Лабораторная диагностика ботулизма среда

Ботулизм развивается из-за попадания в организм ботулотоксина, который относится к одному из наиболее ядовитых биологических веществ. Выделяется токсин в процессе жизнедеятельности спорообразующей палочки, размножающейся в безвоздушной среде.

Попадает инфекция в организм человека при употреблении консервов домашнего приготовления, поскольку яд длительное время существует в рассолах, консервах и пищевых продуктах, содержащих различные специи. Пищевая токсикоинфекция поражает нервную систему, что может привести к остановке дыхания или сердцебиения, поэтому каждый, кто любит домашние консервы, должен знать, как определить ботулизм.

Диагностика ботулизма начинается с изучения эпидемиологического анамнеза и клинической картины заболевания. Инфекция передается фекально-оральным путем, то есть вместе с продуктами питания, недостаточно отчищенными от почвы. В подавляющем большинстве случаев, причиной болезни выступает употребление приготовленных в домашних условиях консервированных продуктов, которые были загрязнены спорами клостридий.

Токсин может находиться в банках с огурцами, помидорами, грибами и любыми другими продуктами, содержащими рассол. Необходимым условием для размножения бактерии является отсутствие кислорода, поэтому они накапливаются только в плотно закрытых банках. Если заболевший ел в течение последних 10 дней консервированные овощи, грибы, мясные изделия или соленую рыбу, то есть вероятность, что он заразился токсикоинфекцией.

Люди высоковосприимчивы к ботулотоксину, а значит, даже небольшие его дозы способны приводить к появлению клинических симптомов. Затрудняет диагностику ботулизма то, что не все, кто ел продукты из банки, заражаются, поскольку токсин концентрируется в определенном месте и достаточно минимального количества, чтобы развилась патология.

Вместе с тем часто бывают случаи семейного поражения ботулизмом после употребления долго хранившихся консервированных продуктов. В редких случаях заражение ботулотоксином происходит при контакте обсемененной жидкости с ранами и гнойниками, развивается так называемый раневый ботулизм. Поэтому нельзя даже открывать подозрительную банку с консервами.

Токсин в начале заболевания может спровоцировать развитие гастроэнтерологического, глазного синдрома или острую дыхательную недостаточность. Чаще всего развивается гастроэнтерологический вариант, который протекает, как пищевая токсикоинфекция. Больной ощущает боль в верхней части живота, появляется тошнота, рвота, диарея, кожа быстро становится сухой из-за потери жидкости, нередко заболевшие говорят о том, что стало больно глотать.

В продромальный период ботулизма, протекающего по глазному варианту, больные жалуются на нарушение зрения (появление черных точек, затуманивание, утрата четкости и остроты зрения, развитие острой дальнозоркости). Даже на начальном этапе болезни может возникнуть острая дыхательная недостаточность, которая способна приводить к летальному исходу в течение 3–4 часов, поэтому если внезапно появилась и увеличивается отдышка, кожа и слизистая оболочка становятся синюшными, то срочно необходима медицинская помощь.

В разгар болезни появляются специфические для ботулизма симптомы: парезы и параличи мышц различных групп. У больных возникает офтальмоплегия (паралич мышц глаз), что может проявляться расширением зрачков, косоглазием, вертикальным нистагмом, опущением века.

Из-за пареза мышц глотки развивается дисфагия (нарушение глотания), что приводит к невозможности проглатывания пищи и жидкости. Ботулотоксин провоцирует и ослабление иннервации мимических мышц, что проявляется в асимметрии лица. Походка больных неустойчива, отмечается общая слабость. Парез мышц кишечника приводит к развитию запора.

Последовательно нарушается речь. Сначала у больного изменяется голос из-за сухости слизистой голосовых связок. Когда развивается парез мышц языка, человек не может внятно говорить. По мере прогрессирования болезни возникает парез мышц небной занавески, что делает голос гнусавым, а когда ослабевают голосовые связки, голос исчезает вовсе.

Таким образом, заподозрить развитие ботулизма можно, если больной недавно употреблял консервированные продукты, а симптомы указывают на нарушение иннервации различных групп мышц (глазных, лицевых, голосовых). При подозрении на ботулизм необходимо срочно обратиться к врачу. Специалисты проведут дифференциальную диагностику, а с помощью микробиологии будет подтверждено или опровергнуто присутствие яда в организме.

Дифференциальная диагностика проводится на начальном этапе заболевания, когда клиническая картина еще не включает специфические симптомы ботулизма. Первые признаки болезни, такие как понос, рвота, тошнота, слабость характерны для многих кишечных инфекционных заболеваний и пищевых отравлений.

Паралич глазных мышц может возникнуть в результате новообразования, отравления свинцом, алкоголем, барбитуратами, поражения головного мозга (ЧМТ, инсульт, энцефалит), заражения столбняком, дифтерией и прочими инфекционными болезнями. Дыхательная недостаточность развивается при заболеваниях бронхолегочной системы и поражениях ЦНС.

Диф. диагностика ботулизма требует исключение:

• миастении;
• вирусного энцефалита;
• дерматомиозита;
• синдрома Гийена-Баре;
• синдрома Вернике;
• полиомиелита;
• отравления грибами или атропином.

Специфическая лабораторная диагностика ботулизма на начальной стадии болезни не разработана, поэтому дифдиагностика основывается на данных эпидемиологического анамнеза (употреблении консервированных продуктов, алкоголя, получения черепно-мозговой травмы).

По мере развития ботулизма появляются характерные симптомы, которые и помогают дифференцировать болезнь (сохранность сознания и чувствительности, отсутствие жара и лихорадки, мышечные параличи). Дальнейшая диагностика проводится для определения типа токсина (А, В, С, Е, F) и подтверждения диагноза. При подозрении на ботулизм у больного берут анализ крови и мочи, и хотя исследования не являются специфичными, но они помогают установить тяжесть течения болезни.

Микробиологическая диагностика ботулизма позволяет обнаружить токсин в рвотных массах, кале, крови, моче, промывных водах желудка, остатках продуктов. Для определения вида яда используют бактериологический и биологический метод, а также устанавливают фагоцитарный показатель.

При использовании бактериологического метода взятый материал смешивают в стерильной емкости с физиологическим раствором хлорида натрия. Затем высевают материал на питательную среду в четыре пробирки. Два образца нагревают при температуре 60 ⁰С в течение 15 минут, что позволит обнаружить бактерию типа Е.

А остальные две пробирки нагревают 20 минут при 80 ⁰С. Размножаются бактерии типа Е и F при 28 ⁰С, а типа А, В, С при 35 ⁰С за 48 часов. Через 1–2 суток оценивают характер роста и проводят окрашивание мазков по Граму. После выделения чистой культуры изучают ее антигенные свойства с помощью реакции агглютинации с типовыми сыворотками.

Биологический метод предполагает определение типа токсина с помощью реакции нейтрализации, что важно для специфического лечения. Для обнаружения реакции нейтрализации применяют сухие диагностические антитоксические сыворотки, которые смешивают с физиологическим раствором. Если сыворотка действует, то в исследуемой пробе токсин нейтрализуется.

Материал для исследования помещают в 6 пробирок, в пять из них добавляют противоботулинические сыворотки типа А, В, С, Е, F, а в шестую нормальную сыворотку. Пробирки опускают в термостат на 30 минут, а затем вводят по 1 мл жидкости белым мышам. Грызуны, которым была введена подходящая противоботулиническая сыворотка, не погибают.

Ботулинический токсин снижает фагоцитарную активность лейкоцитов. Для выявления данного свойства кровь предполагаемого больного смешивают с цитратом натрия, в пробирки добавляют поливалентную или типовую сыворотку и помещают в термостат на полчаса, для уничтожения токсина. Затем в исследуемый материал вводит стафилококк и опять опускают в термостат на 20 минут для окончания фагоцитоза.

Делают мазок из каждого образца и подсчитывают количество стафилококков, захваченных в среднем одним лейкоцитом. Если в крови присутствовал ботулинический токсин, то фагоцитарный показатель низкий. Если же добавлялась типовая сыворотка в пробирки, то там, где сыворотка соответствовала токсину, произойдет нейтрализация и фагоцитарный показатель будет существенно выше.

В разгар заболевания можно обнаружить токсин в крови с помощью РОПГА с антительным эритроцитарным диагносикумом. Дело в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами и склеивание происходит, если в образце материала присутствуют антигены. Тест позволяет обнаружить даже минимальное количество токсина в исследуемом материале, поскольку обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

В кровь, взятую из вены, добавляют антитела, которые помечены ферментами. На них реагируют бактериальные антигены и образуют с ними иммунные комплексы, что вызывает изменение цвета материала. Специалисты по интенсивности окраски делают вывод о присутствии в образце специфических антител к ботулистическому токсину.

Метод дот-иммуноанализа позволяет распознать ботулизм уже через три часа после получения для исследования материала. С помощью теста можно проверить на токсины не только кровь, но и продукты питания, которые предположительно стали источником инфекции.

На нитроцеллюлозный мембранный фильтр, на котором находятся меченные противоботулиническе антитела, наносится исследуемый материал. После этого, фильтр обрабатывают специальным составом, который темнеет, если в жидкостях присутствует токсин. Концентрация яда определяется при сравнении с контрольной школой.

Лабораторная диагностика ботулизма подтвердит или опровергнет заболевание, что необходимо для назначения адекватного лечения, которое заключается в приеме противоботулинической сыворотки. На сегодняшний день не составляет труда определить присутствие в крови ботулотоксина, но заболевание развивается стремительно, поэтому необходимо знать, как распознать болезнь, чтобы вовремя обратиться к врачу.

источник

Ботулизм — острое инфекционное заболевание. Его вызывают токсины, продуцируемые бактериями Clostridium botulinum. Ботулинические токсины поражают нервную систему, прочно связываясь нервными клетками. В результате инфекции возникают параличи, парезы (снижение силы мышц из-за повреждения нервных путей).

В числе первых нарушается нервно-мышечная передача к мышцам глотки, гортани, глаз. Угнетаются функции дыхательных мышц вплоть до полного паралича. Возникают парезы желудочно-кишечного тракта, диафрагмы, межрёберных мышц. Развивается гипоксия всех видов. Без специфического лечения человек, инфицированный ботулизмом, умирает: смертельная доза составляет всего 0,3 микрограмма ботулотоксина.

Бактерии Clostridium botulinum распространены в природе, где представлены в вегетативной форме (самая опасная) и спорах. Вегетативные формы, которые и есть источник ботулотоксина, обнаруживают в кишечнике диких и домашних животных, рыб, птиц. Если они попадают во внешнюю неблагоприятную среду: в почву, в озёрный и речной ил, то сохраняются в ней в виде спор.

Все возбудители ботулизма имеют Н-антигены, по наличию которых их делят на 6 типов — А, В, С, D, Е, F. Особенно опасны для человека — А, В, Е. Каждый тип требует специфической сыворотки при лечении, с чем связаны сложные анализы при диагностике заболевания.

Любые загрязнённые почвой, даже в малом количестве, продукты могут содержать вегетативные формы, споры Clostridium botulinum. Но поражение вызывают те, которые сохранялись без или почти без воздуха. Потому так опасны консервы, вяленая рыба и мясо, в которых возникают идеальные условия для развития вегетативной формы возбудителя и образования ботулотоксина.

Заражение, вызванное спорами, возникает, если почва попала в рану, где в анаэробных условиях споры развиваются в вегетативную форму с выделением токсинов.

Инкубационный период при ботулизме длится до 24 часов, редко — до 3 дней.

Первыми признаками поражения могут стать:

острая боль в животе с локализацией в эпигастральной области;

рвота и жидкий стул 4—10 раз в сутки;

общее недомогание, головная боль;

повышение температуры от 37 °С до 39-40 °С.

К концу инкубационного периода проявляются основные симптомы поражения:

нарушается острота зрения, больной жалуется на «туман, сетку в глазах», возникает двоение предметов;

появляется мышечная слабость, сухость во рту;

изменяется голос, нередко возникает гнусавость, далее — осиплость, хрипота, полная потеря голоса;

нарушается глотание, в тяжёлом случае наступает афагия — невозможность принять ни жидкую, ни твёрдую пищу;

Перечисленные симптомы проявляются в разных комбинациях, с неодинаковой силой, в различной последовательности, а отдельные отсутствуют. Обязательный фон состояния к концу инкубационного периода — сухость во рту, усиливающаяся мышечная слабость, запор.

Типичные осложнения при ботулизме:

аспирационная пневмония — инфекция, возникающая из-за того, что пища или содержимое желудка попали в лёгкие по причине паралитического воздействия ботулотоксинов;

ателектаз — безвоздушность лёгкого или его части, вызванная спадением альвеол. Проявляется одышкой, болью в груди, цианотичным оттенком кожи;

гнойный паротит — воспаление околоушной слюнной железы вследствие проникновения микробов изо рта в железу;

острая дыхательная недостаточность — состояние, при котором даже при максимальном усилии человек не может вдохнуть необходимое количество воздуха и вывести из лёгких углекислый газ;

вторичные инфекции, связанные с инвазивной терапией;

сывороточная болезнь — заболевание, развивающееся после получения гетерологичной противоботулинической сыворотки;

ботулинический миозит — воспаление мышц, чаще — икроножных.

Биоматериалами для диагностирования ботулизма являются:

подозрительные пищевые продукты, которые употреблял больной, при возможности — почву, с которой соприкасался, воду;

секционные материалы (при раневом заражении).

Для проведения микробиологической диагностики из исследуемого биоматериала выделяют возбудителя и определяют моноспецифический токсин (А, В, Е и др.).

Возбудитель обнаруживается путём посевов на питательные анаэробные среды. Для определения токсина используют биологическую пробу и реакцию нейтрализации на лабораторных мышах. Группе животных (обычно 5) вводят специально приготовленную жидкость с экстрактом культуры, полученной в исследовании биоматериала. Двум грызунам вводят живой материал, а трём — обезвреженный разными видами сыворотки по типам специфического токсина.

Если две мыши, которым вводили живой материал, умирают, диагноз считается подтверждённым. Специфический токсин и необходимую для лечения сыворотку определяют по одному выжившему животному из трёх, которым вводили культуры Clostridium botulinum с сывороткой.

Бактериологическое исследование основано на особенностях жизненного цикла Clostridium botulinum. Собранный биоматериал помещают в пробирки на питательные среды и наблюдают за ростом бактерий. Клостридии типов А,B,С,D растут при температуре 30-40 °С, типа Е — 25-37 °С, типа G — 30-37 °С.

Для иммуноферментного анализа используют венозную кровь. Из неё получают сыворотку, в которую вводят соответствующие заболеванию антитела, помеченные ферментами. Образовавшийся иммунный комплекс вступает в реакцию с ферментом, что вызывает изменение цвета. Инструментальная оптическая оценка плотности цвета позволяет понять, заражён ли человек ботулизмом.

Этот метод позволяет поставить диагноз в течение 3 часов, что жизненно важно при заражении ботулизмом. С его помощью также можно определить, есть ли возбудители ботулизма в продуктах питания.

Для определения возбудителя исследуемый материал помещают на фильтре с содержанием противоботулинических антител. Затем фильтр обрабатывают проявителем, сравнивают полученную картину с клиническими образцами.

Если биоматериал содержит токсины, фильтр изменяет интенсивность цвета. По силе изменений с помощью контрольной шкалы определяют уровень интоксикации организма.

Хотя анализ крови при ботулизме не является показательным, он обязателен, потому что говорит о наличии негативных процессов в организме.

При ботулизме возможны следующие отклонения от нормы в показателях:

лейкоциты увеличены до 9х10 9 /л;

возросла скорость оседания эритроцитов — для мужчин выше 10мм/ч, для женщин — выше 15 мм/ч;

выше нормы — концентрация углекислого газа;

ниже нормы — кислотность крови;

ниже нормы — концентрация хлоридов;

выше нормы — содержание калия.

Нужно учитывать, что показатели могут быть не только выше или ниже нормы, но и приближены к пограничному состоянию.

количество дефекаций в сутки на начальном этапе инкубации — 8—20 раз;

консистенция — жидкая, пенистая, водянистая;

цвет — желтоватый, жёлто-зелёный;

запах — без изменений, обычный;

слизь — в умеренном количестве;

свободная вода — в небольшом количестве;

зелень — в небольшом количестве;

гной — в большинстве случаев.

Клостридии переходят в вегетативную форму, продуцирующую яд, при благоприятных условиях — температуре 30-40 °С и отсутствии воздуха или минимальном его объёме.

Такие условия возникают в первую очередь в домашних консервах — главной причине заражения ботулизмом. Если на овощах, в мясе, грибах в консервы попали споры, они перейдут в вегетативную форму. Особенно опасны грибы, которые невозможно полностью отмыть от почвы и прочих загрязнений. Потенциальный «рассадник» ботулизма — заражённая колбаса, слабосолёная рыба, ветчина, произведённые с нарушением технологии.

Убить споры в домашних условиях крайне трудно. Если вегетативные формы, ботулотоксин разрушаются при нагревании до 100 °С за 10 минут, то споры выдерживают кипячение при 100 °С в течение 6 часов! Они чрезвычайно устойчивы к замораживанию, засухе, даже высокой концентрации соли.

Не употреблять в пищу грибы, законсервированные в домашних условиях — при обычной (негерметичной) засолке, сушке, мариновании ботулотоксин не образуется.

Не консервировать испорченные, давно снятые овощи, ягоды, фрукты.

Живую рыбу следует сразу потрошить, промывать под проточной водой и хранить замороженной.

Перед употреблением любых консервов их лучше прокипятить в 15 минут — за это время ботулотоксин разлагается.

Вздутые банки нужно утилизовать — их ни в коем случае нельзя вскрывать и есть содержимое.

Свежие овощи, фрукты, ягоды необходимо тщательно промывать, по возможности — с хозяйственным мылом: в нём содержится щёлочь, которая губительна для возбудителя и токсинов.

Если у вас возникли хотя бы единичные симптомы из перечисленных выше, вам срочно нужно обратиться к врачу. Помните — при этом заболевании важен каждый час и даже каждая минута.

Лаборатория АО «СЗЦДМ» предлагает услуги, обеспечивающие комплексное и преемственное лабораторное обследование пациента

Диагностика В медицинских центрах АО «СЗЦДМ» проводят качественные диагностические исследования всего организма

Лечение Наши медицинские центры ориентированы на обслуживание пациентов в амбулаторном режиме и объединены единым подходом к обследованию и лечению пациентов.

Реабилитация Реабилитация — это действия, направленные на всестороннюю помощь больному человеку или инвалиду для достижения им максимально возможной полноценности, в том числе и социальной или экономической.

Выезд на дом Внимание! Действует акция «Выезд на дом — 0 рублей»

Профосмотры АО «СЗЦДМ» проводит профилактические осмотры работников, которые включают в себя — комплексы лечебных и профилактических мероприятий, проводимых для выявления отклонений в состоянии здоровья, профилактики развития и распространения заболеваний.

источник

Возбудитель — Clostridium botulinum входит в семейство Bacillaceae, род Clostridium.

Материалом для микробиологического исследования являются рвотные массы, промывные воды желудка, кал, кровь, моча, остатки пищевых продуктов. При летальном исходе исследуют содержимое желудка, кишечника, лимфатические узлы, головной и спинной мозг.

Используют методы микробиологической диагностики: бактериологический, биологический (для выявления ботулотоксина в исследуемом материале).

С целью выявления ботулотоксина можно использовать также РОПГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антитоксинами соответствующих типов) и определение активности фагоцитов (ботулинический токсин способен подавлять активность фагоцитов, которая восстанавливается в присутствии соответствующей антитоксической сыворотки).

Бактериологический метод. Исследуемый материал растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором хлорида натрия.

Посев материала выполняют на специальные питательные среды, например, среду Китта-Тароцци.

Одну пробу засевают в 4 пробирки, две из которых прогревают при температуре 60°С 15 мин. (для селекции C. botulinum типа Е), а остальные — при температуре 80°С 20 мин. Накопление культур клостридий типа Е и F происходит при температуре 28°С, типа А, В, С — при 35°С в течение 48 часов.

Через 24-48 часов выдержки посевов в термостате отмечают характер роста на среде Китта-Тароцци: помутнение, газообразование. Готовят мазки, окрашивают по Граму. В случае выявления типичных клостридий с терминально расположенными спорами овальной формы в виде «теннисной ракетки» делают пересев на кровяной сахарный агар для получения отдельных колоний и выделения чистой культуры.

Для идентификации чистой культуры возбудителя определяют сахаролитические и протеолитические свойства. Антигенные свойства изучают в реакции агглютинации с типовыми сыворотками. Одновременно с изучением ферментативных свойств возбудителя выявляют ботулотоксин в фильтрате бульонной культуры и определяют его тип в реакции нейтрализации.

Биологический метод. Выявление ботулотоксина и определение его типа с помощью реакции нейтрализации имеет важное значение для назначения специфической терапии.

Для проведения реакции нейтрализации используют сухие диагностические антитоксические сыворотки типов А, В, С, Е, F, которые разводят физиологическим раствором до 100-200 МЕ / мл, что обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе.

Реакцию нейтрализации проводят либо со смесью сывороток (предварительная реакция), либо с моновалентными сыворотками для определения типа токсина.

Сахаролитические и протеолитические свойства Clostridium botulinum типов А, В, С, D, Е, F

КГ — образование кислоты и газа

(КГ) — кислота и газ не у всех штаммов

+ — разжижение или пептонизация, положительная реакция

Подготовленный для исследования материал (в виде фильтрата, центрифугата или крови) разливают по 1 мл в 6 пробирок. В первые пять пробирок добавляют по 1 мл противоботулинической сыворотки типов А, В, С, Е, F соответственно, а в последнюю — 1 мл нормальной сыворотки. Пробирки инкубируют в термостате в течение 30 мин. Через 30 мин. шести парам белых мышей вводят по 1 мл смеси из каждой пробирки (кровь — внутрибрюшинно, а другие материалы — подкожно). Заболевание характеризуется появлением учащенного дыхания, расслаблением мышц брюшной стенки («осиная талия»), судорогами, параличом, смертью животного. Мыши, которым был введен центрифугат с противоботулинической сывороткой, остаются живыми.

Если в исследуемом материале есть ботулинический токсин, выживает только одна пара мышей, у которых произошла нейтрализация ботулинического токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа.

Определение фагоцитарного показателя. Ботулинический токсин подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов. Это свойство используют для выявления его в крови больных и в пищевых продуктах. Исследования проводят следующим образом: кровь больного смешивают в пробирке с 3% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1. Опыт выполняют в двух пробирках с использованием поливалентной противоботулинической сыворотки. Если используют типовые сыворотки А, В, С, Е, F, соответственно, количество пробирок для исследования увеличивается. После смешивания взятых ингредиентов, пробирки помещают в термостат на 30 минут для нейтрализации токсина. В пробирки вносят по одному объему 2 млрд. суспензии Staphylococcus aureus и снова помещают в термостат на 20 минут для завершения фагоцитоза. После этого из содержимого каждой пробирки готовят мазок, фиксируют, окрашивают азурэозином и определяют фагоцитарный показатель (фагоцитарный показатель — количество стафилококков, поглощенных в среднем одним лейкоцитом. Для его определения подсчитывают микроорганизмы в 50 лейкоцитах и полученное число делят на 50.

Если в крови больного содержится ботулинический токсин, фагоцитарный показатель крови будет низким, за исключением фагоцитарного показателя той порции, в которой тип токсина соответствует типу добавленной в нее сыворотки, то есть произойдет реакция нейтрализации токсина соответствующими антителами, и фагоцитарный показатель будет значительно выше.

РОПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Сущность реакции заключается в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами, и гемагглютинация происходит при наличии в исследуемом материале антигена. Ее высокая чувствительность и специфичность позволяет найти в исследуемом материале микро количество токсинов. Диагностический титр 1:10.

источник

Ботулизм – это опасное для жизни токсикоинфекционное заболевание, протекающее тяжело и поражающее нервную систему. Оперативная и всесторонняя диагностика ботулизма позволяет вовремя принять меры, назначить правильное лечение и спасти жизнь больного.

Развитие ботулизма происходит при попадании в организм ботулотоксина, вырабатываемый бактерией Clostridium botulinum. Его способна разрушить кипящая вода, но в консервах он сохраняется, не изменяя вкусовых качеств продуктов. Бактерии могут находиться в почве, носителями являются дикие и домашние животные, водоплавающие птицы, грызуны. Выделяется палочка-возбудитель с калом, попадая в землю. Споры, попавшие в грибы, овощи, мясо, рыбу и сохранившиеся при консервировании, являются причиной возникновения опасного заболевания. Анаэробные бактерии (клостридии ботулизма) размножаются в замкнутом пространстве без воздуха.

Первые симптомы проявляются через четыре часа после приема пищи, в редких случаях инкубационный период может затянуться до недели. Все начинается с тошноты, рвоты, диареи, болей в желудке. Наиболее опасный вариант — наступление одышки и аритмии, которые развиваются стремительно, приводят к летальному исходу. Характерны для такого состояния паралич мышц, нарушение речи и зрения, общая слабость.

Диагностика ботулизма проводится в комплексе, включает дифференциальный подход, лабораторные методы микробиологические исследования.

Врачу предстоит собрать анамнез и дифференцировать информацию. Для постановки точного диагноза имеет значение: что употреблял в пищу пациент, были среди съеденных продуктов домашние заготовки, в частности грибы, рыба, мясо, консервированные овощи, сколько времени прошло, какие симптомы были первыми. Остатки продуктов сдают на исследование в лабораторию.

После тщательного осмотра больного, при выявлении симптомов, связанных с нарушением речи, паралича различных групп мышц, усиленного сердцебиения и одышки, его госпитализируют. Справиться дома с тяжелой степенью отравления невозможно. Для уточнения диагноза необходимо сдать анализ на ботулизм и пройти лечение в условиях стационара.

Для ботулизма характерна клиническая триада: “три Д”:

1. Дисфагия — затруднение глотания.
2. Диплопия — двоение перед глазами.
3. Дизартрия — нарушение речи.

Болезнь развивается ускоренными темпами, на втором этапе начинаются неврологические проявления, характерные для ботулизма. По главным признакам врач определит, чем болен пациент.

Не спутать с другим заболеванием ботулизм помогают следующие признаки:

1. При всей тяжести состояния пациент сохраняет сознание.
2. Лихорадка и дрожь отсутствуют.
3. Наблюдается ярко выраженный паралич разных групп мышц.
4. При нарушении функций двигательного аппарата, чувствительность остается на прежнем уровне.
5. Психическое состояние не нарушается.

Микробиологическая диагностика позволяет выяснить присутствует ли в биологическом материале пациента ботулинические токсины. Обнаружение бактерий подтверждает диагноз.

В микробиологии для исследований используют грызунов. Одной группе подопытных крыс или мышей вводят жидкость с содержанием исследуемого материала. Другая группа получает тот же материал, но к нему добавляется противоботулиническая сыворотка. Для третьей группы испытуемых готовят тот же материал, что и для первой. Предварительно нагревают его при температуре 100 градусов в течение получаса.

Если первая группа умирает от паралича, считается, что диагноз подтвержден. Вторая группа испытуемых помогает выяснить, какой тип токсина присутствует в биологическом материале.

Особенность бактериологического обследования заключается в том, биологический материал размещают в питательной среде и следят за ростом бактерий. При какой температуре развиваются определенные бактерии видно из схемы:

Лабораторная диагностика ботулизма в виде посева каловых масс пациента в специальную среду не всегда может быть точной. Кишечник человека содержит бактерии, схожие по культуральным признакам. Бактериологическая проба – часть исследования. В дополнение к ней нужно включать другие методы, чтобы составить достоверную картину заболевания.

Иммуноферментный анализ дает быстрый и точный результат. Пациент сдает кровь из вены. Лаборанты добавляют в пробирку с кровью специальные ферменты, вступающие в реакцию с бактериями. Исходя из изменения цвета крови, лаборант делает вывод: есть или нет в организме человека опасные бактерии.

Вид исследования, позволяющий получить результат в течение трех часов. Исследуемый материал размещается на фильтре, содержащем противоботулинические антитела. Фильтр обрабатывается проявителем, сравниваются показатели. Если биологические жидкости пациента содержат токсины, помеченные участки потемнеют. Метод позволяет определить уровень интоксикации с помощью контрольной шкалы, с которой сравниваются результаты. Этим же методом можно проверить продукты на предмет заражения ботулизмом.

Каждому пациенту, особенно тем, кто страдает частыми отравлениями и проблемами, связанными с ЖКТ, рекомендуется пройти гемотест. По его результатам можно будет сделать выводы и тщательнее следить за питанием, не принимать в пищу те, продукты, которые не переносит организм.

При подозрении на ботулизм больного попросят сдать общий анализ крови. Характеристика исследования скажет о присутствии или отсутствии болезни в организме. Изменяющиеся свойства крови говорят об интоксикационных процессах в организме. Вот описание некоторых параметров общего анализа:

• число лейкоцитов увеличено до 9х10 9/л, наблюдается лейкоцитоз;
• возрастает скорость оседания эритроцитов: у женщин – более 15 мм/ч, у мужчин – более 10 мм/ч.

Описание биохимического анализа крови скажет о наличии заболевания, если:

• концентрация углекислого газа повышена;
• кислотность крови понижена;
• концентрация хлоридов снижена;
• содержание калия повышено.

Каловые массы при ботулизме имеют свои характеристики.

Правильный диагноз, всестороннее и полное обследование – первый этап. Далее требуется лечение, которое назначит врач, и постоянное наблюдение специалистов на пути к выздоровлению.

источник

1. Экспресс-метод – постановка ИФА или РПГА с эритроцитарным антительным антитоксическим диагностикумом с целью быстрого обнаружения экзотоксина в крови больного или исследуемом материале.

2. Биологический метод (реакция нейтрализации токсина антитоксином in vivo, биопроба) позволяет обнаружить экзотоксин в материале (остатки пищи, рвотные массы, промывные воды желудка, испражнения, кровь, секционный материал – печень, кишечник, желудок). Мышам внутрибрюшинно вводят фильтрат материала в смеси с поливалентной противоботулинической сывороткой А, В, Е. Другая группа мышей получает материал без сыворотки. В том случае, когда животные второй группы погибают, ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа экзотоксина.

3. Бактериологический метод. Материал засевают на среду Китта-Тароцци, далее производят пересев в высокий столбик сахарного агара, а затем идентифицируют культуру. В реакции нейтрализации определяют экзотоксин. Токсигенность культуры может быть подтверждена при помощи ПЦР.

Больным с ранними признаками ботулизма, а также лицам, принимавшим зараженную пищу, вводят гетерологичную противоботулиническую антитоксическую сыворотку. Когда неизвестен серовар токсина, вводят поливалентную сыворотку против токсинов А, В, С, Е, а после определения типа экзотоксина – соответствующую моновалентную.

Комплексное лечение ботулизма включает промывание желудка и другие методы детоксикации, инфузионную терапию, при необходимости выполняется искусственная вентиляция легких.

Для специфической профилактики возможно применение анатоксинов типов А, В, Е, в том числе в составе ряда ассоциированных вакцин.

В настоящее время семейство Vibrionaceae включает 8 родов бактерий. Основные патогенные представители относятся к роду Vibrio

Ведущую роль в патологии человека играет возбудитель холеры V. сholerae.

V. рarahaemolyticus является причиной диарейных инфекций, V. vulnificus иногда способен вызывать раневую инфекцию и септицемию.

По морфологии возбудители представляют собой изогнутые подвижные палочки размерами 2-4 мкм. Спор не образуют.

Вибрионы распространены повсеместно: обитают в морской и пресной воде, часто колонизируют организмы водных животных (амфибий, ракообразных, рыб и др.)

Температурный оптимум для многих видов 37°С (некоторые возбудители, обитающие в морской воде, лучше размножаются при температуре 25°С и ниже).

При культивировании вибрионов в среду вносят 2-3% раствор NaCl (галотолерантные микроорганизмы).

Данные бактерии – хемоорганотрофы с окислительным и бродильным типом метаболизма.

Ферментируют глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты, иногда газа. Оксидазоположительны.

Холерные вибрионы представляют собой изогнутые палочки размерами 2-4 мкм, имеют один или два полярных жгутика. Вибрионы весьма подвижны.

Спор не имеют. Продуцируют экзополисахарид, который участвует в формировании микробной биопленки. Представители серогруппы О139 образуют капсулу.

Бактерии обладают полиморфизмом. Типичный возбудитель в форме «запятой» обычно наблюдают в образцах клинического материала. В мазках из колоний преобладают палочковидные возбудители. Иногда возникают нитевидные, кокковидные, булавовидные формы. Под действием пенициллина могут превращаться в L-формы.

Хорошо окрашиваются многими анилиновыми красителями, грамотрицательны.

Растут на простых питательных средах в температурном диапазоне 16-40°С, оптимум – 37°С, селективными являются щелочные среды с рН 7,6-9,0.

На жидких средах вызывает помутнение и образование нежной голубоватой пленки на поверхности. На 1% щелочной пептонной воде (рН 8,8-9,0) растут быстро, помутнение и пленка появляется через 6-8 часов.

На твердых средах (щелочной агар) образуют мелкие, прозрачные, с ровными краями, голубоватые в проходящем свете колонии.

На агаре с тиосульфатом, цитратом, солями жёлчных кислот, сахарозой и индикатором бромтимоловым синим (ТЦБС-агар) образуют желтые колонии на фоне голубовато-серой среды. На среде Монсура (щелочной таурохолат-теллурит-желатиновый агар) растут в виде серо-черных колоний.

Факультативный анаэробы с более выраженными аэробными свойствами.

Холерные вибрионы биохимически весьма активны. Ферментируют с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, маннит, крахмал, не разлагают лактозу. По отношению к трем углеводам – маннозе, сахарозе и арабинозе – все вибрионы разделяют на 8 групп по Хейбергу.

Холерные вибрионы разлагают маннозу и сахарозу, не разлагают арабинозу и принадлежат к 1 группе Хейберга.

Проявляют протеолитическую активность: разжижают желатину в виде воронки, гидролизуют казеин. Обладают плазмокоагулирующим и фибринолитическим действием. Свертывают молоко, разлагают белки до индола и аммиака. Восстанавливают нитраты в нитриты.

На основании биологических различий холерные вибрионы разделяют на 2 биовара: классический и Эль-Тор. Особенностью вибриона Эль-Тор является способность гемолизировать эритроциты, в связи с чем его относят к гемолитическим вибрионам.

У холерных вибрионов есть термостабильный О-антиген и термолабильный жгутиковый Н-антиген. Жгутиковый Н-АГ является общим.

По структуре О-АГ выделяют до 200 серогрупп. Оба биовара возбудителей холеры относятся к серогруппе О1.

Было установлено, что О1-АГ неоднороден и состоит из трех субъединиц: А, В, С, по которым различают серовары АВ – Огава, АС – Инаба и АВС – Гикошима. Эти свойства являются эпидемиологическими маркерами данных возбудителей.

Представители серогруппы О139 не агглютинируются О1-сыворотками. Данный вариант произошел от биовара Эль-Тор.

Его возникновение обусловлено генетическими механизмами. В результате рекомбинации возбудитель приобрел группу генов, кодирующих новый вариант ЛПС клеточной стенки совместно с полисахаридом капсулы.

Значительные изменения в строении поверхностных АГ обеспечили «ускользание» бактерий серогруппы О139 от действия факторов иммунитета, направленных к другим возбудителям холеры.

Другие вибрионы, которые также не агглютинируются О1-сывороткой, обозначаются как НАГ-вибрионы (или неагглютинирующиеся). Они способны вызывать самостоятельные диарейные заболевания.

Возбудитель содержит многочисленные адгезины и факторы колонизации. К ним относятся гемагглютинин и различные виды пилей.

Экзополисахарид вибрионов выполняет защитную функцию и обеспечивает образование биопленки.

Основную роль в патогенезе холеры играет экзотоксин (или холероген) – термолабильный белок, устойчив к действию протеолитических ферментов, разрушается фенолом и формалином. По механизму действия представляет собой энтеротоксин.

Молекула экзотоксина состоит из 2 компонентов (А и В) общей молекулярной массой 84 кД.

Рецепторный компонент В имеет 5 субъединиц. Он взаимодействует с G_М1-ганглиозидным рецептором на энтероцитах и обеспечивает проникновение в клетку токсического компонента А. В клетке происходит восстановление компонента А с образованием субъединицы А₁, которая катализирует рибозилирование клеточного G-белка.

В результате активируется аденилатциклаза, и происходит повышение уровня цАМФ в энтероцитах. Это приводит к активной секреции ионов хлора и бикарбонатов, подавлению всасывания ионов натрия, хлора и воды, выходу жидкости и электролитов из железистых клеток в просвет кишечника с развитием тяжелой диареи.

Образование токсина определяется ctx-генами трансдуцирующего CTXφ -бактериофага. Попадание фага CTXφ в холерный вибрион и его интеграция в геном приводят к лизогенной конверсии возбудителя, и вибрион получает способность к синтезу холерного токсина.

Однако успешная трансдукция фага в бактерии возможна только при наличии у вибрионов особых рецепторных пилей. Они способны специфически связывать CTX-фаг, обеспечивая его проникновение в клетку.

Рецепторные пили кодируются генами отдельного генетического островка патогенности VPI. Предполагается, что данный островок патогенности попадает в холерный вибрион в результате трансдукции еще одного специфического фага VPIφ.

Ферменты агрессии и инвазии гиалуронидаза и нейраминидаза разжижают слизь, облегчают доступ бактерий к эпителию, обеспечивают взаимодействие с микроворсинками.

Полисахарид капсулы бактерий серогруппы О139 защищает от фагоцитоза и предохраняет от действия АТ и комплемента.

Холерные вибрионы устойчивы к низким температурам – во льду жизнеспособны до 1 месяца. В морской воде сохраняются до 1,5-2 месяцев, в речной – до нескольких недель, в почве – до 3 месяцев, в фекалиях – до 3 суток. В вареных продуктах, молоке и молочных продуктах, сырых овощах жизнеспособны 2-5 дней, на фруктах – 1-2 дня.

Вибрионы обладают слабой резистентностью к действию повышенной температуры. При 80°С погибают через 5 мин, при 100°С – мгновенно. Холерные вибрионы высокочувствительны к высушиванию, ультрафиолетовому облучению, хлорсодержащим препаратам; все вибрионы высокочувствительны к кислотам.

источник

Глава VI
Лабораторная диагностика ботулизма

Лабораторная диагностика преследует цель обнаружить ботулинический токсин или возбудителя ботулизма в материалах, взятых от больного (кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, кал и др.) или в органах из трупа (печень, желудок и кишечник с содержимым), а также в пищевых продуктах, которые вызвали отравление. При этом важно установить не только присутствие токсина или микроба, но и определить их тип, чтобы подтвердить клинический диагноз, назначить правильное лечение.

Быстрая и точная лабораторная диагностика ботулизма важна для начала раннего специфического лечения, для профилактики ботулизма у лиц, употреблявших продукты, которые вызвали отравление, а также для изучения эпидемиологии ботулизма. Чем быстрее при лабораторных наследовалиях крови, выделений больных и пищевых продуктов, послуживших причиной отравления, будет обнаружен ботулинический токсин и определен его тип, тем раньше больному будет введена типоспецифическая противоботулиническая сыворотка.

Материал для исследования, отбор проб

Во всех случаях заболевания с симптомами, характерными для ботулизма, исследуют промывные воды желудка, рвотные массы, кал и кровь.

Кровь от больного необходимо брать до введения ему лечебной сыворотки в количестве 6-8 мл из вены в стерильную пробирку. Для лучшего формирования сгустка кровь нужно обвести по стенкам пробирки капилляром пастеровской пипетки, после чего выдержать в термостате 20 минут. Кровь можно брать также с 4% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 3 : 1.

Промывные воды желудка берутся в объеме 50-100 мл, а кал — в количестве 50-60 г в стеклянные банки, закрывающиеся резиновыми или корковыми пробками; консервирующие вещества добавлять нельзя. На банки с пробками наклеиваются этикетки: какой материал посылается, от кого взят и дата взятия материала. Банки при транспортировке должны быть тщательно упакованы. В сопроводительном документе необходимо указать фамилию, имя, отчество и возраст пострадавшего, дату заболевания, предполагаемый диагноз, кратко клинические симптомы, дату взятия пробы и подпись лица, направляющего материал.

Материал, подлежащий исследованию, должен храниться на холоде, так как ботулинический токсин частично разрушается при комнатной температуре.

Из трупов на исследование необходимо брать кусочек печени весом 50-60 г, обрезки тонкого кишечника и желудка с содержимым, кровь (8-10 мл). Пробы из органов берут в стерильных условиях: поверхность органа прижигается раскаленным шпателем и затем стерильными ножницами из глубины вырезается кусочек органа. Пробы из каждого органа берутся в отдельные банки, закрытые пробками или крышками.

Сырье и готовую продукцию на предприятиях консервной промышленности проверяют на наличие возбудителей ботулизма согласно действующей «Инструкции о порядке санитарно-технического контроля производства консервов», утвержденной Министерством здравоохранения СССР от 28 ноября 1963 г. N 456-63.

Лабораторно проверяются на содержание возбудителя и токсина ботулизма также продукты, остатки продукта после употребления при всех случаях пищевых отравлений с симптомами, напоминающими ботулизм, даже при легких формах клинического течения, а также при всех случаях тяжелых пищевых отравлений наряду с исследованиями на сальмонеллы, стафилококки и группу Cl. perfringens.

Следует иметь в виду, что пищевые продукты, вызвавшие отравление и зараженные возбудителем ботулизма, часто бывают не изменены по виду, запаху и вкусу. Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла. Банки с консервами могут быть вздуты («бомбаж»).

Материал для исследования берется с соблюдением условий стерильности в стеклянную посуду и закрывается плотно пригнанными стеклянными, резиновыми, корковыми или завинчивающимися пробками. Твердые объекты могут пересылаться завернутыми в несколько слоев вощаной или пергаментной бумаги.

При отсутствии стерильной посуды образцы отбирают в любые банки после предварительного 15-минутного кипячения их. Материал для исследования берут в количестве не менее 100 г. По возможности следует брать несколько проб из различных мест.

При невозможности отбора образцов в рекомендованных количествах выемка проб может производиться и в меньших количествах. К взятым пробам нельзя добавлять консервирующие вещества.

На пробы наклеивают этикетки, пробы нумеруют, опечатывают и тщательно упаковывают. Пересылка проб должна производиться в кратчайший срок и материал до исследования должен сохраняться на холоде.

Пробы, поступившие в лабораторию, исследуются одновременно по двум направлениям: производится обнаружение ботулинических токсинов и выделение ботулинических микробов. Одновременно эти же пробы должны исследоваться на группу Cl. perfringens.

Обнаружение ботулинических токсинов

Промывные воды желудка при наличии в них комочков пищи растираются в стерильной ступке. Две трети этой растертой пробы предназначаются для обнаружения ботулинических токсинов, одна треть — для выделения ботулинических микробов.

Первую часть растертой пробы выдерживают при комнатной температуре 1-1 1/2 часа для экстрагирования. Затем экстрат фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 оборотах в минуту (об/мин) в течение 15-20 минут. Полученный фильтрат или центрифугат используется для постановки реакции нейтрализации.

Цитратная кровь или сыворотка крови больного без предварительного разведения исследуется на наличие ботулинических токсинов с помощью реакции нейтрализации, причем цитратную кровь можно вводить мышам только внутрибрюшинно.

Для обнаружения токсинов в испражнениях больного кал берется в количестве 10-15 г, растирается в стерильной ступке с двойным объемом физиологического раствора и выдерживается при комнатной температуре в течение 1-1 1/2 часов для экстрагирования токсинов. Затем жидкость фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется и используется для постановки реакции нейтрализации. Экстраты из органов трупа приготовляются аналогично.

Для обнаружения токсина следует взять 4 мышей весом 16-18 г. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один из известных типов ботулинических токсинов, то предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типов А, В, С, Е, F.

Двум мышам вводится исследуемый фильтрат или центрифугат в количестве 0,5-0,8 мл. внутрибрюшинно или внутривенно в хвостовую вену (внутривенно вводится только центрифугат). Другой паре вводится смесь, состоящая из 0,5-0,8 мл испытуемого материала и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулических сывороток типов А, В, С, Е, F (по 0,04 мл сыворотки каждого типа). С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах:

Доза сыворотки, которая рекомендуется для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологического токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также экстрактах из пищевых продуктов очень сильные токсины почти не встречаются.

Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.

Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживается при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество исследуемого материала, вводимого животным с сывороткой и без сыворотки, должно быть одинаковым. Наблюдение за животными ведется в течение 4 дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставится реакция нейтрализации с моновалентными сыворотками.

Следует помнить, что ботулинический токсин не дает молниеносной гибели (в течение нескольких минут или секунд).

При наличии ботулинического токсина погибают две мыши, которым вводился не смешанный с сыворотками фильтрат, остальные остаются живы.

Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение мышц брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.

В случае гибели всех 4 мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).

Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250-300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток А, В, С, Е, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или центрифугата), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.

В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставится развернутая реакция нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифичесиими диагностическими сыворотками. В 6 пробирок разливают по 2, 4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа А, во вторую — типа В, в третью — типа С, в четвертую- типа Е, в пятую — типа F и в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или вдутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки (см. типовой протокол).

Для каждой сыворотки берется отдельный шприц. Учет результатов проводится через 4-6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4 дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологической сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

Типовой протокол постановки развернутой реакции нейтрализации

Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки N 1, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа А.

Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как обычно ее бывает мало. Следует тщательно отделить сыворотку от сгустка крови (сгусток крови необходимо посеять, так как при ботулизме можно обнаружить в крови палочку ботулизма) и с сывороткой поставить реакцию нейтрализации. В этом случае можно сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками типов А, В, Е (остальные типы ботулизма встречаются очень редко). Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа А — 0,4 мл, во вторую — типа В, в третью — типа Е. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного; контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.

При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дается заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывается его тип.

В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа Е в известной мере нейтрализует и ботулинический токсин типа F. При получении положительной реакции с противоботулинической сывороткой типа Е следует дополнительно провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу Е или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа Е и типа F. Для этого в три пробирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа Е, во вторую — 0,6 мл типа F, в третью, контрольную — 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа Е, то в экстракте имеется токсин типа F, если же погибают наряду с контролем и мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой Е, то в экстракте токсин типа Е.

Обнаружение возбудителей ботулизма

Для обнаружения возбудителей ботулизма производится посев на жидкие питательные среды. Для первичных посевов лучше использовать казеиново-грибную среду, бульон Хоттингера или пепсин-пептонный бульон с 0,5% глюкозы (см. среды для анаэробов)*(4). Необходимо, чтобы рН был в пределах 7,2-7,4. Обязательным является также наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиново-грибной среде — отварного пшена и ваты.

Для выделения возбудителей ботулизма наиболее подходящей средой является мясная среда типа Тароцци. На казеиново-грибной среде все типы возбудителей ботулизма также дают хороший рост и продуцируют токсины значительной силы.

Посевы должны производиться в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100-200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см. Следует особенно помнить о том, что засевать исходный посевной материал следует в большой объем среды (70,0-150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватило на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нетрализации, нередко с двух или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, по-видимому, из-за бурного роста посторонней микрофлоры. Посев следует производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60° 15 минут (в этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры Cl. botulinum типа Е, которые погибают при 80°), другой прогревают при 80° 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60°, инкубируют при 28°, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35-37°. Последние два флакона исследуют на Cl. botulinum типов А, В, С.

Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образам, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. После посева все исходные образцы проб следует сохранять на леднике до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.

В настоящее время есть сообщение зарубежных ученых о том, что для выявления Cl. botulinum типа Е в среду следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления возбудителя ботулизма типа Е из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положительный результат лишь в 17% проб

Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15-20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавлять во флаконы, которые будут инкубироваться при 28°, из расчета 1 мл 1% раствора трипсина на 10 мл среды после прогрева при 60° 15 минут.

Рост возбудителя ботулизма характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. Стерильно взятые из таких флаконов пробы (10-15 мл) подвергаются исследованию. Прежде всего готовят мазки, красят их по Граму или краской для анаэробов и микроскопируют.

С культуральной жидкостью ставится реакция нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов А, В, С, Е и F. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжать инкубацию в термостате, а исследование повторить на 4-6-10-е сутки. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum, а также ботулинического токсина дается заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.

Если же в посевах обнаруживаются микробы, по морфологии сходные с Cl. botulinum, а токсин отсутствует, следует провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином по описанной ниже методике для обнаружения ботулинического токсина, а также провести выделение и изучение чистой культуры. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулинической сывороткой проводят только в том случае, если в среду перед высевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.

Исследование пищевого продукта

Исследуемый продукт в количестве 25-30 г тщательно растирается в стерильной ступке с физиологическим раствором или с дистиллированной водой в том случае, если продукт соленый (материал легче растирается в присутствии стерильного кварцевого песка). В зависимости от характера (плотности) продукта берется равное или двойное количество физиологического раствора или дистиллированной воды по отношению к весу пробы.

Из растертой пробы 2/3 объема используется для обнаружения ботулинических токсинов и 1/3 — для выделения возбудителей ботулизма.

Та часть пробы, которая исследуется на наличие токсинов, выдерживается в течение 1 — 1 1/2 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется при 2500-3000 об/мин в течение 15-20 минут. Фильтрование через тальковый фильтр недопустимо, так как тальк адсорбирует на себе ботулинические токсины.

Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или центрифугатами ставится реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой по вышеописанной методике с предварительной активизацией фильтров.

Обнаружение ботулинических микробов в пищевых продуктах проводится по методике, изложенной в разделе по исследованию материалов от больных. Во флаконы с питательной средой засевают 5-10 мл растертого с физиологическим раствором или дистиллированной водой испытуемого материала.

Выделение чистой культуры

Посев на высокий столбик агара. Для посева применяется прозрачный одно- или полуторапроцентный агар с глюкозой, приготовленный на мартеновском бульоне, бульоне Хоттингера или пепсин-пептоне, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15-18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45-60°. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал и переносят последовательно из пробирки в пробирку, после чего агар тщательно перемешивается путем перекатывания пробирок между ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35-37°. На каждый посев следует брать 5-8 пробирок столбика агара. Если в первичной культуре рост не очень обильный, при пересеве на высокий столбик пастеровскую пипетку следует обломать и набрать немного культуры в капилляр, а затем проводить посев, как указано выше.

Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5-10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80° 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.

Через 1-2 суток в последних пробирках проявляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии перевиваются на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшаяся часть колонии микроскопируется.

Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами:

1. Столбик агара прокалывается сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекается нужная колония.

2. Дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревается на пламени горелки; под действием паров закипавшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительная колония извлекается отломанным капилляром пастеровской пипетки.

Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.

Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного печеночного агара, разлитого тонким слоем в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2-3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат (различных марок) крышкой кверху и выращивают при температуре 35-37°.

Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении Cl. botulinum типа Е из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на слабой чувствительности спор палочки ботулизма типа Е к 50% спирту.

К 2 мл культуральной жидкости 2-3-дневной инкубации при 28°, содержащей ботулинический токсин типа Е, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2-3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток, одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50° агара). Через 48 часов инкубации при 35° в анаэростате среди колоний посторонней микрофлоры Cl. botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Правда, некоторые спорогенные анаэробы (Cl. sporogenes и др.) дают вокруг колоний также «жемчужный пояс». Эти колонии высевают на пробирки со средой типа Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры Cl. botulium типа Е. С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1-0,2 см, окруженных зоной гемолиза.

При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов

Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп МБС-1. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.

С поверхности чашки колонии снимаются петлей или пастеровской пипеткой и засеваются на пробирки с бульоном с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяются на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем титрования и постановки реакции нейтрализации на мышах.

В дальнейшем изучаются протеолитические и биохимические свойства путем посева на желатину и углеводы.

Метод активации протоксина Cl. botulinum

Культуры Cl. botulinum типа Е и некоторые штаммы типов В и F вырабатывают протоксин, который сам по себе является нетоксичным для животных при внутривенном и подкожном введении.

Поэтому для обнаружения протоксина применяют метод активации с помощью протеолитических ферментов — трипсина или панкреатина, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.

Способ приготовления протеолитических ферментов. Чистый сухой трипсин растворяется перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1 : 100 (1% раствор); этот раствор принимается за исходный. Для активации берется данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.

Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовится следующим образом: 4 г панкреатина растворяется в 100 мл физиологического раствора и оставляется в холодильнике при 4° в течение ночи.

Перед употреблением полученная жидкость фильтруется через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластину фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости

Готовый раствор в объеме 0,5 мл не должен убивать белую мышь весам 17-18 г при внутривенном введении. При внутрикожном введении морским свинкам 0,2 мл раствора обычно появляется некроз участка кожи (0,5 X 0,5 см)

Активность приготовленного раствора панкреатина следует предварительно проверить по отношению к известному музейному штамму Cl. botulinum типа Е. Готовый раствор пакреатина может сохраняться при 4° в течение 2 недель.

Активация прототоксина Cl. botulinum

Исследуемая 4-5-суточная культура Cl. botulinum полученная на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергается центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.

Готовый раствор трипсина добавляется из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1% (на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1% раствора трипсина).

Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральная жидкость смешивается в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.

Полученные смеси помещают в термостат при 37° на один час. По истечении указанного срока активированную жидкость титруют на белых мышах путем внутривенного введения с постановкой реакции нейтрализации.

Аналогичным образом проводится активизация фильтров (центрифугатов) из пищевых продуктов и органов трупов.

Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

источник