовую вену (внутривенно вводится только центрифугат). Другой паре вводится смесь, состоящая из 0,5-0,8 мл испытуемого материала и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулических сывороток типов А, В, С, Е, F (по 0,04 мл сыворотки каждого типа). С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах:
Доза сыворотки, которая рекомендуется для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологического токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также экстрактах из пищевых продуктов очень сильные токсины почти не встречаются.
Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.
Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживается при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество исследуемого материала, вводимого животным с сывороткой и без сыворотки, должно быть одинаковым. Наблюдение за животными ведется в течение 4 дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставится реакция нейтрализации с моновалентными сыворотками.
Следует помнить, что ботулинический токсин не дает молниеносной гибели (в течение нескольких минут или секунд).
При наличии ботулинического токсина погибают две мыши, которым вводился не смешанный с сыворотками фильтрат, остальные остаются живы.
Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение мышц брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.
В случае гибели всех 4 мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).
Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250-300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток А, В, С, Е, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или центрифугата), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.
В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставится развернутая реакция нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифичесиими диагностическими сыворотками. В 6 пробирок разливают по 2, 4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа А, во вторую — типа В, в третью — типа С, в четвертую- типа Е, в пятую — типа F и в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или вдутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки (см. типовой протокол).
Для каждой сыворотки берется отдельный шприц. Учет результатов проводится через 4-6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4 дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологической сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.
Типовой протокол постановки развернутой реакции нейтрализации
Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки N 1, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа А.
Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как обычно ее бывает мало. Следует тщательно отделить сыворотку от сгустка крови (сгусток крови необходимо посеять, так как при ботулизме можно обнаружить в крови палочку ботулизма) и с сывороткой поставить реакцию нейтрализации. В этом случае можно сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками типов А, В, Е (остальные типы ботулизма встречаются очень редко). Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа А — 0,4 мл, во вторую — типа В, в третью — типа Е. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного; контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.
При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дается заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывается его тип.
В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа Е в известной мере нейтрализует и ботулинический токсин типа F. При получении положительной реакции с противоботулинической сывороткой типа Е следует дополнительно провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу Е или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа Е и типа F. Для этого в три пробирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа Е, во вторую — 0,6 мл типа F, в третью, контрольную — 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа Е, то в экстракте имеется токсин типа F, если же погибают наряду с контролем и мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой Е, то в экстракте токсин типа Е.
Обнаружение возбудителей ботулизма
Для обнаружения возбудителей ботулизма производится посев на жидкие питательные среды. Для первичных посевов лучше использовать казеиново-грибную среду, бульон Хоттингера или пепсин-пептонный бульон с 0,5% глюкозы (см. среды для анаэробов)*(4). Необходимо, чтобы рН был в пределах 7,2-7,4. Обязательным является также наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиново-грибной среде — отварного пшена и ваты.
Для выделения возбудителей ботулизма наиболее подходящей средой является мясная среда типа Тароцци. На казеиново-грибной среде все типы возбудителей ботулизма также дают хороший рост и продуцируют токсины значительной силы.
Посевы должны производиться в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100-200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см. Следует особенно помнить о том, что засевать исходный посевной материал следует в большой объем среды (70,0-150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватило на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нетрализации, нередко с двух или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, по-видимому, из-за бурного роста посторонней микрофлоры. Посев следует производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60° 15 минут (в этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры Cl. botulinum типа Е, которые погибают при 80°), другой прогревают при 80° 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60°, инкубируют при 28°, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35-37°. Последние два флакона исследуют на Cl. botulinum типов А, В, С.
Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образам, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. После посева все исходные образцы проб следует сохранять на леднике до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.
В настоящее время есть сообщение зарубежных ученых о том, что для выявления Cl. botulinum типа Е в среду следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления возбудителя ботулизма типа Е из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положительный результат лишь в 17% проб
Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15-20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавлять во флаконы, которые будут инкубироваться при 28°, из расчета 1 мл 1% раствора трипсина на 10 мл среды после прогрева при 60° 15 минут.
Рост возбудителя ботулизма характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. Стерильно взятые из таких флаконов пробы (10-15 мл) подвергаются исследованию. Прежде всего готовят мазки, красят их по Граму или краской для анаэробов и микроскопируют.
С культуральной жидкостью ставится реакция нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов А, В, С, Е и F. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжать инкубацию в термостате, а исследование повторить на 4-6-10-е сутки. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum, а также ботулинического токсина дается заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.
Если же в посевах обнаруживаются микробы, по морфологии сходные с Cl. botulinum, а токсин отсутствует, следует провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином по описанной ниже методике для обнаружения ботулинического токсина, а также провести выделение и изучение чистой культуры. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулинической сывороткой проводят только в том случае, если в среду перед высевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.
Исследование пищевого продукта
Исследуемый продукт в количестве 25-30 г тщательно растирается в стерильной ступке с физиологическим раствором или с дистиллированной водой в том случае, если продукт соленый (материал легче растирается в присутствии стерильного кварцевого песка). В зависимости от характера (плотности) продукта берется равное или двойное количество физиологического раствора или дистиллированной воды по отношению к весу пробы.
Из растертой пробы 2/3 объема используется для обнаружения ботулинических токсинов и 1/3 — для выделения возбудителей ботулизма.
Та часть пробы, которая исследуется на наличие токсинов, выдерживается в течение 1 — 1 1/2 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется при 2500-3000 об/мин в течение 15-20 минут. Фильтрование через тальковый фильтр недопустимо, так как тальк адсорбирует на себе ботулинические токсины.
Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или центрифугатами ставится реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой по вышеописанной методике с предварительной активизацией фильтров.
Обнаружение ботулинических микробов в пищевых продуктах проводится по методике, изложенной в разделе по исследованию материалов от больных. Во флаконы с питательной средой засевают 5-10 мл растертого с физиологическим раствором или дистиллированной водой испытуемого материала.
Выделение чистой культуры
Посев на высокий столбик агара. Для посева применяется прозрачный одно- или полуторапроцентный агар с глюкозой, приготовленный на мартеновском бульоне, бульоне Хоттингера или пепсин-пептоне, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15-18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45-60°. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал и переносят последовательно из пробирки в пробирку, после чего агар тщательно перемешивается путем перекатывания пробирок между ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35-37°. На каждый посев следует брать 5-8 пробирок столбика агара. Если в первичной культуре рост не очень обильный, при пересеве на высокий столбик пастеровскую пипетку следует обломать и набрать немного культуры в капилляр, а затем проводить посев, как указано выше.
Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5-10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80° 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.
Через 1-2 суток в последних пробирках проявляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии перевиваются на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшаяся часть колонии микроскопируется.
Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами:
1. Столбик агара прокалывается сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекается нужная колония.
2. Дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревается на пламени горелки; под действием паров закипавшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительная колония извлекается отломанным капилляром пастеровской пипетки.
Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.
Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного печеночного агара, разлитого тонким слоем в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2-3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат (различных марок) крышкой кверху и выращивают при температуре 35-37°.
Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении Cl. botulinum типа Е из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на слабой чувствительности спор палочки ботулизма типа Е к 50% спирту.
К 2 мл культуральной жидкости 2-3-дневной инкубации при 28°, содержащей ботулинический токсин типа Е, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2-3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток, одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50° агара). Через 48 часов инкубации при 35° в анаэростате среди колоний посторонней микрофлоры Cl. botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Правда, некоторые спорогенные анаэробы (Cl. sporogenes и др.) дают вокруг колоний также «жемчужный пояс». Эти колонии высевают на пробирки со средой типа Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры Cl. botulium типа Е. С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1-0,2 см, окруженных зоной гемолиза.
При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов
Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп МБС-1. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.
С поверхности чашки колонии снимаются петлей или пастеровской пипеткой и засеваются на пробирки с бульоном с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяются на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем титрования и постановки реакции нейтрализации на мышах.
В дальнейшем изучаются протеолитические и биохимические свойства путем посева на желатину и углеводы.
Метод активации протоксина Cl. botulinum
Культуры Cl. botulinum типа Е и некоторые штаммы типов В и F вырабатывают протоксин, который сам по себе является нетоксичным для животных при внутривенном и подкожном введении.
Поэтому для обнаружения протоксина применяют метод активации с помощью протеолитических ферментов — трипсина или панкреатина, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.
Способ приготовления протеолитических ферментов. Чистый сухой трипсин растворяется перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1 : 100 (1% раствор); этот раствор принимается за исходный. Для активации берется данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.
Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовится следующим образом: 4 г панкреатина растворяется в 100 мл физиологического раствора и оставляется в холодильнике при 4° в течение ночи.
Перед употреблением полученная жидкость фильтруется через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластину фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости
Готовый раствор в объеме 0,5 мл не должен убивать белую мышь весам 17-18 г при внутривенном введении. При внутрикожном введении морским свинкам 0,2 мл раствора обычно появляется некроз участка кожи (0,5 X 0,5 см)
Активность приготовленного раствора панкреатина следует предварительно проверить по отношению к известному музейному штамму Cl. botulinum типа Е. Готовый раствор пакреатина может сохраняться при 4° в течение 2 недель.
Активация прототоксина Cl. botulinum
Исследуемая 4-5-суточная культура Cl. botulinum полученная на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергается центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.
Готовый раствор трипсина добавляется из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1% (на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1% раствора трипсина).
Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральная жидкость смешивается в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.
Полученные смеси помещают в термостат при 37° на один час. По истечении указанного срока активированную жидкость титруют на белых мышах путем внутривенного введения с постановкой реакции нейтрализации.
Аналогичным образом проводится активизация фильтров (центрифугатов) из пищевых продуктов и органов трупов.
Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
источник
Ботулизм – это тяжелая форма пищевой интоксикации, развивающаяся в результате употребления в пищу продуктов, зараженных токсином Cl.perfringens, характеризующаяся специфическим поражением ЦНС.
известен давно под названием “аллантиазис” (от греч. “колбаса”), “ихтиоизм” (от греч. “рыба), botulus (от лат. “колбаса”). Кернер в 1815 г. описал 230 случаев отравления, в 1896 г. бельгийский врач Э.Ван Эрменгем выделил возбудителя из остатков ветчины, в 1914 г. русский врач Констансов выделил из осетрины. В настоящее время отравления связывают не с употреблением колбасы, а консервированных продуктов.
Таксономия: семейство Bacillaceae, род: Clostridium, вид CL.botulinum (от лат. botulus – колбаса).
Полиморфные палочки с закругленными концами, длина 4-10 мкм, ширина 0,3 – 1,0 мкм, слабоподвижны (перитрихи), образуют терминально или субтерминально расположенные споры, возбудители при этом напоминают теннисную ракетку, капсул не имеет.
Тинкториальные свойства: граммоположительные, по методу Ожешко споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий.
Культурные свойства.
Строгие анаэробы. Растут на казеиновых или мясных средах, в жидкие казеиновые среды добавляют отварное пшено или вату, а в мясные – мясной или печеночный фраш. На кровяном агаре с глюкозой через 24-46 часов образуют крупные круглые колонии, окруженные зоной гемолиза (тип А). Цвет колонии слегка коричневый или серовато-мутный. В столбняке агара могут быть в виде двух форм: S-формы в виде пушинок с боле плотным центром и R-формы чечевицеобразные. В жидких средах – мутность.
Оптимум pH – 7,2 – 7,4; температура культивирования 35 °C для сероваров A, B, C, D, F; 28 °C – для сероваров Е и непротеолитических штаммов B и F; 37 °C – для серовара G; время культивирования – 24-48 часов.
Биохимические свойства.
Сахаролитические свойства выражены у типов А и B (разлагают с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, глицерин, фруктозу, левулезу). Тип С слабо разлагает сахара или так же, как и серовар G – не обладают сахаролитическими свойствами, типы Д и Е занимают промежуточное положение. Все штаммы типов А и В обладают мощными протеолитическими свойствами: гидролизуют казеин и образуют сероводород, в средах Китта-Тароцци расплавляют кусочки печени или мясного фарша. Типы С, Д, Е такими свойствани не обладают.
Неоторые авторы выделяют 4 группы бактерий по способности разлагать сахара и белки:
1 группа — расщепляют глюкозу, мальтозу; протеолитическая активность в виде желатиназы; липазная активность на среде с яичным белком;
2 группа – обладают сахаролитическими свойствами;
3 группа – липолитическая активность и разжижение желатина;
4 группа – гидролиз желатина, не проявляют сахаролитической активности.
Указать, что дифференциация возбудителей по биохимической активности используется редко.
Антигенная структура.
Имеют О и Н- антигены. Однако, по ним идентификация возбудителя не проводится. По антигенной специфичности токсина различают 8 сероваров: А, В, С1, С2 , Е, F, G. Тип токсина определяется в реакции нейтрализации с соответствующими антитоксическими сыворотками.
Факторы патогенности.
а) экзотоксин (нейротоксин) – белок, получен в кристаллической форме (отметить, что самый сильный биологический яд — в 3 раза сильнее цианистого калия), образуется в анаэробных условиях на питательных средах, в различных консервированных пищевых продуктах, устойчив к действию протеолитических ферментов ЖКТ, обладают способностью гемагглютировать эритроциты человека, кролика, птиц; обладает тропизмом к нервной ткани (фиксируется на рецепторах синаптических мембран и изменяет чувствительность ацетилхолинового рецептора к действию медиатора). Токсин сероваров Е и В образуется в виде протоксина и активируется трипсином. Обратить внимание на то, что для людей наиболее патогенными являются типы А, В, Е (очень токсичен Е), менее патогенные – С, Д, F.
В настоящее время считают, что токсин – это Zn 2+ зависимые эндопептидазы. При протеолизе разлагается на 2 связанных дисульфидной связью фермента (L и Н цепи). Одна субъединица отвечает за адсорбцию на рецепторах нейронов, другая – за проникновение в них путем эндоцитоза, ингибирование Са 2+ — зависимого освобождения ацетилхолина, в результате блокируется передача нервного импульса через синапсы, поражаются бульбарные нервные центры, нарушается походка, зрение, возникает асфиксия.
Типы токсинов различают по антигенной структуре и молекулярной массе, по скорости седиментации выделяют 12S-, 16S- и 19S токсины.
12S-токсины (М-токсины) состоят из молекулы нейротоксина (Н цепь) и молекулы нетоксичного и негемагглютинирующего белка (L цепь);
16S-токсины (L-токсины) состоят из молекулы нейротоксина и гемагглютининового нетоксичного белка;
19S-токсины (L L – токсины) с большой молекулярной массой, включающие в себя нейротоксин и нетоксический белок с гемагглютинирующими свойствами.
б) гемолизин (лизирует эритроциты барана) и вызывает гибель лабораторных животных. Надо отметить, что гемолизин продуцируют только некоторые штаммы.
Резистентность.
Вегетативные формы малоустойчивы (погибают при 80 °C в течение 30 мин.);
Споры выдерживают кипячение в течение 1-5 часов, при 105 °C погибают через 2 час, при 120 °C – через 10-20 мин. Отметить, что в больших кусках мяса, в банках болшой емкости жизнеспособны после автоклавирования при 120 °C в течение 15 мин; 10 % соляная кислота убивает споры через 1 час, 40 % раствор формалина – через сутки, устойчивы к кислой среде желудка, споры прекращают прорастать при 2 % растворе уксусной кислоты при рН 3-4,5.
Ботулотоксин – при кипячении разрушается в течение 15 мин., устойчив к действию солнечного света, высоких концентраций хлорида натрия, к замораживанию, кислотам, рН ниже 7,0, к действию протеолитических ферментов ЖКТ; длительно сохранятеся в воде, в консервах – 6-8 мес.
Роль в патологии: вызывают ботулизм.
Эпидемиология.
Естественная среда обитания клостридий – кишечник травоядных животных, человека, рыб, ракообразных, моллюсков.
Пути заражения (основной) алиментарный, но может проникать через раневую поверхность. Отметить, что ботулотоксин способен проникать через неповрежденную кожу и слизистые. Больной человек не заразен. Указать, что в консервированных пищевых продуктах наличие самого возбудителя не обязательно. Отметить – ботулотоксин может располагаться в продукте в виде очагов, не изменяя органолептические свойства его.
В зависимости от путей заражения различают 4 формы болезни:
— неопределенно классифицируемый ботулизм (у детей старше 1 года и у взрослых, не связано с употреблением в пищу и попаданием через раны).
1. Пищевой ботулизм – ботулотоксин, попадая в ЖКТ, проникает в кровь, поражает нервную систему, действуя на мотонейроны спинного мозга и ядра продолговатого мозга, прочно связывается с нервными клетками, вызывая нарушение передачи возбуждения с нерва на мышцу, действуя на сосуды (сужение с последующим парезом и повышение ломкости).
Инкубационный период: от нескольких часов до 8-10 дней.
Клиника: боли в животе, ощущение тяжести в желудке, рвота, общая интоксикация, возможно расстройство стула. Затем возникают жалобы на ухудшение зрения, двоение в глазах, нарушение глотания, потеря голоса, поражаются III, IY, YI пары черепномозговых нервов, головная боль, паралич дыхательного центра, смерть. Летальность 60-80 %. Обратить внимание на то, что заболевание может начинаться с жалоб на “туман” или “сетки” пред глазами, двоение предметов.
2. Раневой ботулизм – отметить, что в последнее время участились случаи его, поражает преимущественно детский возраст, в основном мальчиков.
3. Ботулизм грудных детей — в возрасте 3-20 недель при попадании спор или вегетативных форм с пищей ребенка (с молоком, с медом, особенно при искуственном вскармливании). Симптомы такие же, как и при пищевом ботулизме. Указать, что при диагностике заболевания у новорожденных следует обращать внимание на слабость в сочетании с нарушением сосания и глотания + птоз, мидриаз, офтальмоплегия. Заболевание может заканчиваться внезапной смертью (не > 4 %), так называемая “смерть в колыбели”.
Иммунитет постинфекционный не формируется, так как иммунная доза токсина превышает летальную.
Микробиологическая диагностика (см. схему).
Обратить внимание на выявление ботулотоксина и возбудителя в исследуемом материале (исследование проводится одновременно), в крови определяют токсин, в кале только возбудитель, остальной материал исследуется на токсин и бактерии.
Профилактика:
а) неспецифическая – соблюдение технологии обработки продуктов (консервы автоклавируют 30-40 мин при температуре 120 °C), в продукты вносятся ингибиторы: нитриты.
б) специфическая – только по экстренным показаниям: лицам, употреблявшим в пищу зараженные продукты, но еще не заболевшим, назначают поливалентную противоботулиническую сыворотку и ботулинический анатоксин, эатем типовые противоботулинические сыворотки по мере установление типа токсина.
Активная иммунизация проводится работникам лабораторий, военнослужащим и лицам, чья профессия связана с контактом с ботулотоксином.
а) неспецифическое – промывание желудка, дезинтоксикационные мероприятия, антибиотики: пенициллин, тетрациклин;
б) специфическое – срочно поливалентную противоботулиническую (А,В,Е) сыворотку, внутривенно или внутримышечно, после установления типа токсина – моносывортки.
источник
Ботулизм — инфекционная болезнь, характеризующаяся интоксикацией организма с преимущественным поражением ЦНС, возникает в результате употребления пищевых продуктов, содержащих токсины Clostridium botulinum (отдел — Firmicutes, род — Clostridium).
Ботулизм имеет 8 сероваров: A, B, C, D, E, F, G, H, из которых наиболее важны A, B и E.
Развитие инфекции зависит от:
Развитию инфекции способствуют:
— глубокие рваные раны в т.ч. огнестрельные с наличием ранящего предмета;
— некроз
— повреждение крупных сосудов
— нарушения микроциркуляции
— недостаточно грамотные манипуляции (глухая герметичная повязка, жгут на 2 часа)
Г+, образуют различные токсины и ферменты облад-е let, некротизирующим и гемолитическим действием
Ботулизм — представляет собой граммположительные палочки длиной 3-9 мкм, шириной 0,6-1 мкм с закруглёнными концами. Палочки образуют терминально и субтерминально расположенные споры и имеют вид теннисной ракетки. Капсулы не образуют, подвижны, имеют 25 перетрихиев.
Ботулизм. Культуральные и ферментативные свойства
Ботулизм (Clostridium botulinum) — строгий (облигатный) анаэроб. Оптимальная температура для роста 25-35 С, рН среды 7,2-7,4. На кровяном агаре образует небольшие прозрачные колонии, окруженные зоной гемолиза. В высоком столбике сахарного агара колонии имеют вид пушинок или зёрен чечевицы.
Ботулизм (Clostridium botulinum) обладает большим набором сахаролитических или протеолитических ферментов.
Для культивирования используют среды с повышенным содержанием животного белка, т.е. гидролизат казеина, мясные и рыбные гидролизаты. Углеводы сбраживает до кислоты и газа.
Ботулизм. Антигенные свойства:
Антигенные свойства наиболее важными для идентификации возбудителя
Ботулизм имеет 8 сероваров (по разным источника от 5 до 8): A, B, C, D, E, F, G, H, из которых наиболее важны A, B и E.
Ботулизм. Факторы патогенности:
Ботулизм (Clostridium botulinum) выделяет экзотоксин,самый сильный из всех биологических ядов. Смертельная доза для человека-0,3 мкг. Ботулинический экзотоксин оказывает нейротоксическое, гемагглютинируеющее действие. Его особенность — высокая устойчивость к нагреванию (сохраняется в течение 10-15 мин при 100 С), кислой реакции, высоким концентрациям поваренной соли, замораживанию, пищеварительным ферментам.
К факторам патогенности относятся также ферменты агрессии: ДНК-аза, гиалуронидаза, бета токсин. Бета-токсин является самым сильным бактериальным токсином,(летальность 1,6 нанограмм для белых мышей, что в 1006 раз сильнее гремучей змеи. Бета-токсин содержит два компонента: нейротоксин и гемаглютинин. Гемагглютинин – трансмембранный проводник, обеспечивает транспорт нейротоксина через клеточную мембрану. Нейротоксин, попадая в кровь разносится по организму и действует на нервно-мышечные синапсы, нарушает высвобождения ацетилхолина, в результате чего развивается паралич и поражаются ядра черепных нервов.
Ботулизм. Резистентность:
Ботулизм (Clostridium botulinum) имеет споры, которые обладают очень высокой резистентностью к высоким температурам(выдерживают кипение в течение 3-5 часов)
Ботулизм. Восприимчивость животных:
К экзотоксину этого возбудителя наиболее чувствительны лошади,морские свинки,белые мыши и др. животные.
Ботулизм. Эпидемиология:
Широко распространён в природе. Его обнаруживают в организме животных, рыб, ракообразных, откуда он попадает в почву и воздух. В почве долгое время сохраняется в виде спор и даже может размножаться,что позволяет отнести ботулизм к сапронозным инфекциям. Из почвы ботулизм попадает в пищевые продукты, где размножается и выделяет экзотоксин. Путь передачи инфекции — пищевой. Чаще всего фактором передачи инфекции являются консервы(грибные, овощные, мясные, рыбные).От человек человеку заболевание не передаётся.
Ботулизм. Патогенез:
Ботулинический токсин попадает с пищей в пищеварительный тракт. Усойчивый к действию пищеварительных ферментов, токсин всасывается через стенку кишечника в кровь и обуславливает длительную токсинемию. Токсин связывается нервными клетками и блокирует передачу импульсов через норвно-мышечные синапсы. В результате развивается пралич мышц гортани,глотки,дыхательных мышц,что приводит к нарушению глотания и дыхания,наблюдаются изменения со стороны органов зрения.
Ботулизм. Клиническая картина:
Продолжительность 6-24 ч до 2-6 дней. Чем короче инкубационный период, тем тяжелее протекает болезнь. Обычно заболевание начинается остро, но температура тела при этом остаётся нормальной. Есть различные варианты ботулизма — с преобладанием симптомов поражения пищеварительного тракта, расстройств зрения или дыхательных функций.
1-ый случай: заболевание начинается с появления сухости во рту, тошноты, рвоты, поноса.
2-ой случай: нарушение зрения (туман перед глазами и двоение). В результате паралича мышц гортани появляется осиплость, а затем пропадает голос. Больные могут погибнуть от паралича дыхания. Заболевание может осложниться острой пневмонией,токсическим миокардитом, сепсисом. Летальность при ботулизме составляет 15-30%
Выделяют 4 категории инфекции:
1. Пищевая – интоксикация продуктами с токсином, чаще консервы (грибы, овощи, фрукты, если герметично закатаны, рыбные консервы, мясные когда нарушалась технология и мясо соприкасалась с кишечным содержимым). Заболевание начинается с появления сухости во рту, тошноты, рвоты, диареи.
2. Раневая – редкая форма, развивается инфекционный процесс при попадании микроорганизма в открытую рану.
3. Ботулизм новорожденных – развивается в случае, когда споры с воздухом или жидкостью попадают в желудочно-кишечный тракт. Поскольку у новорожденных в ЖКТ отсутствует часть нормальной микрофлоры, которая присутствует у взрослых, развивает патологическая колонизация ботулинических палочек и возникает генерализованный ботулизм
4. Неопределённо классифицированный (криптогенный) — диагностируется в случае, если есть все признаки ботулизма, но точную причину установить не удается.
Ботулизм. Иммунитет:
Постинфекционный иммунитет не формируется. Антитела, которые вырабатываются в течение заболевания, направлены против определённого серовара.
Ботулизм. Микробиологическая диагностика:
Исследуют промывные воды желудка, рвотные массы, остатки пищи.
Применяют следующие методы:
— бактериологический метод, направленный на обнаружение возбудителя,
— биологический метод (р-ю нейтрализации токсина антитоксином in vivo)
— серологический метод (РНГА), позволяющие выявить в исследуемом материале ботулинический токсин.
Ботулизм. Лечение:
Используют антитоксические противоботулинические гетерологические сыворотки и гомологичные иммуноглобулины.
Ботулизм. Профилактика:
Основную роль в предупреждении ботулизма играет соблюдение определённых правил приготовления продуктов,прежде всего домашних консервов. Для специфической профилактики ботулизма ограниченно применяют тетра- и трианатоксин,в состав которых входят ботулинические анатоксины типов А,В,Е. Экстренная профилактика осуществляется с помощью противоботулинических сывороток.
источник