Возбудитель — Clostridium botulinum входит в семейство Bacillaceae, род Clostridium.
Материалом для микробиологического исследования являются рвотные массы, промывные воды желудка, кал, кровь, моча, остатки пищевых продуктов. При летальном исходе исследуют содержимое желудка, кишечника, лимфатические узлы, головной и спинной мозг.
Используют методы микробиологической диагностики: бактериологический, биологический (для выявления ботулотоксина в исследуемом материале).
С целью выявления ботулотоксина можно использовать также РОПГА с антительным диагностикумом (эритроциты, сенсибилизированные антитоксинами соответствующих типов) и определение активности фагоцитов (ботулинический токсин способен подавлять активность фагоцитов, которая восстанавливается в присутствии соответствующей антитоксической сыворотки).
Бактериологический метод. Исследуемый материал растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором хлорида натрия.
Посев материала выполняют на специальные питательные среды, например, среду Китта-Тароцци.
Одну пробу засевают в 4 пробирки, две из которых прогревают при температуре 60°С 15 мин. (для селекции C. botulinum типа Е), а остальные — при температуре 80°С 20 мин. Накопление культур клостридий типа Е и F происходит при температуре 28°С, типа А, В, С — при 35°С в течение 48 часов.
Через 24-48 часов выдержки посевов в термостате отмечают характер роста на среде Китта-Тароцци: помутнение, газообразование. Готовят мазки, окрашивают по Граму. В случае выявления типичных клостридий с терминально расположенными спорами овальной формы в виде «теннисной ракетки» делают пересев на кровяной сахарный агар для получения отдельных колоний и выделения чистой культуры.
Для идентификации чистой культуры возбудителя определяют сахаролитические и протеолитические свойства. Антигенные свойства изучают в реакции агглютинации с типовыми сыворотками. Одновременно с изучением ферментативных свойств возбудителя выявляют ботулотоксин в фильтрате бульонной культуры и определяют его тип в реакции нейтрализации.
Биологический метод. Выявление ботулотоксина и определение его типа с помощью реакции нейтрализации имеет важное значение для назначения специфической терапии.
Для проведения реакции нейтрализации используют сухие диагностические антитоксические сыворотки типов А, В, С, Е, F, которые разводят физиологическим раствором до 100-200 МЕ / мл, что обеспечивает нейтрализацию гомологичного токсина в исследуемой пробе.
Реакцию нейтрализации проводят либо со смесью сывороток (предварительная реакция), либо с моновалентными сыворотками для определения типа токсина.
Сахаролитические и протеолитические свойства Clostridium botulinum типов А, В, С, D, Е, F
КГ — образование кислоты и газа
(КГ) — кислота и газ не у всех штаммов
+ — разжижение или пептонизация, положительная реакция
Подготовленный для исследования материал (в виде фильтрата, центрифугата или крови) разливают по 1 мл в 6 пробирок. В первые пять пробирок добавляют по 1 мл противоботулинической сыворотки типов А, В, С, Е, F соответственно, а в последнюю — 1 мл нормальной сыворотки. Пробирки инкубируют в термостате в течение 30 мин. Через 30 мин. шести парам белых мышей вводят по 1 мл смеси из каждой пробирки (кровь — внутрибрюшинно, а другие материалы — подкожно). Заболевание характеризуется появлением учащенного дыхания, расслаблением мышц брюшной стенки («осиная талия»), судорогами, параличом, смертью животного. Мыши, которым был введен центрифугат с противоботулинической сывороткой, остаются живыми.
Если в исследуемом материале есть ботулинический токсин, выживает только одна пара мышей, у которых произошла нейтрализация ботулинического токсина антитоксической сывороткой соответствующего типа.
Определение фагоцитарного показателя. Ботулинический токсин подавляет фагоцитарную активность лейкоцитов. Это свойство используют для выявления его в крови больных и в пищевых продуктах. Исследования проводят следующим образом: кровь больного смешивают в пробирке с 3% раствором цитрата натрия в соотношении 2:1. Опыт выполняют в двух пробирках с использованием поливалентной противоботулинической сыворотки. Если используют типовые сыворотки А, В, С, Е, F, соответственно, количество пробирок для исследования увеличивается. После смешивания взятых ингредиентов, пробирки помещают в термостат на 30 минут для нейтрализации токсина. В пробирки вносят по одному объему 2 млрд. суспензии Staphylococcus aureus и снова помещают в термостат на 20 минут для завершения фагоцитоза. После этого из содержимого каждой пробирки готовят мазок, фиксируют, окрашивают азурэозином и определяют фагоцитарный показатель (фагоцитарный показатель — количество стафилококков, поглощенных в среднем одним лейкоцитом. Для его определения подсчитывают микроорганизмы в 50 лейкоцитах и полученное число делят на 50.
Если в крови больного содержится ботулинический токсин, фагоцитарный показатель крови будет низким, за исключением фагоцитарного показателя той порции, в которой тип токсина соответствует типу добавленной в нее сыворотки, то есть произойдет реакция нейтрализации токсина соответствующими антителами, и фагоцитарный показатель будет значительно выше.
РОПГА с антительным эритроцитарным диагностикумом.
Сущность реакции заключается в том, что эритроциты сенсибилизируются специфическими антителами, и гемагглютинация происходит при наличии в исследуемом материале антигена. Ее высокая чувствительность и специфичность позволяет найти в исследуемом материале микро количество токсинов. Диагностический титр 1:10.
источник
Глава VI
Лабораторная диагностика ботулизма
Лабораторная диагностика преследует цель обнаружить ботулинический токсин или возбудителя ботулизма в материалах, взятых от больного (кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, кал и др.) или в органах из трупа (печень, желудок и кишечник с содержимым), а также в пищевых продуктах, которые вызвали отравление. При этом важно установить не только присутствие токсина или микроба, но и определить их тип, чтобы подтвердить клинический диагноз, назначить правильное лечение.
Быстрая и точная лабораторная диагностика ботулизма важна для начала раннего специфического лечения, для профилактики ботулизма у лиц, употреблявших продукты, которые вызвали отравление, а также для изучения эпидемиологии ботулизма. Чем быстрее при лабораторных наследовалиях крови, выделений больных и пищевых продуктов, послуживших причиной отравления, будет обнаружен ботулинический токсин и определен его тип, тем раньше больному будет введена типоспецифическая противоботулиническая сыворотка.
Материал для исследования, отбор проб
Во всех случаях заболевания с симптомами, характерными для ботулизма, исследуют промывные воды желудка, рвотные массы, кал и кровь.
Кровь от больного необходимо брать до введения ему лечебной сыворотки в количестве 6-8 мл из вены в стерильную пробирку. Для лучшего формирования сгустка кровь нужно обвести по стенкам пробирки капилляром пастеровской пипетки, после чего выдержать в термостате 20 минут. Кровь можно брать также с 4% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 3 : 1.
Промывные воды желудка берутся в объеме 50-100 мл, а кал — в количестве 50-60 г в стеклянные банки, закрывающиеся резиновыми или корковыми пробками; консервирующие вещества добавлять нельзя. На банки с пробками наклеиваются этикетки: какой материал посылается, от кого взят и дата взятия материала. Банки при транспортировке должны быть тщательно упакованы. В сопроводительном документе необходимо указать фамилию, имя, отчество и возраст пострадавшего, дату заболевания, предполагаемый диагноз, кратко клинические симптомы, дату взятия пробы и подпись лица, направляющего материал.
Материал, подлежащий исследованию, должен храниться на холоде, так как ботулинический токсин частично разрушается при комнатной температуре.
Из трупов на исследование необходимо брать кусочек печени весом 50-60 г, обрезки тонкого кишечника и желудка с содержимым, кровь (8-10 мл). Пробы из органов берут в стерильных условиях: поверхность органа прижигается раскаленным шпателем и затем стерильными ножницами из глубины вырезается кусочек органа. Пробы из каждого органа берутся в отдельные банки, закрытые пробками или крышками.
Сырье и готовую продукцию на предприятиях консервной промышленности проверяют на наличие возбудителей ботулизма согласно действующей «Инструкции о порядке санитарно-технического контроля производства консервов», утвержденной Министерством здравоохранения СССР от 28 ноября 1963 г. N 456-63.
Лабораторно проверяются на содержание возбудителя и токсина ботулизма также продукты, остатки продукта после употребления при всех случаях пищевых отравлений с симптомами, напоминающими ботулизм, даже при легких формах клинического течения, а также при всех случаях тяжелых пищевых отравлений наряду с исследованиями на сальмонеллы, стафилококки и группу Cl. perfringens.
Следует иметь в виду, что пищевые продукты, вызвавшие отравление и зараженные возбудителем ботулизма, часто бывают не изменены по виду, запаху и вкусу. Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла. Банки с консервами могут быть вздуты («бомбаж»).
Материал для исследования берется с соблюдением условий стерильности в стеклянную посуду и закрывается плотно пригнанными стеклянными, резиновыми, корковыми или завинчивающимися пробками. Твердые объекты могут пересылаться завернутыми в несколько слоев вощаной или пергаментной бумаги.
При отсутствии стерильной посуды образцы отбирают в любые банки после предварительного 15-минутного кипячения их. Материал для исследования берут в количестве не менее 100 г. По возможности следует брать несколько проб из различных мест.
При невозможности отбора образцов в рекомендованных количествах выемка проб может производиться и в меньших количествах. К взятым пробам нельзя добавлять консервирующие вещества.
На пробы наклеивают этикетки, пробы нумеруют, опечатывают и тщательно упаковывают. Пересылка проб должна производиться в кратчайший срок и материал до исследования должен сохраняться на холоде.
Пробы, поступившие в лабораторию, исследуются одновременно по двум направлениям: производится обнаружение ботулинических токсинов и выделение ботулинических микробов. Одновременно эти же пробы должны исследоваться на группу Cl. perfringens.
Обнаружение ботулинических токсинов
Промывные воды желудка при наличии в них комочков пищи растираются в стерильной ступке. Две трети этой растертой пробы предназначаются для обнаружения ботулинических токсинов, одна треть — для выделения ботулинических микробов.
Первую часть растертой пробы выдерживают при комнатной температуре 1-1 1/2 часа для экстрагирования. Затем экстрат фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 оборотах в минуту (об/мин) в течение 15-20 минут. Полученный фильтрат или центрифугат используется для постановки реакции нейтрализации.
Цитратная кровь или сыворотка крови больного без предварительного разведения исследуется на наличие ботулинических токсинов с помощью реакции нейтрализации, причем цитратную кровь можно вводить мышам только внутрибрюшинно.
Для обнаружения токсинов в испражнениях больного кал берется в количестве 10-15 г, растирается в стерильной ступке с двойным объемом физиологического раствора и выдерживается при комнатной температуре в течение 1-1 1/2 часов для экстрагирования токсинов. Затем жидкость фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется и используется для постановки реакции нейтрализации. Экстраты из органов трупа приготовляются аналогично.
Для обнаружения токсина следует взять 4 мышей весом 16-18 г. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один из известных типов ботулинических токсинов, то предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типов А, В, С, Е, F.
Двум мышам вводится исследуемый фильтрат или центрифугат в количестве 0,5-0,8 мл. внутрибрюшинно или внутривенно в хвостовую вену (внутривенно вводится только центрифугат). Другой паре вводится смесь, состоящая из 0,5-0,8 мл испытуемого материала и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулических сывороток типов А, В, С, Е, F (по 0,04 мл сыворотки каждого типа). С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах:
Доза сыворотки, которая рекомендуется для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологического токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также экстрактах из пищевых продуктов очень сильные токсины почти не встречаются.
Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.
Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживается при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество исследуемого материала, вводимого животным с сывороткой и без сыворотки, должно быть одинаковым. Наблюдение за животными ведется в течение 4 дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставится реакция нейтрализации с моновалентными сыворотками.
Следует помнить, что ботулинический токсин не дает молниеносной гибели (в течение нескольких минут или секунд).
При наличии ботулинического токсина погибают две мыши, которым вводился не смешанный с сыворотками фильтрат, остальные остаются живы.
Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западение мышц брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.
В случае гибели всех 4 мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).
Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250-300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток А, В, С, Е, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или центрифугата), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.
В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставится развернутая реакция нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифичесиими диагностическими сыворотками. В 6 пробирок разливают по 2, 4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа А, во вторую — типа В, в третью — типа С, в четвертую- типа Е, в пятую — типа F и в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или вдутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки (см. типовой протокол).
Для каждой сыворотки берется отдельный шприц. Учет результатов проводится через 4-6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4 дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологической сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.
Типовой протокол постановки развернутой реакции нейтрализации
Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки N 1, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа А.
Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как обычно ее бывает мало. Следует тщательно отделить сыворотку от сгустка крови (сгусток крови необходимо посеять, так как при ботулизме можно обнаружить в крови палочку ботулизма) и с сывороткой поставить реакцию нейтрализации. В этом случае можно сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками типов А, В, Е (остальные типы ботулизма встречаются очень редко). Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа А — 0,4 мл, во вторую — типа В, в третью — типа Е. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного; контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.
При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дается заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывается его тип.
В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа Е в известной мере нейтрализует и ботулинический токсин типа F. При получении положительной реакции с противоботулинической сывороткой типа Е следует дополнительно провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу Е или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа Е и типа F. Для этого в три пробирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа Е, во вторую — 0,6 мл типа F, в третью, контрольную — 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа Е, то в экстракте имеется токсин типа F, если же погибают наряду с контролем и мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой Е, то в экстракте токсин типа Е.
Обнаружение возбудителей ботулизма
Для обнаружения возбудителей ботулизма производится посев на жидкие питательные среды. Для первичных посевов лучше использовать казеиново-грибную среду, бульон Хоттингера или пепсин-пептонный бульон с 0,5% глюкозы (см. среды для анаэробов)*(4). Необходимо, чтобы рН был в пределах 7,2-7,4. Обязательным является также наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиново-грибной среде — отварного пшена и ваты.
Для выделения возбудителей ботулизма наиболее подходящей средой является мясная среда типа Тароцци. На казеиново-грибной среде все типы возбудителей ботулизма также дают хороший рост и продуцируют токсины значительной силы.
Посевы должны производиться в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100-200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см. Следует особенно помнить о том, что засевать исходный посевной материал следует в большой объем среды (70,0-150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватило на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нетрализации, нередко с двух или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, по-видимому, из-за бурного роста посторонней микрофлоры. Посев следует производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60° 15 минут (в этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры Cl. botulinum типа Е, которые погибают при 80°), другой прогревают при 80° 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60°, инкубируют при 28°, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35-37°. Последние два флакона исследуют на Cl. botulinum типов А, В, С.
Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образам, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. После посева все исходные образцы проб следует сохранять на леднике до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.
В настоящее время есть сообщение зарубежных ученых о том, что для выявления Cl. botulinum типа Е в среду следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления возбудителя ботулизма типа Е из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положительный результат лишь в 17% проб
Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15-20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавлять во флаконы, которые будут инкубироваться при 28°, из расчета 1 мл 1% раствора трипсина на 10 мл среды после прогрева при 60° 15 минут.
Рост возбудителя ботулизма характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. Стерильно взятые из таких флаконов пробы (10-15 мл) подвергаются исследованию. Прежде всего готовят мазки, красят их по Граму или краской для анаэробов и микроскопируют.
С культуральной жидкостью ставится реакция нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов А, В, С, Е и F. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжать инкубацию в термостате, а исследование повторить на 4-6-10-е сутки. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum, а также ботулинического токсина дается заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.
Если же в посевах обнаруживаются микробы, по морфологии сходные с Cl. botulinum, а токсин отсутствует, следует провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином по описанной ниже методике для обнаружения ботулинического токсина, а также провести выделение и изучение чистой культуры. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулинической сывороткой проводят только в том случае, если в среду перед высевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.
Исследование пищевого продукта
Исследуемый продукт в количестве 25-30 г тщательно растирается в стерильной ступке с физиологическим раствором или с дистиллированной водой в том случае, если продукт соленый (материал легче растирается в присутствии стерильного кварцевого песка). В зависимости от характера (плотности) продукта берется равное или двойное количество физиологического раствора или дистиллированной воды по отношению к весу пробы.
Из растертой пробы 2/3 объема используется для обнаружения ботулинических токсинов и 1/3 — для выделения возбудителей ботулизма.
Та часть пробы, которая исследуется на наличие токсинов, выдерживается в течение 1 — 1 1/2 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется при 2500-3000 об/мин в течение 15-20 минут. Фильтрование через тальковый фильтр недопустимо, так как тальк адсорбирует на себе ботулинические токсины.
Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или центрифугатами ставится реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой по вышеописанной методике с предварительной активизацией фильтров.
Обнаружение ботулинических микробов в пищевых продуктах проводится по методике, изложенной в разделе по исследованию материалов от больных. Во флаконы с питательной средой засевают 5-10 мл растертого с физиологическим раствором или дистиллированной водой испытуемого материала.
Выделение чистой культуры
Посев на высокий столбик агара. Для посева применяется прозрачный одно- или полуторапроцентный агар с глюкозой, приготовленный на мартеновском бульоне, бульоне Хоттингера или пепсин-пептоне, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15-18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45-60°. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал и переносят последовательно из пробирки в пробирку, после чего агар тщательно перемешивается путем перекатывания пробирок между ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35-37°. На каждый посев следует брать 5-8 пробирок столбика агара. Если в первичной культуре рост не очень обильный, при пересеве на высокий столбик пастеровскую пипетку следует обломать и набрать немного культуры в капилляр, а затем проводить посев, как указано выше.
Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5-10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80° 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.
Через 1-2 суток в последних пробирках проявляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии перевиваются на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшаяся часть колонии микроскопируется.
Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами:
1. Столбик агара прокалывается сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекается нужная колония.
2. Дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревается на пламени горелки; под действием паров закипавшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительная колония извлекается отломанным капилляром пастеровской пипетки.
Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.
Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного печеночного агара, разлитого тонким слоем в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2-3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат (различных марок) крышкой кверху и выращивают при температуре 35-37°.
Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении Cl. botulinum типа Е из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на слабой чувствительности спор палочки ботулизма типа Е к 50% спирту.
К 2 мл культуральной жидкости 2-3-дневной инкубации при 28°, содержащей ботулинический токсин типа Е, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2-3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток, одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50° агара). Через 48 часов инкубации при 35° в анаэростате среди колоний посторонней микрофлоры Cl. botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Правда, некоторые спорогенные анаэробы (Cl. sporogenes и др.) дают вокруг колоний также «жемчужный пояс». Эти колонии высевают на пробирки со средой типа Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры Cl. botulium типа Е. С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1-0,2 см, окруженных зоной гемолиза.
При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов
Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп МБС-1. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.
С поверхности чашки колонии снимаются петлей или пастеровской пипеткой и засеваются на пробирки с бульоном с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяются на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем титрования и постановки реакции нейтрализации на мышах.
В дальнейшем изучаются протеолитические и биохимические свойства путем посева на желатину и углеводы.
Метод активации протоксина Cl. botulinum
Культуры Cl. botulinum типа Е и некоторые штаммы типов В и F вырабатывают протоксин, который сам по себе является нетоксичным для животных при внутривенном и подкожном введении.
Поэтому для обнаружения протоксина применяют метод активации с помощью протеолитических ферментов — трипсина или панкреатина, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.
Способ приготовления протеолитических ферментов. Чистый сухой трипсин растворяется перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1 : 100 (1% раствор); этот раствор принимается за исходный. Для активации берется данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.
Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовится следующим образом: 4 г панкреатина растворяется в 100 мл физиологического раствора и оставляется в холодильнике при 4° в течение ночи.
Перед употреблением полученная жидкость фильтруется через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластину фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости
Готовый раствор в объеме 0,5 мл не должен убивать белую мышь весам 17-18 г при внутривенном введении. При внутрикожном введении морским свинкам 0,2 мл раствора обычно появляется некроз участка кожи (0,5 X 0,5 см)
Активность приготовленного раствора панкреатина следует предварительно проверить по отношению к известному музейному штамму Cl. botulinum типа Е. Готовый раствор пакреатина может сохраняться при 4° в течение 2 недель.
Активация прототоксина Cl. botulinum
Исследуемая 4-5-суточная культура Cl. botulinum полученная на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергается центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.
Готовый раствор трипсина добавляется из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1% (на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1% раствора трипсина).
Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральная жидкость смешивается в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.
Полученные смеси помещают в термостат при 37° на один час. По истечении указанного срока активированную жидкость титруют на белых мышах путем внутривенного введения с постановкой реакции нейтрализации.
Аналогичным образом проводится активизация фильтров (центрифугатов) из пищевых продуктов и органов трупов.
Откройте актуальную версию документа прямо сейчас или получите полный доступ к системе ГАРАНТ на 3 дня бесплатно!
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
источник
Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!
Диагностика ботулизма должна быть комплексной и включать как объективные данные, так лабораторные методы.
Методами диагностики ботулизма являются:
- сбор анамнеза и объективных данных;
- микробиологическая диагностика.
Сбор анамнестических данных (истории болезни) играет немаловажную роль в постановке диагноза ботулизма. Важное значение имеет, что и когда ел пациент. Если пациент употреблял консервированные продукты, грибы или рыбу, то необходимо сдать остатки употребленных продуктов на лабораторную диагностику. Также важно знать, как хранилась данная продукция и как употреблялась.
Врач должен выяснить, через какое время после употребления инфицированных продуктов появились первые симптомы. Известно, что инкубационный период (время, проходящее от момента попадания инфекции в организм до появления первых симптомов заболевания) при ботулизме варьирует от нескольких часов до суток. В медицинской литературе также было описано пару случаев, когда этот период затянулся до 2 – 3 дней.
Далее важно знать, каковы были первые симптомы. Был ли период интоксикации и как долго он длился. После сбора анамнеза врач приступает к осмотру больного. Он отмечает выраженную атонию мышц пациента, маскообразное лицо. Из-за дисфонических расстройств пациенту трудно отвечать на вопросы. Голосовые связки к этому моменту становятся сухими, а язык – неповоротливым. Речь становится непонятной и приобретает характер «каши во рту».
При неврологическом осмотре врач отмечает двигательные парезы и параличи. В отличие от других неврологических патологий при ботулизме парезы всегда двухсторонние. Огромное значение в диагностике ботулизма приобретает неврологическая симптоматика, а именно дисфагия и дисфония. Эволюция в изменении голоса, а также многочисленные офтальмологические симптомы играют решающую роль в постановке диагноза.
Данный метод диагностики основывается на выявлении в сыворотке больного (или же в другом биологическом материале) бактерий Clostridium botulinum и их токсинов. Обнаружение ботулотоксина является абсолютным подтверждением диагноза ботулизма.
С этой целью могут использоваться различные реакции, такие как реакция нейтрализации или преципитации в геле.
Материалом для реакции могут служить рвотные массы пациента или смывы с зонда, кровь или остатки пищи. Биологический материал засевают на жидкие питательные среды. Засеянные материалом питательные среды инкубируют при температуре 80 градусов в течение 48 часов. После этого проводят исследование под микроскопом. Так, под микроскопом Clostridium botulinum имеет вид подвижной палочки, напоминающей вид ракетки. Палочка клостридии имеет на своей поверхности от 5 до 20 жгутиков. На поверхности агара (вид питательной среды) эти бактерии образуют мелкие, блестящие, в виде капелек росы колонии. Иногда эти колонии увеличиваются и становятся серого цвета. На кровяном агаре растущие клостридии дают зону гемолиза. В пробирках возбудитель ботулизма растет в виде комочков ваты («колонии пушинок») или образует колонии в форме чечевицы. Если диагноз отрицателен, то анализ культур повторяют через неделю.
Для выявления токсина проводят реакцию нейтрализации с диагностическими сыворотками.
При ботулизме в анализе крови отмечается ряд изменений. В основном они не являются специфическими для ботулизма и больше характеризуют общий интоксикационный процесс.
Параметрами общего анализа крови при ботулизме являются:
- лейкоцитоз – увеличение числа лейкоцитов более 9 x 10 9 ;
- сдвиг лейкоцитарной формулы влево – появление в крови незрелых форм нейтрофилов, например, миелоцитов;
- увеличение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) – более 15 миллиметров в час у женщин, более 10 миллиметров в час у мужчин.
Параметрами биохимического анализа крови при ботулизме являются:
- повышенная концентрация углекислого газа;
- понижение кислотности крови;
- снижение концентрации хлоридов;
- повышенное содержание калия.
Параметрами общего анализа мочи при ботулизме являются:
- суточное выделение мочи менее 300 миллилитров (олигурия) или же менее 50 миллилитров (анурия);
- кислотность мочи понижена.
При первых симптомах данного заболевания необходимо вызвать бригаду скорой помощи. До приезда медицинских сотрудников следует провести ряд мероприятий, направленных на снижение вредоносного влияния попавшего в организм токсина.
На догоспитальном этапе проведение первой помощи предполагает промывание желудка и назначение имеющихся дома сорбентов (чаще всего это активированный уголь).
При выявлении симптомов ботулизма единственной мерой, которая может быть предпринята вне зависимости от обстоятельств, является вызов скорой помощи. При ряде случаев до приезда врача больному можно сделать промывание желудка или дать выпить сорбенты. Все остальные попытки облегчить состояние пациента могут ухудшить ситуацию.
Мерами, которые запрещены при отравлении ботулизмом, являются:
- прием обезболивающих препаратов;
- теплый компресс;
- употребление газированных напитков;
- провокация рвоты при ряде обстоятельств.
Прием обезболивающих препаратов
Естественным желанием многих пациентов является прием обезболивающих, так как характерным для ботулизма симптомом являются сильные боли в животе. Следует принимать к сведению, что употребление таких лекарств не рекомендуется. Отсутствие боли не позволит пациенту точно описать все жалобы, что нарушит клиническую картину заболевания и значительно затруднит постановку диагноза.
Теплый компресс
В целях снижения болевых ощущений в некоторых источниках рекомендуется поставить на живот теплый компресс. От проведения таких мер необходимо отказаться, потому что тепловое воздействие на область живота увеличит кровообращение, в результате чего состояние больного может ухудшиться.
Употребление газированных напитков
Сухость слизистых оболочек является еще одним, свойственным ботулизму, признаком. Утолять жажду можно только чистой питьевой водой без газов. Любые газированные напитки запрещены. Также нельзя пить кофе, чай, бульон.
Провокация рвоты при ряде обстоятельств
Провоцировать рвотный рефлекс можно только тем пациентам, возраст которых превышает 5 лет. Кроме возраста обязательным требованием является пребывание больного в сознании. Если человек находиться в бессознательном состоянии, он может захлебнуться рвотными массами. Запрещается вызывать рвоту людям, которые страдают серьезными болезнями сердца, так как у них может случиться инфаркт.
Лечение ботулизма всегда должно быть комплексным и неотложным. Вне зависимости от дня госпитализации больным проводят интенсивное промывание желудка и детоксикационную терапию. После промывания желудка или обработки раны при раневом ботулизме проводят терапию детоксикации и специфическое лечение противоботулинической сывороткой.
Методами терапии ботулизма являются:
- промывание желудка;
- проведение сифонных клизм;
- первичная обработка раны при раневом ботулизме;
- детоксикация организма;
- назначение противоботулинической сыворотки.
Промывание желудка в условиях больницы проводят гастральным или назогастральным зондом. Зонд представляет собой резиновую трубку длиной от 80 до 150 сантиметров, диаметром от 5 до 13 миллиметров. Промывание проводится теплой (не горячей) водой, которую вливают через воронку в предварительно введенный зонд. В зависимости от состояния пациента используют два вида зонда. Так, если глотание еще не нарушено, используется толстый гастральный зонд. Если же у пациента уже нарушен глотательный рефлекс, то используется тонкий назогастральный зонд.
Промывание желудка при сохраненном глотательном рефлексе
В этом случае используется толстый гастральный зонд диаметром 10 – 13 миллиметров. Для того чтобы вести зонд в желудок, пациенту придают правильное положение — лежа на боку без поднятого изголовья. В тот момент, когда зонд подойдет к ротоглотке, пациент должен сделать глотательное движение. В результате этого зонд заглатывается, проходит вдоль по пищеводу и попадает в желудок. Предварительно конец зонда рекомендуется смазать вазелином, чтоб он не травмировал глотку или пищевод.
Вода вливается поэтапно, чтобы не провоцировать растяжение желудка, по 300 – 500 миллилитров. Когда вода для промывания вливается, воронка держится выше уровня желудка. После вливания она опускается ниже, и все содержимое желудка вместе с влитой водой выливается в приготовленный для промывных вод таз. Первую порцию промывных вод рекомендуется отправить на лабораторную диагностику.
Процедуру рекомендуется повторять до появления чистой промывной воды. Необходимо правильно рассчитать необходимый объем воды. Так, для однократного вливания рекомендуется 5 – 7 миллилитров на килограмм веса (то есть для пациента массой 70 кг, необходимо 350 – 500 миллилитров воды для однократного введения).
Промывание желудка при нарушенном глотательном рефлексе
При нарушенном глотательном рефлексе применяется тонкий назогастральный зонд, который вводится в желудок через нос. Предварительно обработанный вазелином конец зонда вводится через нижний носовой ход, а оттуда через носоглотку в пищевод и желудок. Таким образом, исключается этап самостоятельного глотания зонда. После того как зонд введен в желудок, врач должен убедится, что зонд попал туда, куда нужно. Для этого к концу зонда он присоединяет шприц и тянет его поршень на себя. Если зонд в желудке, в шприц поступает желудочное содержимое. Далее, подсоединив к зонду шприц, врач вводит с его помощью в желудок раствор для промывания. После этого шприц отсоединяют, а содержимое зонда выливают в емкость для промывных вод. Процедуру повторяют до тех пор, пока не появятся чистые промывные воды.
При парезе кишечника, наблюдаемом при ботулизме, рекомендуется проведение сифонных и гипертонических клизм. Они назначаются с целью стимуляции атонического кишечника. Принцип проведения сифонной клизмы является такой же, как и при проведении других клизм. Разницей является то, что при проведении сифонной клизмы используется гораздо большее количество воды. Так, в среднем расходуется от 10 до 15 литров воды. Также наконечник обычной клизмы вводится в прямую кишку на расстояние 10 сантиметров, в то время как сифонная трубка вводится на глубину 20 – 30 сантиметров. Поэтому сифонные клизмы называются еще высокими очистительными клизмами.
При ботулизме назначаются также клизмы с прозерином. Прозерин – это вещество, которое приводит к накоплению ацетилхолина и восстановлению нервно-мышечной передачи. Поскольку при ботулизме эта передача блокирована, то необходимо ее восстанавливать. Поэтому этот препарат назначается как системно (в виде уколов и таблеток), так и используется при проведении клизм.
Основная цель в лечении ботулизма — это максимально быстрое выведение токсинов из организма и предупреждение развития дыхательной недостаточности. С целью детоксикации назначается внутривенное вливание энтеросорбентов (веществ, которые адсорбируют токсины) одновременно со стимуляцией диуреза (мочевыведения).
Препараты, используемые в лечении ботулизма